白藜蘆醇苷介導(dǎo)SIRT1抑制未折疊蛋白反應(yīng)-凋亡途徑在腎缺血再灌注損傷中的作用*

謝志娟, 陳建英

1南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科(湖南衡陽(yáng) 421001)； 2湖南省人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科(湖南長(zhǎng)沙 410005)

失血性休克復(fù)蘇后、腎移植術(shù)及腎部分切除術(shù)后不僅可引起腎臟缺血再灌注損傷，而且誘導(dǎo)氧化應(yīng)激(ROS)反應(yīng)，同時(shí)沉默信息調(diào)節(jié)因子(silent mating type information regulator, SIRT)、炎癥及未折疊蛋白反應(yīng)等信號(hào)通路促進(jìn)腎上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡[1-3]。我們前期研究證實(shí)[4]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)-凋亡途徑介導(dǎo)一系列生物學(xué)效應(yīng)促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞損傷。馬懿等[5]發(fā)現(xiàn),沉默信息調(diào)節(jié)因子1(recombinant sirtuin 1, SIRT1) 激動(dòng)劑白藜蘆醇苷上調(diào)SIRT1介導(dǎo)單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocytes chemotactic protein-1, MCP-1)抑制氧化型低密度脂蛋白(oxidation low lipoprotein, ox-LDL)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞增殖、細(xì)胞氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)從而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。而且我們前期研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇苷可通過(guò)介導(dǎo)TGF-β1/miR-21信號(hào)通路抑制足細(xì)胞增殖及NLRP3炎性小體活化的表達(dá)從而保護(hù)足細(xì)胞損傷，但是尚未探究白藜蘆醇苷上調(diào)SIRT1是否介導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)-凋亡途徑保護(hù)腎缺血再灌注損傷的具體分子機(jī)制[6]。本研究旨在探討白藜蘆醇苷介導(dǎo)SIRT1是否抑制未折疊蛋白反應(yīng)-凋亡途徑在腎缺血再灌注損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及藥品 雄性SD大鼠32只，體重380～420 g，由南華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部提供。冷凍高速離心機(jī)及臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)公司生產(chǎn))，超凈工作臺(tái)(蘇信凈化設(shè)備廠)，白藜蘆醇苷(純度約99%)購(gòu)自西安天一生物技術(shù)有限公司，DMEM培養(yǎng)液(Sigma-Aldrich,USA)，胎牛血清(20%FBS,Gibco,USA)，超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒、二辛可寧酸(BCA)法蛋白質(zhì)定量試劑盒(Sigma,USA)，白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α) ELISA試劑盒，SIRT1、X盒結(jié)合蛋白1 (X-box-binding protein 1, XBP1s)、轉(zhuǎn)錄激活子4(activating transcription factor 4, ATF4)及半胱天冬蛋白酶-3(caspase-3)等兔多克隆抗體(Santa Cruz,USA)，2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)(Sigma,USA)，TUNEL檢測(cè)試劑盒(Roche公司，美國(guó))。

1.2 模型制備及處置 適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)良好，按照隨機(jī)原則分為假手術(shù)組(A組)、腎缺血再灌注組(B組)、白藜蘆醇苷組(C組)、SIRT1抑制劑EX-527組(D組)，每組8只。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食禁水。經(jīng)腹腔注射1%氯胺酮(100 mg/kg)麻醉，備皮消毒后行正中剖腹手術(shù)。B組大鼠暴露腎臟，雙側(cè)腎蒂組織鈍性分離并予以?shī)A閉，腎臟由鮮紅變?yōu)樽仙崾咀钄喑晒?。缺血時(shí)間持續(xù)0.5 h后行再灌注，腎臟顏色又恢復(fù)到鮮紅表明再灌注成功。C組術(shù)前45 min予以白藜蘆醇苷10 mg/(kg·d)尾靜脈注射。D組術(shù)前45 min予以SIRT1抑制劑(EX-527)5 mg/(kg·d)尾靜脈注射。24 h后處死大鼠并收集腎臟標(biāo)本及血清。本研究通過(guò)南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物處置方法依據(jù)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1 生化檢查方法 采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)血清MDA及WST-1法檢測(cè)SOD；采用DCFH-DA負(fù)載法檢測(cè)腎細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平；采用ELISA法檢測(cè)IL-1β及TNF-α水平；采用全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)檢測(cè)血清肌酐(Cr)和血清尿素氮(BUN)濃度。以上嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.2 凋亡檢查方法 采用TUNEL試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，以上嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.3 Western blot檢測(cè)腎組織SIRT1、XBP1s、ATF4及caspase-3蛋白的表達(dá) 充分裂解腎組織提取蛋白并采用BCA法測(cè)蛋白濃度，提取等量蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳(SDS-PAGE)，采用硝酸纖維素(PVDF)電轉(zhuǎn)膜；5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入SIRT1、XBP1s、ATF4及caspase-3一抗4℃孵育過(guò)夜，α-Tubulin作為內(nèi)參；次日用磷酸鹽緩沖液洗膜，加入二抗室溫孵育1 h。然后用顯色(化學(xué)發(fā)光法)，采集圖像(UVP型凝膠圖像分析系統(tǒng))，分析條帶積分吸光度(Image J 軟件)，以A組為參照計(jì)算蛋白的表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)據(jù)文件，計(jì)量正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，多組與對(duì)照組比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)、腎功能及細(xì)胞凋亡指數(shù)的比較 與A組比較，B組血清Cr、BUN、MDA、ROS含量和細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高，SOD含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與B組比較，C組血清Cr、BUN、MDA、ROS含量和細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低，SOD含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而D組通過(guò)下調(diào)SIRT1后各項(xiàng)指標(biāo)變化與C組比較呈相反的趨勢(shì)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1各組中MDA、SOD、ROS、Cr、BUN及細(xì)胞凋亡指數(shù)水平的比較

組別MDASODROSBUNCr細(xì)胞凋亡指數(shù)(nmol/mg)(u/mg)(AU)(mmol/mg)(μmol/L)(%)A組7.26±2.1725.11±5.521.06±0.02 12.36±1.9241.11±10.149.96±2.13B組16.26±3.37?10.22±2.13?2.16±0.05?26.30±3.15?126.27±26.87?43.22±4.77?C組9.26±2.91△20.76±4.87△1.51±0.04△16.41±6.67△83.31±8.09△32.37±5.39△D組24.41±3.67△15.56±2.42△3.45±0.06△35.26±3.37△189.54±28.10△54.80±5.09△

注：*與A組比較P<0.05; △與B組比較P<0.05

2.2 各組大鼠SIRT1、XBP1s、ATF4、caspase-3蛋白表達(dá)及炎癥指標(biāo)的比較 與A組比較，B組腎組織SIRT1、XBP1s、ATF4、caspase-3蛋白表達(dá)和IL-1β、TNF-α水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與B組比較，C組腎組織SIRT1、XBP1s、ATF4、caspase-3蛋白表達(dá)和血清IL-1β、TNF-α水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而D組通過(guò)下調(diào)SIRT1后各項(xiàng)指標(biāo)變化與C組比較呈相反的趨勢(shì)(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表2。

表2各組中SIRT1、XBP1s、ATF4、caspase-3蛋白表達(dá)及血清IL-1β、TNF-α的比較

組別SIRT1(%)XBP1s(%)ATF4(%)caspase-3IL-1β(pg/mL)TNF-α(pg/mL)A組1.01±0.011.02±0.021.06±0.02 1.06±0.0151.11±12.23114.96±24.13B組2.26±0.33?2.11±0.25?2.61±0.27?2.03±0.59?83.77±10.24?162.32±43.22?C組1.66±0.31△1.71±0.41△1.44±0.34△1.41±0.37△51.79±14.05△116.21±17.25△D組3.13±0.40△2.72±0.28△3.32±0.31△2.42±0.63△90.23±11.01△188.93±44.14△

注：*與A組比較P<0.05; △與B組比較P<0.05

圖1 Western blot檢測(cè)SIRT1、XBP1s、ATF4及caspase-3蛋白表達(dá)

3 討論

本課題組前期通過(guò)阻斷腎血管0.5 h后再灌注的方法構(gòu)建腎缺血再灌注損傷模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腎組織病理學(xué)損傷明顯加重及血清Cr、BUN等指標(biāo)明顯升高提示大鼠腎缺血再灌注損傷模型構(gòu)建成功[7]。此次研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，大鼠腎缺血再灌注后血清Cr、BUN及細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高提示與前期研究工作一致[6]。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)[8-9]，過(guò)氧化與抗氧化之間的調(diào)控失衡誘導(dǎo)氧自由基的爆發(fā)性釋放和氧自由基自我清除能力顯著下降，上述情況嚴(yán)重影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性和促進(jìn)細(xì)胞過(guò)度脂質(zhì)化，最后導(dǎo)致腸缺血再灌注后的細(xì)胞損傷。同時(shí)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)炎癥-凋亡途徑在腸缺血灌注損傷中扮演重要的角色。鑒于上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)我們通過(guò)大鼠腎缺血再灌注損傷也發(fā)現(xiàn)，血清MDA、ROS、IL-1β、TNF-α的含量和腎組織caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高，SOD含量明顯降低，提示ROS/炎癥/凋亡軸參與腎缺血再灌注損傷。與此同時(shí)，未折疊蛋白-凋亡信號(hào)途徑是否參與缺血再灌注損傷另外的一個(gè)新機(jī)制？Liu等[10]研究顯示，缺血再灌注損傷可介導(dǎo)氧化應(yīng)激-未折疊蛋白反應(yīng)途徑誘發(fā)錯(cuò)誤或未折疊蛋白質(zhì)蓄積。而Tang等[11]研究顯示持續(xù)或過(guò)度的未折疊蛋白反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子X(jué)BP1s及ATF4可介導(dǎo)caspase-3等信號(hào)途徑誘發(fā)細(xì)胞焦亡或死亡，從而導(dǎo)致組織損傷。我們研究結(jié)果顯示大鼠腎缺血再灌注損傷腎組織XBP1s及ATF4明顯升高提示未折疊蛋白信號(hào)通路參與其分子病理機(jī)制。

Liu等[12]研究報(bào)道：上調(diào)SIRT1通過(guò)調(diào)控NLRP3炎癥小體及NF-κB信號(hào)通路抑制機(jī)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而保護(hù)LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷。Kang等[13]研究也報(bào)道，SIRT1與未折疊蛋白反應(yīng)途徑相互作用調(diào)控B細(xì)胞氧化還原平衡與炎癥的分子機(jī)制。SIRT1激動(dòng)劑白藜蘆醇苷是一種藥效學(xué)多樣化的多酚類(lèi)化合物,具有調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡、活性氧生成及炎性因子表達(dá)等生物效應(yīng)[14-16]。并且本課題組前期研究表明，白藜蘆醇通過(guò)阻礙細(xì)胞周期進(jìn)展及促進(jìn)細(xì)胞凋亡途徑抑制人胚肺成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖[17]。因此，我們推測(cè)白藜蘆醇苷可能通過(guò)調(diào)控SIRT1蛋白對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷的上述的機(jī)制產(chǎn)生影響。為了論證此假說(shuō)，本研究依照文獻(xiàn)經(jīng)尾靜脈注射SIRT1激動(dòng)劑和抑制劑后發(fā)現(xiàn)，SIRT1激動(dòng)劑即白藜蘆醇苷10 mg/kg, 連續(xù)7 d干預(yù)后能有效抑制未折疊蛋白過(guò)度反應(yīng)-凋亡途徑及氧化應(yīng)激-炎癥反應(yīng)途徑等分子信號(hào)途徑保護(hù)腎缺血再灌注損傷，然而SIRT1抑制劑即EX-527 5 mg/(kg·d), 連續(xù)7 d的預(yù)處理結(jié)果卻與之相反。

綜上所述，大鼠腎缺血再灌注損傷的病理生理機(jī)制與SIRT1介導(dǎo)的未折疊蛋白過(guò)度反應(yīng)-凋亡及氧化應(yīng)激-炎癥反應(yīng)信號(hào)通路激活有關(guān)，而SIRT1激動(dòng)劑白藜蘆醇苷通過(guò)抑制未折疊蛋白過(guò)度反應(yīng)-凋亡及氧化應(yīng)激-炎癥反應(yīng)途徑發(fā)揮保護(hù)大鼠腎缺血再灌注損傷的作用。本研究?jī)H通過(guò)體外研究模擬腎缺血再灌注損傷致病過(guò)程，我們下一步將進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究其機(jī)制及藥物的靶向治療提供一定的理論依據(jù)。