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    孟魯司特治療兒童支氣管哮喘急性發(fā)作期的療效及對(duì)循環(huán)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)的影響*

    2020-07-13 03:25:36孫劍玥解玉徐亞娜
    廣東醫(yī)學(xué) 2020年12期
    關(guān)鍵詞:白三烯外周血氣道

    孫劍玥, 解玉, 徐亞娜

    上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院)兒科(上海 200062)

    支氣管哮喘屬于過敏性疾病中常見且較為嚴(yán)重的一種,該疾病常見的臨床表現(xiàn)為咳嗽、胸悶與發(fā)作性喘息,常伴各種并發(fā)癥如呼吸衰竭、肺氣腫等,甚至導(dǎo)致患者死亡[1]。研究證明該疾病主要與氣道炎癥、氣道可逆性阻塞有關(guān),其發(fā)病機(jī)制為白三烯與其他炎癥介質(zhì)共同作用于氣道,導(dǎo)致患者出現(xiàn)氣道高反應(yīng)性、平滑肌痙攣、氣道重塑等各種氣道炎癥等[2]。對(duì)于呼吸科醫(yī)師來說,對(duì)氣道重塑與氣道炎癥的預(yù)防十分困難。相關(guān)研究表示,在支氣管哮喘的發(fā)病因素中,CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Tregs)的作用十分重要[3],其可對(duì)免疫細(xì)胞的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。當(dāng)前對(duì)于孟魯司特的研究主要集中于其在哮喘疾病中的抗炎作用,在其對(duì)CD4+CD25+Tregs的影響方面研究不足。因而本文主要研究孟魯司特鈉這一白三烯受體拮抗劑對(duì)Tregs及各種效應(yīng)因子白細(xì)胞介素(IL)-5、γ干擾素(IFN-γ)水平的影響,對(duì)該藥物治療哮喘機(jī)制進(jìn)行探討。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后,選取2016年3月至2017年6月于我院就診的94例支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒為研究對(duì)象,其中患兒年齡為4~8歲,平均(6.64±1.36)歲;男44例,女50例;病程6~25 d,平均(22.34±9.07)d;既往喘息28例,既往過敏性疾病65例。

    納入標(biāo)準(zhǔn):(1)以我國權(quán)威機(jī)構(gòu)發(fā)布的《兒童支氣管預(yù)防指南》為標(biāo)準(zhǔn),所納研究對(duì)象均需符合其中有關(guān)支氣管哮喘的診斷指標(biāo)[4];(2)所有患兒在治療前1個(gè)月未使用過糖皮質(zhì)激素;(3)此前從未使用過白三烯拮抗劑;(4)患兒監(jiān)護(hù)人均需簽署相關(guān)知情同意書。

    排除標(biāo)準(zhǔn):對(duì)于合并其他重大疾病,如吸入性激素過敏、呼吸道或全身感染性疾病、嚴(yán)重全身性疾病、精神異常及其他重要臟器如心肝脾肺腎等疾病的患兒應(yīng)排除在外。

    按照隨機(jī)數(shù)字表法將患兒分為對(duì)照組與觀察組,每組47例。兩組患兒的性別、年齡、病程等情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),有可比性。見表1。

    1.2 主要試劑與儀器 CD4-FITC、CD3-PC5、CD19-FITC、CD25-PE、CD23-PE單克隆抗體;IFN-γ檢測(cè)試劑盒、IL-5(上海晶美生物工程公司);肺功能機(jī)(美國偉康公司);流式細(xì)胞儀、溶血制備儀(美國Beckman Coulter);酶標(biāo)儀、洗板機(jī)(美國DYNEX MRX);酶標(biāo)板(丹麥Nunc-immuno plate)。

    表1兩組患兒一般情況比較

    項(xiàng)目例數(shù)性別(例)男女年齡(歲)病情嚴(yán)重程度(例)重度中度病程(d)對(duì)照組4721266.75±1.47321522.15±5.08觀察組4723246.50±1.03331423.79±6.172/t值0.1710.9550.0501.407P值>0.05>0.05>0.05>0.05

    1.3 方法

    1.3.1 治療方法 所有患兒入院后首先行常規(guī)檢查,之后予其基礎(chǔ)治療,如解痙、吸氧、抗感染、化痰等,保證患兒飲食的清淡。在治療用藥上,對(duì)照組:給予布地奈德混懸液0.5 mg/2 mL霧化吸入治療,1次/d,4周為1個(gè)療程;觀察組:在對(duì)照組用藥的基礎(chǔ)上,加服孟魯司特咀嚼片5 mg,1片/d,4周為1個(gè)療程。用藥過程中定期為患兒進(jìn)行體檢,對(duì)其用藥前后疾病癥狀的變化進(jìn)行詳細(xì)記錄。

    1.3.2 肺功能評(píng)價(jià) 使用肺功能機(jī)測(cè)量患兒的肺功能情況,主要包括以下指標(biāo):肺活量(FVC)、第1秒用力呼吸率(FEV1/FVC)、第1秒用力呼氣量(FEV1)等。安排專人將肺功能機(jī)的操作步驟與原理演示給患兒家長(zhǎng),由家長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)量。

    1.3.3 血清IL-5、IFN-γ水平測(cè)定 分別于治療前及治療后3個(gè)月對(duì)患兒血清IFN-γ與IL-5的水平進(jìn)行測(cè)量,選用的測(cè)量方法為酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法。采集患兒血液標(biāo)本,其采集的血液應(yīng)為前臂的外周血,采集5 mL的血液以3 000 r/min的離心速度進(jìn)行離心,時(shí)間為15 min,然后去其上清液,在溫度為-80 ℃的溫度下進(jìn)行保存?;純褐委熐凹爸委?個(gè)月隨訪時(shí)采集前臂外周血5 mL,將5 mL的抗凝血分成兩份,分別標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品和樣品,然后將100 μL的標(biāo)品和50 μL的酶標(biāo)記溶液加入到酶標(biāo)記板中,將其反應(yīng)90 min,反應(yīng)溫度為18~25 ℃,用洗扳機(jī)對(duì)其進(jìn)行每次20 s的清洗,然后將50 μL的A、B底液加入到酶標(biāo)板中,反應(yīng)15 min,在避光且溫度為18~25 ℃的條件下進(jìn)行,最后加入50 μL的終止液停止其反應(yīng)。使用5 mL抗凝血分別對(duì)樣品及標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)記,之后加入酶標(biāo)記溶液50 μL于酶標(biāo)板相應(yīng)位置,再在此位置分別加入100 μL的樣品與標(biāo)準(zhǔn)品,之后將酶標(biāo)板放置在溫度為18~25 ℃的環(huán)境中,反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為90 min,之后進(jìn)行5次清洗,每次清洗需靜置20 s,清洗之后于酶標(biāo)板中分別加入底液A、B,每個(gè)單位50 μL,對(duì)其進(jìn)行光密度(OD)的測(cè)量并依據(jù)OD值進(jìn)行IFN-γ與IL-5水平的確定。

    1.3.4 外周血CD4+CD25+Tregs百分比測(cè)定 患兒于治療前與治療后3個(gè)月分別采其前臂外周血5 mL,使用流式細(xì)胞儀對(duì)其血中CD4+CD25+Tregs的百分比進(jìn)行測(cè)量。對(duì)血樣進(jìn)行離心,轉(zhuǎn)速選擇3 000 r/min,時(shí)間為15 min,然后提取上清液。對(duì)照組為小鼠抗體,觀察組為使用多色熒光抗體標(biāo)記的CD4、CD25,將兩者進(jìn)行混合,在溫度為18~25 ℃的避光條件下,取抗凝全血100 μL,孵育15 min,然后Q-prep溶血制備儀對(duì)抗凝全血進(jìn)行直接測(cè)定,在每份標(biāo)本為5 000個(gè)細(xì)胞的情況下,計(jì)算出外周血CD4+CD25+Tregs的百分比。

    1.3.5 日間、夜間癥狀評(píng)分 依據(jù)患兒日間與夜間哮喘癥狀表現(xiàn)的不同,評(píng)價(jià)癥狀程度得出分?jǐn)?shù)[6]。夜間癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):(1)因哮喘持續(xù)發(fā)作無法睡眠記3分;(2)因哮喘癥狀發(fā)作經(jīng)常憋醒記2分;(3)因哮喘癥狀憋醒1次記1分;(4)夜間無癥狀記0分。日間癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):(1)哮喘持續(xù)發(fā)作記3分;(2)頻繁發(fā)作記2分;(3)哮喘癥狀較輕記1分;(4)無哮喘癥狀記0分。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 選擇 SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析研究所得數(shù)據(jù),用百分率表示計(jì)數(shù)資料,對(duì)其進(jìn)行2檢驗(yàn);用表示計(jì)量資料,用t檢驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行分析比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 兩組患兒治療前后肺功能指標(biāo)比較 相比于治療前來說,治療后兩組患兒肺功能指標(biāo)均改善明顯,觀察組變化程度更加明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

    表2治療前后肺功能指標(biāo)比較

    項(xiàng)目例數(shù)FEV1/FVC(%)FEV1(L)FVC(L)治療前治療后治療前治療后治療前治療后對(duì)照組4761.3±12.562.8±13.21.5±0.61.5±0.51.9±0.52.1±0.4觀察組4760.2±13.470.2±13.51.4±0.51.8±0.42.0±0.42.4±0.3t值0.4122.6870.8783.2121.0714.113P值>0.05<0.05>0.05<0.05>0.05<0.05

    2.2 兩組患兒治療前后日間、夜間癥狀評(píng)分比較 與治療前相比,治療后兩組患兒的日間與夜間的癥狀評(píng)分均下降顯著,且觀察組變化程度更大(P<0.05)。見表3。

    表3 治療前后夜間與日間癥狀評(píng)分比較 分

    2.3 兩組患兒治療前后血清IFN-γ和IL-5水平比較 相比于治療前,治療后患兒的IFN-γ水平整體有升高趨勢(shì),而IL-5水平呈下降趨勢(shì),且與對(duì)照組相比,觀察組變化顯著(P<0.05)。見表4。

    2.4 兩組患兒治療前后外周血CD4+CD25+Tregs比例比較 與治療前相比,治療后兩組患兒外周血中CD4+CD25+Tregs百分比均有所升高,且觀察組比對(duì)照組升高的程度更大(P<0.05)。見表5。

    表4血清IL-5和IFN-γ治療前后水平比較

    項(xiàng)目例數(shù)IL-5(pmol/L)INF-γ(ng/L)治療前治療后治療前治療后對(duì)照組47307.49±87.60182.82±37.4815.43±1.7717.73±1.87觀察組47305.69±91.82162.33±38.5515.38±1.8219.05±1.97t值0.0972.6130.1353.332P值>0.05<0.05>0.05<0.05

    表5外周血中CD4+CD25+Tregs比例治療前后比較

    項(xiàng)目例數(shù)CD4+CD25+Tregs治療前治療后t值P值對(duì)照組479.49±2.3713.07±2.157.670<0.05觀察組479.59±2.2914.09±1.9710.213<0.05t值0.2082.398P值>0.05<0.05

    3 討論

    支氣管哮喘這一炎性疾病的發(fā)生主要是由于炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子等物質(zhì)對(duì)呼吸道刺激造成的,其支氣管主要表現(xiàn)為氣道重塑或支氣管痙攣等,對(duì)患者的工作生活造成嚴(yán)重影響[5]。支氣管哮喘的反復(fù)發(fā)作,氣道發(fā)生纖維化和重塑,其主要原因是氣道受到一些炎癥介質(zhì)如白三烯等的反復(fù)刺激。從分子生物學(xué)角度考慮,免疫紊亂可能是造成該疾病的重要原因[6-7]。相關(guān)研究[6]表明,引起哮喘疾病的內(nèi)在機(jī)制可能是以輔助型T細(xì)胞2(Th2)為主的輔助型T細(xì)胞1(Th1)/Th2失衡、IFN-γ水平下降以及IL-5因子增多等。為解決當(dāng)前常用藥物不能根治哮喘的局面,研究人員不斷探索如何使Th1/Th2的平衡保持穩(wěn)定以及減少合成白三烯(LTs),這可能為哮喘的治療提供新方法。

    CD4+CD25+Tregs于1995年被發(fā)現(xiàn)具有免疫抑制和免疫無能性的特征,主要作用機(jī)制是對(duì)機(jī)體的免疫平衡進(jìn)行調(diào)節(jié),這種細(xì)胞是一種抑制免疫調(diào)節(jié)的細(xì)胞是(由Sakaguchi等首次發(fā)現(xiàn))。國內(nèi)外研究[8-11]表明,在支氣管哮喘的控制中,CD4+CD25+Tregs對(duì)其他免疫細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)具有重要意義。CD4+CD25+Tregs可以對(duì)T細(xì)胞的增殖分化起到抑制作用,主要機(jī)制為這類細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物作用于B7細(xì)胞后可以釋放抑制因子作用于T細(xì)胞。同時(shí)其分泌的多種細(xì)胞因子具有抑制作用,具體如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、IL-10、IL-4等[12],然而對(duì)于其作用的發(fā)揮是否是通過可溶性細(xì)胞因子來實(shí)現(xiàn)的,現(xiàn)今尚無明確說法。有研究[13]證實(shí),支氣管哮喘患兒急性發(fā)作期間體內(nèi)CD4+CD25+Tregs的表達(dá)水平與患兒肺部的變化程度呈反比;同時(shí)其他研究[14]表示,哮喘的發(fā)生可能與CD4+CD25+Tregs的減少有關(guān)。本研究結(jié)果類似于其他研究[11-12]結(jié)論,即處于急性期的哮喘患兒外周血中CD4+CD25+Tregs水平明顯增高,這表明造成支氣管哮喘的原因可能為患兒免疫力的下降,這主要是由于其體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫功能失衡所致。

    Th2作用于肺功能的機(jī)制為:分泌多種白細(xì)胞介素IL-13、IL-5、IL-4等活化嗜酸性粒細(xì)胞,從而導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性、肺部炎癥、黏液分泌等,甚至造成氣道重塑等嚴(yán)重反應(yīng)[14]。IFN-γ抑制炎癥反應(yīng)的機(jī)制為:調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞,如Th17、B細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞等的反應(yīng)性,從而對(duì)其他炎癥介質(zhì)引起的過敏性炎癥與氣道高反應(yīng)性起到抑制作用[15]。在Th1/Th2的平衡中,IL-5與IFN-γ的拮抗起到關(guān)鍵作用,本文通過研究證實(shí)了上述觀點(diǎn)。

    當(dāng)前臨床治療急性支氣管哮喘常用藥物為吸入性糖皮質(zhì)激素,具有較強(qiáng)的與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合能力[16],能夠顯著改善臨床癥狀,然而并不能根治哮喘,這是由于激素不能阻止LTs的合成及其對(duì)呼吸道的作用,因而患者病情反復(fù)。與激素治療相比,孟魯司特這一新型藥物的作用機(jī)制是選擇性與患兒體內(nèi)支氣管平滑肌的白三烯受體相結(jié)合,且該藥還具有依從性好、口感好等優(yōu)點(diǎn)[17-19]。本研究結(jié)果顯示,觀察組患兒肺功能各項(xiàng)指標(biāo)改善明顯優(yōu)于對(duì)照組,且日間夜間癥狀評(píng)分顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。證實(shí)孟魯司特治療兒童支氣管哮喘急性發(fā)作期效果顯著,不僅能夠顯著改善喘息等臨床癥狀,還能提高其肺功能。同時(shí),研究結(jié)果還顯示,觀察組患兒IFN-γ與IL-5水平變化等方面效果均優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05),其原因主要為該藥阻斷了白三烯受體。這一結(jié)果表明孟魯司特可以提高患者CD4+CD25+Tregs水平,從根本上治療炎癥。

    綜上所述,孟魯司特通過選擇性阻斷LTs從而消除炎癥反應(yīng),調(diào)高CD4+CD25+Tregs的比例,以及調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡,抑制T細(xì)胞的活性,從而有效的改善肺部功能,達(dá)到控制哮喘炎癥的目的,因此,該項(xiàng)目藥物可以廣泛的應(yīng)用于臨床。

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