Cajal間質(zhì)細胞在慢傳輸型便秘中的作用及番瀉苷A的治療作用

林 強,張靜瑜,秦小金,王景杰*,李 冀

(1空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院消化內(nèi)科,西安 710038;2西安市第六醫(yī)院消化內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:jingjie@fmmu.edu.cn;#共同通訊作者,E-mail:827537844@qq.com)

慢傳輸型便秘(slow transit constipation,STC)是由于結(jié)腸功能紊亂、傳導功能失常造成的排便困難、排便時間延長,常見癥狀以大便干燥、排便次數(shù)減少、腹脹等。STC患者就診人數(shù)逐漸增多,發(fā)病率逐年上升,嚴重影響人們生活質(zhì)量[1]。目前治療慢傳輸型便秘經(jīng)常使用的藥物為促胃腸動力藥物,中藥在慢傳輸型便秘的治療作用和藥理機制是臨床和基礎(chǔ)研究的一個重要的方向。番瀉葉是尖葉番瀉或狹葉番瀉的干燥小葉[2],其性味甘、苦、寒,歸大腸經(jīng),具有瀉熱行滯,利腸腑,通大便之功效[3],有明確的促胃腸動力作用,是臨床應用最廣泛的導瀉藥之一。大量的臨床實踐發(fā)現(xiàn),番瀉葉可促胃腸蠕動,對胃腸道動力障礙性疾病的治療效果顯著[4-6]。番瀉苷A是番瀉葉的有效成分之一[6-8],但是關(guān)于番瀉苷A在STC中的作用及其機制目前研究尚不明確。

目前研究認為,STC的病因及發(fā)病機制與腸道動力異常密切相關(guān)[9]。在胃腸道中,廣泛分布Cajal間質(zhì)細胞(ICC),它是胃腸道平滑肌慢波的發(fā)起者和傳播者,被視為胃腸動力的起搏細胞[10]。我們前期研究結(jié)果表明,ICC表面的超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels 1,HCN1)是其節(jié)律電活動的始發(fā)離子通道[11,12],目前尚不清楚ICC以及HCN1蛋白在慢傳輸型便秘形成中的作用。

我們課題組根據(jù)目前國內(nèi)外研究基礎(chǔ),提出如下假說:Cajal間質(zhì)細胞數(shù)目減少以及功能蛋白HCN1異常在慢傳輸型便秘發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,而番瀉苷很有用可能通過激活I(lǐng)CC細胞膜上的HCN1通道蛋白促進腸動力,進而改善慢傳輸型便秘的臨床癥狀。針對以上的假說,本研究擬在成功制作STC動物模型基礎(chǔ)上,采用免疫組織化學、藥理學等方法研究ICC及其功能蛋白HCN1在慢傳輸型便秘形成過程中的作用及其機制,同時研究番瀉苷A在慢傳輸型便秘中的藥理作用以及藥理機制,為進一步闡明慢傳輸型便秘發(fā)病機制以及后續(xù)研究番瀉葉治療STC奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

7周齡SD大鼠30只,SPF級,雌雄各半,體質(zhì)量(220±30)g,由空軍軍醫(yī)大學動物實驗中心提供(生產(chǎn)許可證號:SYXK(軍)-2012-0023,動物合格證號SCXK(軍)-2012-0007)。將SD大鼠30只隨機分為正常組、模型組、ZD7288+番瀉苷A組、番瀉苷A組和莫沙必利組,每組6只;除正常組外,其余各組采用冰水灌胃法,灌胃給予大鼠0-4 ℃生理鹽水2 ml/只，1次/d，14 d，建立慢傳輸型便秘大鼠模型。

1.2 主要試劑、儀器

番瀉苷A由陜西中醫(yī)藥大學藥物研究所提供,根據(jù)《中華人民共和國藥典》(一部)[3]計算番瀉苷A大鼠與人體等效劑量。ZD7288(HCN1阻斷劑)為美國Abcam公司產(chǎn)品;山羊抗兔FITCt購自美國Sigma公司;驢抗鼠Texas-red購自美國Molecular Probes公司;兔抗c-kit多克隆抗體購自美國Sigma公司;鼠抗HCN1單克隆抗體購自美國Sigma公司。FV1000激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司);恒冷箱切片機(德國Leica公司);多導生理記錄儀RM6280B(成都儀器廠)。

1.3 胃腸道組織標本制備

腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠,先給予靜滴生理鹽水100 ml。隨后用溫度為4 ℃、濃度為40 g/L多聚甲醛磷酸鹽(0.1 mol/L)緩沖液500 ml(PB,pH7.4),經(jīng)靜脈先快后慢灌流約2 h,將固定好的結(jié)腸組織置于25%蔗糖溶液,4 ℃浸泡過夜，待組織沉底后，恒冷箱切片機上連續(xù)切片，切片厚12 μm，風干，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫熒光雙標染色檢測結(jié)腸c-kit陽性細胞數(shù)目和HCN1蛋白表達情況

將制備好的腸道組織冰凍切片或者全層鋪片用含1% BSA+0.3%Triton的PBS液封閉1 h，入一抗(HCN1抗體按1 ∶500稀釋，c-kit按1 ∶1 000稀釋，GFAP抗體按1 ∶500稀釋)。一抗孵育12 h(4 ℃)。經(jīng)PBS漂洗后入二抗(羊抗兔FITC二抗，驢抗鼠Texas-red二抗均按1 ∶500稀釋)室溫孵育2 h，DAPI襯核。PBS漂洗，50%緩沖甘油封片，鏡下觀察組織。

1.5 大鼠結(jié)腸推進速度測定

實驗前30 min,正常組和模型組均給予生理鹽水灌胃,番瀉苷A組給予1.0 mg/ml番瀉苷A灌胃,ZD7288+番瀉苷A組大鼠尾靜脈給予0.5 ml HCN1的特異性阻斷劑ZD7288(0.5 mmol/L)同時灌胃給予1.0 mg/ml番瀉苷A干預,莫沙比利組給予灌胃給予0.05 mg/ml莫沙比利;以上各組均灌服同體積液體(0.1 ml/100 g)。各組大鼠用30%水合氯醛麻醉,待麻醉成功后,將直徑3 mm玻璃小球用細的塑料軟管推入距肛門3 cm直腸處?；\內(nèi)墊清潔濾紙,待大鼠蘇醒后迅速移至籠內(nèi)喂食飲水,并開始計時,記錄直腸內(nèi)玻璃小球排出的時間。

1.6 結(jié)腸離體肌條制備

將20只SD大鼠在室溫(20±2)℃的環(huán)境中飼養(yǎng)，其中15只SD大鼠給予0-4 ℃生理鹽水2 ml灌胃，每日1次，共14 d，建立慢傳輸型便秘大鼠模型，隨機分成正常組、模型組、番瀉苷A組、ZD7288+番瀉苷A組，每組各5只。將大鼠脫頸椎處死，從腹部正中剖開腹腔，取結(jié)腸，在距離肛門約5 cm處截取一段結(jié)腸，長4-5 cm，放入盛有4 ℃ Krebs液的培養(yǎng)皿中，持續(xù)通入5%二氧化碳和95%氧氣的混合氣體，保持標本活性；用濕棉簽擦破結(jié)腸系膜，用眼科鑷剔除漿膜，沿結(jié)腸系膜縱行剪開腸腔，用Krebs液洗凈結(jié)腸內(nèi)容物，將腸管黏膜層朝上鋪平固定在硅膠板上，用眼科鑷和玻棒剝除黏膜層及黏膜下層組織，觀察結(jié)腸環(huán)行肌走行，將兩個刀片固定刀片架上，刀片之間距離設(shè)定為3 mm，沿結(jié)腸環(huán)行肌走行方向切取3 mm×8 mm的肌條，再沿著縱行平滑肌纖維的方向切取3 mm×8 mm的肌條。

1.7 離體結(jié)腸肌條收縮頻率和幅度測定

將制備好的環(huán)行肌肌條、縱行肌肌條標本移入持續(xù)通以95%氧氣和5%二氧化碳混合氣體,盛有37 ℃ Krebs液中的恒溫肌槽中,含鈣Krebs液:NaCl 6.75 g/L,CaCl20.28 g/L,KCl 0.344 g/L,NaHCO31.84 g/L,MgSO47 g/L,NaPO40.18 g/L,H2O 0.28 g/L,葡萄糖2.0 g/L,維持pH值于7.3-7.5;在肌條兩端分別用醫(yī)用絲線扎牢,一端固定在平滑肌槽下端的彎鉤,另一端固定于張力換能器,在前負荷為1.0 g狀態(tài)下,孵育肌條1 h,每15 min更換新鮮Krebs液1次,待肌條自發(fā)收縮活動平穩(wěn)后,通過多導生理記錄儀,記錄縱行肌肌條和環(huán)行肌肌條的收縮振幅和頻率,描記活動曲線3-5 min。番瀉苷A組給藥的方法,先給予番瀉苷A(1.0 mg/ml)0.5 ml,觀察肌條收縮振幅和頻率,描記給藥后肌條活動曲線3-5 min;ZD7288+番瀉苷A組給藥的方法,加入HCN1阻斷劑ZD7288(0.5 mmol/L)0.5 ml,觀察肌條收縮和頻率,同時記錄給藥后肌條活動曲線3-5 min,5 min后加入番瀉苷A(1.0 mg/ml)0.5 ml,再次觀察肌條收縮和頻率,并描記給藥后肌條活動曲線。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 慢傳輸型便秘大鼠胃腸道c-kit陽性細胞ICC數(shù)目和HCN1蛋白表達的變化

免疫組織化學熒光雙標染色結(jié)果顯示,在慢傳輸型便秘大鼠胃腸道中,c-kit免疫熒光強度及光密度值與對照組相比均顯著下降,即c-kit陽性ICC細胞數(shù)目顯著減少(P<0.05,見圖1,2);同樣,在慢傳輸型便秘大鼠胃腸道中HCN1免疫熒光密度值和對照組相比亦均顯著下降,即HCN1蛋白表達水平顯著下降(P<0.05,見圖1,2)。

2.2 在體阻斷離子通道HCN1對番瀉苷A促結(jié)腸蠕動作用的影響

特異性阻斷HCN1通道蛋白,觀察HCN1被阻斷劑阻斷后番瀉苷A對結(jié)腸蠕動的影響。實驗結(jié)果顯示:模型組結(jié)腸推進速率低于正常組(P<0.05);番瀉苷A組和莫沙比利組結(jié)腸推進速率明顯高于模型組(P<0.05),而ZD7288+番瀉苷A組結(jié)腸推進率和模型組相比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05,見圖3)。同時,番瀉苷A組結(jié)腸推進速率略高于莫沙必利組(P<0.05),即番瀉苷A促結(jié)腸動力效果優(yōu)于莫沙必利；而ZD7288+番瀉苷A組結(jié)腸推進率顯著低于番瀉苷A組(P<0.05，見圖3)。

圖1 大鼠近端結(jié)腸c-kit陽性細胞數(shù)目和HCN1蛋白表達變化情況Figure 1 The number of c-kit positive ICC and the expression of HCN1 in the proximal colon of rats

與正常組比較,*P<0.05圖2 兩組大鼠近端結(jié)腸c-kit陽性細胞密度和HCN1蛋白表達水平比較Figure 2 Comparison of the density of c-kit positive ICC and expression of HCN1 in the proximal colon of rats between normal group and model group

2.3 番瀉苷A和ZD7288干預對結(jié)腸縱行平滑肌肌條收縮情況的影響

模型組慢傳輸型便秘模型大鼠結(jié)腸縱行肌收縮幅度和頻率明顯小于正常組大鼠結(jié)腸縱行肌收縮幅度和頻率(P<0.05);番瀉苷A組與模型組相比,大鼠縱行肌收縮頻率和收縮幅度均明顯升高(P<0.05)。但是ZD7288+番瀉苷A組大鼠結(jié)腸縱行肌收縮頻率和收縮幅度與模型組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖4),即番瀉苷A組促結(jié)腸縱形肌收縮作用可以被HCN1阻斷劑所阻斷。

與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與番瀉苷A組比較,△P<0.05圖3 在體阻斷HCN1對番瀉苷A促結(jié)腸蠕動作用的影響Figure 3 Effect of blocking HCN1 in vivo on the role of sennoside A in promoting colon peristalsis

2.4 番瀉苷A和ZD7288干預結(jié)腸環(huán)行平滑肌肌條收縮情況的影響

模型組慢傳輸型便秘模型大鼠結(jié)腸環(huán)行肌收縮幅度和頻率明顯小于正常組大鼠結(jié)腸環(huán)行肌收縮幅度和頻率(P<0.05)。給予番瀉苷A干預的慢傳輸型便秘模型大鼠環(huán)行肌收縮頻率和收縮幅度與模型組大鼠環(huán)行肌收縮頻率和收縮幅度相比,兩個指標均明顯升高(P<0.05)。但是ZD7288+番瀉苷A組大鼠結(jié)腸環(huán)行肌收縮頻率和收縮幅度與模型組大鼠結(jié)腸環(huán)行肌收縮頻率和收縮幅度差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖5),即番瀉苷A組促結(jié)腸環(huán)形肌收縮作用可以被HCN1阻斷劑所阻斷。

與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與番瀉苷A組比較,△P<0.05圖4 番瀉苷A和ZD7288對大鼠結(jié)腸縱行平滑肌肌條收縮的影響Figure 4 Effect of Sennoside A or ZD7288 on the e spontaneous contractile activity of the longitudinal muscle strip isolated from the colon of the adult rat

與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與番瀉苷A組比較,△P<0.05圖5 番瀉苷A和ZD7288對大鼠結(jié)腸環(huán)行平滑肌肌條收縮的影響Figure 5 Effect of sennoside A or ZD7288 on the spontaneous contractile activity of the circular muscle strip isolated from the colon of the adult rats

3 討論

慢性特發(fā)性便秘(chronic idiopathic constipation,CIC)已經(jīng)成為最常見的胃腸道疾病之一,全球發(fā)病率為14%[13]。其中慢傳輸型便秘(STC)是慢性特發(fā)性便秘最為常見的一種亞型,約占慢性特發(fā)性便秘患者42%[14]。北京地區(qū)在2001年及2010年兩次對慢性便秘流行病學的調(diào)查結(jié)果顯示,發(fā)病率分別為6.07%和4.1%,女性多于男性[15,16]。還有廣州、西安、天津、杭州等地也曾進行便秘流行病學調(diào)查,各地的發(fā)病率有很大差異,在3%-17%之間[17-21]。便秘不僅對患者的身心健康造成長期的不良影響,同時也造成了巨大的經(jīng)濟負擔。最近的一項研究表明,平均每年為每位便秘患者提供的醫(yī)療費用為7 522美元[22]。因此,針對慢性特發(fā)性便秘尤其是慢傳輸型便秘的發(fā)病機制和診療策略的研究具有重要的臨床意義。

已經(jīng)有許多研究表明,結(jié)腸動力障礙在慢傳輸型便秘的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[14,23]。在胃腸道平滑肌層中,環(huán)行肌和縱行肌協(xié)調(diào)舒縮是胃腸動力產(chǎn)生的重要基礎(chǔ)。因此,對STC疾病模型結(jié)腸環(huán)、縱行肌運動特征的研究,將有助于我們進一步深入理解STC的發(fā)病機制。本次實驗在體檢測結(jié)腸排珠時間,結(jié)果顯示,與正常大鼠相比,慢傳輸型便秘模型大鼠結(jié)腸傳輸速率均顯著下降;在此基礎(chǔ)上,通過離體肌條實驗探究結(jié)腸環(huán)縱行肌運動特點,結(jié)果顯示,與正常大鼠相比,慢傳輸型便秘模型大鼠結(jié)腸腸道平滑肌收縮幅度和頻率顯著下降。以上研究結(jié)果提示,慢傳輸型便秘之所以發(fā)生,不但其結(jié)腸的舒縮功能下降(主要是環(huán)形肌的作用),而且其推進功能也降低(主要是縱行肌的作用),二者的功能改變,進而導致其協(xié)同性的下降,進一步導致結(jié)腸舒縮和推進的下降,使得結(jié)腸處于一種“無力”的狀態(tài),結(jié)腸運動障礙,水分過度吸收,進而使得大便性狀及在結(jié)腸中被推進的速率均產(chǎn)生了變化,患者表現(xiàn)為排便費力和大便干結(jié)的情況。

不同于骨骼肌,胃腸道平滑肌存在自發(fā)性、節(jié)律性收縮運動,即慢波節(jié)律;慢波是胃腸運動的基本節(jié)律,在胃腸動力形成過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[24]。本次離體肌條實驗結(jié)果顯示,STC模型大鼠結(jié)腸慢波頻率和幅度均下降,這提示慢波節(jié)律的異常是STC形成的重要病理生理機制。但是,導致STC結(jié)腸慢波節(jié)律異常的潛在細胞與分子基礎(chǔ)研究尚不明確。大量研究表明,Cajal間質(zhì)細胞(interstitial cells of Cajal,ICC)作為胃腸道起搏細胞,是胃腸道慢波的發(fā)起與傳播者,它在胃腸道平滑肌收縮節(jié)律、幅度、方向的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[10,24]。Cajal間質(zhì)細胞是廣泛分布于胃腸道肌層一種間質(zhì)細胞,可以被干細胞因子受體c-kit特異性標記[25]。研究表明，化學性損害Cajal間質(zhì)細胞可以導致胃腸慢波節(jié)律明顯異常甚至消失[26]。隨后通過膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn),ICC確實具有自發(fā)性電節(jié)律特點[27]。而且,也有研究報道運用中和性抗體阻斷ICC膜上標記分子c-kit或者基因敲除c-kit,可以導致ICC發(fā)育缺陷,同時導致胃腸道慢波形成障礙[28]。Cajal間質(zhì)細胞在胃食管反流病、胃輕癱等胃腸動力障礙性疾病中均具有重要作用[29,30],但是ICC在慢傳輸型便秘中的作用研究尚不是很明確。為了進一步研究Cajal間質(zhì)細胞在慢傳輸型便秘發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其機制,我們采用免疫熒光染色觀察胃腸道ICC形態(tài)變化。實驗結(jié)果顯示,慢傳輸型便秘模型大鼠結(jié)腸c-kit陽性的ICC數(shù)目顯著減少,同時HCN1蛋白表達也下調(diào)。HCN1通道蛋白在具有自發(fā)性電節(jié)律的心肌細胞、神經(jīng)元上有分布,并介導這些細胞的起搏電流Ih(hyperpolarization-activated current)的形成,該電流又被稱為If(funny current),因此HCN1在這些細胞的起搏電活動中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[31,32]。而我們課題組前期研究結(jié)果表明,離子通道HCN1是特異性分布于ICC上的離子通道蛋白,在ICC起搏節(jié)律形成中作為始發(fā)離子通道而發(fā)揮著重要作用[11]。因此,胃腸道ICC數(shù)目降低、功能蛋白HCN1表達下調(diào)可能是慢傳輸型便秘形成的細胞和分子基礎(chǔ)。

番瀉葉主要成分為尖葉番瀉葉含有的番瀉苷A、B、C及蘆薈大黃素-8-葡萄糖苷、大黃酸-1-葡萄糖苷、大黃酸-8-葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸糖等。番瀉葉主要導瀉成分為番瀉苷A、B、C、D,其中番瀉苷A和B互為同分異構(gòu)體,且番瀉苷A的含量較多,相對易于提取[7-9]。番瀉葉具有瀉下通便作用,因此被廣泛應用于便秘患者的治療中,番瀉苷是番瀉葉導瀉促蠕動的有效成分,但是具體的機制尚不明確。本次在體實驗結(jié)果表明,番瀉苷A對慢傳輸型便秘模型大鼠結(jié)腸促蠕動作用優(yōu)于傳統(tǒng)促動力藥莫沙比利,而離體肌條實驗也發(fā)現(xiàn)番瀉苷A可以顯著提高胃腸道離體肌條收縮頻率和幅度。但是如果選擇性阻斷HCN1可以明顯削弱番瀉苷A在慢傳輸型便秘模型大鼠中的促結(jié)腸動力作用。同時離體肌條實驗也表明選擇性阻斷HCN1確實可以顯著削弱番瀉苷A促結(jié)腸肌條收縮作用。以上實驗結(jié)果表明,番瀉苷A促進慢傳輸型便秘模型大鼠結(jié)腸蠕動的作用有賴于HCN1通道蛋白的存在,但是番瀉苷A是否通過激活HCN1通道蛋白來起促結(jié)腸動力作用還需進一步深入研究。

本次實驗結(jié)果顯示,慢傳輸型便秘模型大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細胞數(shù)目減少、HCN1通道蛋白表達減少,這構(gòu)成STC形成的細胞和分子基礎(chǔ);同時在體和離體實驗結(jié)果表明番瀉苷A可以通過促進慢傳輸型便秘模型大鼠結(jié)腸蠕動來發(fā)揮對STC的治療作用,且這種作用有賴于HCN1通道蛋白的存在。但是進一步探究番瀉苷A是通過激活HCN1通道蛋白來發(fā)揮藥理作用,還需要開展細胞膜片鉗實驗才能直接驗證。