紫薯組培快速繁殖技術(shù)初探

張明菊，孫 青，余 凡

(黃岡師范學(xué)院 生物與農(nóng)業(yè)資源學(xué)院，湖北 黃岡 438000)

紫薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam]屬旋花科甘薯屬草本植物，薯肉呈紫色至深紫色，是甘薯的一個(gè)特殊品種類型，兼有糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物和藥用作物的特點(diǎn)，是食品、醫(yī)藥、化工、輕工、紡織等工業(yè)的重要原料。紫薯產(chǎn)量高，用途廣，是一種集藥用、保健、食用為一體的天然食品[1]。紫薯具有普通甘薯豐富的成分和功能外，還含有多糖、黃酮類物質(zhì)，并且還富含硒元素和花青素，而硒元素，具有預(yù)防高血壓、減輕肝機(jī)能障礙等功能，花青素具備抗氧化、抗突變、降低血壓、保肝護(hù)肝、抗癌等多種藥理活性[2]。而紫薯在生產(chǎn)過程中，是用塊根、藤蔓進(jìn)行無性繁殖的，易受多種病毒的侵染。當(dāng)病毒在植物體內(nèi)累積達(dá)到一定程度時(shí)就會(huì)引起產(chǎn)量下降、品質(zhì)降低、品種退化[3]，嚴(yán)重制約了紫薯的生產(chǎn)和推廣應(yīng)用。

對(duì)紫薯進(jìn)行組培快速繁殖是利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)來提高繁殖系數(shù)，減少病毒危害，從而獲得大量健康的繁殖材料用于大田生產(chǎn)。已有文獻(xiàn)中這方面研究較少。本研究以欣薯2號(hào)紫薯催芽得到的頂芽為外植體，對(duì)紫薯外植體進(jìn)行不同滅菌處理，通過探索誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)不同階段激素配比的最佳組合，優(yōu)化培養(yǎng)基配方，從而建立欣薯2號(hào)紫薯組織培養(yǎng)脫毒快速繁殖體系。同時(shí)還可以通過組織培養(yǎng)獲取大量紫薯細(xì)胞，利用生物反應(yīng)器提取黃酮、花青素等成分。因此，對(duì)紫薯進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，不僅可以建立紫薯快速繁殖體系，實(shí)現(xiàn)脫毒苗的工廠化生產(chǎn)[4]，還能為黃酮、花青素等工業(yè)化生產(chǎn)提供重要原料。

1 材料與方法

1.1 供試材料及處理

供試材料為黃石市欣野薯業(yè)有限公司提供的欣薯2號(hào)紫薯(圖1A)。將欣薯2號(hào)紫薯埋種在沙土中(圖1B)，離沙土面2～3 cm，放于恒溫箱中進(jìn)行催芽，隔1～2 d澆水一次，當(dāng)幼苗長至20～30 cm時(shí)，取其頂芽10～15 cm，剪去較大的葉片，取莖段作為外植體材料(圖1C)。

圖1 欣薯2號(hào)紫薯及其組培苗A.紫薯; B.紫薯催芽；C.接種后的莖尖

1.2 培養(yǎng)基的配制

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，加入不同配比的細(xì)胞分裂素/生長素，細(xì)胞分裂素使用6-芐氨基嘌呤(6-BA)，生長素用萘乙酸(NAA)或吲哚丁酸(IBA)。此外，還在培養(yǎng)基中加入3.0%蔗糖，瓊脂粉的濃度為0.7%。因此，培養(yǎng)基主要成分表示為：MS基本培養(yǎng)基+3.0%蔗糖+0.7%瓊脂+一定濃度的NAA+一定濃度的6-BA，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH為5.8。1/2MS表示所有無機(jī)鹽濃度減半，其他成分不變；2MS表示所有無機(jī)鹽濃度增加一倍，其他成分不變。

1.3 外植體消毒及接種

消毒：用0.1%洗衣粉液洗滌或加幾滴吐溫浸泡5 min，用蒸餾水清洗干凈，置于超凈工作臺(tái)上進(jìn)行滅菌。接種：先在燒杯中用75%酒精浸泡30 s，再用2.5%次氯酸鈉溶液消毒10 min，最后用無菌水清洗4～5次，在超凈工作臺(tái)上用無菌剪刀剪成1 cm左右莖尖接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

1.4 培養(yǎng)條件

將接種好的培養(yǎng)瓶放在培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±2 ℃，每天光照12 h，光照強(qiáng)度1500～2000 lx。

1.5 數(shù)據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)

外植體按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別接種20個(gè)，接種培養(yǎng)后在固定時(shí)間內(nèi)對(duì)外植體材料的萌芽率、增殖倍數(shù)、生根率等指標(biāo)作觀察記載并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并據(jù)此選擇最優(yōu)培養(yǎng)基配方。

其中：成苗率=成苗外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%；

出芽率=萌芽外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%；

生根率=生根苗數(shù)/總苗數(shù)×100%；

成活率=成活株數(shù)/總移栽苗數(shù)×100%。

外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，20 d后統(tǒng)計(jì)出芽數(shù)和萌芽率。每個(gè)處理接種10個(gè)，重復(fù)2次，定期觀察培養(yǎng)物的生長狀況，篩選出適合欣薯2號(hào)紫薯誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合。

將增殖培養(yǎng)所得的健壯莖芽，轉(zhuǎn)接到添加不同濃度NAA和IBA的生根培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種10個(gè)，重復(fù)3次。30 d后記錄根數(shù)，并統(tǒng)計(jì)生根率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對(duì)紫薯外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

在MS培養(yǎng)基中，首先通過固定NAA濃度0.1 mg·L-1，添加不同濃度的6-BA(0、0.25、0.5、0.75、1.0 mg·L-1)，形成A1、A2、A3、A4、A5等組合；再通過固定6-BA濃度0.75 mg·L-1，添加不同濃度的NAA(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·L-1)，形成B1、B2、B3、B4、B5等組合，觀察不同激素配比的誘導(dǎo)結(jié)果(表1)。結(jié)果表明，6-BA對(duì)欣薯2號(hào)紫薯芽萌發(fā)有促進(jìn)作用，接種后，第7 d后頂芽開始伸長(圖2A)，15 d后葉片展開，葉色濃綠；第7 d后莖段的腋芽也開始萌動(dòng)，小腋芽點(diǎn)變綠；第14 d后腋芽伸長，葉片展開。

表1 不同6-BA和NAA配比對(duì)紫薯莖尖分生組織誘導(dǎo)苗的影響

在固定NAA濃度0.1 mg·L-1時(shí)，6-BA濃度為0.75 mg·L-1的培養(yǎng)基對(duì)促進(jìn)頂芽生長的效果最好，出芽率為58%，與對(duì)照組相比出芽率增加了1.6倍；但當(dāng)6-BA濃度達(dá)到1.0 mg·L-1時(shí)出芽率反而降低(33%)。固定6-BA濃度0.75 mg·L-1，添加不同濃度的NAA時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨著NAA濃度的提高，出芽率和出根率有下降的趨勢。因此，欣薯2號(hào)紫薯莖尖的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組合是：MS+6-BA0.75 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1。

2.2 不同激素配比對(duì)紫薯莖芽增殖繼代培養(yǎng)的影響

在紫薯外植體增殖繼代培養(yǎng)過程中，首先通過固定NAA濃度0.2 mg·L-1，添加不同濃度的6-BA(0、1.0、2.0、3.0、4.0 mg·L-1)，形成E1、E2、E3、E4、E5等激素組合；再通過固定6-BA濃度3.0 mg·L-1，添加不同濃度的NAA(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·L-1)，形成F1、F2、F3、F4、F5等組合，觀察不同激素配比的誘導(dǎo)結(jié)果(表2)。

表2 不同6-BA和NAA配比對(duì)紫薯繼代增殖的影響

結(jié)果表明，在不加6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基中，腋芽能夠萌發(fā)生長，但是增殖倍數(shù)比添加6-BA的各處理組都低，且萌發(fā)芽長勢明顯較差，這說明細(xì)胞分裂素6-BA對(duì)紫薯莖芽增殖繼代培養(yǎng)起重要作用。但當(dāng)6-BA濃度為4 mg·L-1時(shí)，不僅腋芽增殖倍數(shù)下降，還會(huì)產(chǎn)生大量氣生根，降低了苗的質(zhì)量。當(dāng)6-BA濃度固定在3.0 mg·L-1，以NAA濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，莖芽增殖倍數(shù)最高，7 d左右芽伸長0.5～1.0 cm，15 d左右便可以完全展開第一片葉，腋芽長勢旺盛，莖粗壯，葉片舒展，葉色深綠，有光澤(圖2B)。NAA濃度偏低或偏高均不利于莖芽增殖。因此，欣薯2號(hào)紫薯莖芽增殖培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基組合為：MS+6-BA3.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1。

同時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)6-BA與NAA以不同濃度在培養(yǎng)基中一起使用時(shí)，欣薯2號(hào)紫薯增殖芽的誘導(dǎo)效果增強(qiáng)，增殖倍數(shù)最高可達(dá)5.96，此時(shí)6-BA濃度為3 mg·L-1，NAA為0.2 mg·L-1?？梢缘贸鲂朗?號(hào)紫薯莖尖的繼代增殖最佳培養(yǎng)基組合為：MS+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1。

2.3 不同激素配比和不同無機(jī)鹽離子濃度對(duì)紫薯莖芽生根的影響

將增殖培養(yǎng)所得的健壯莖芽，轉(zhuǎn)接到MS添加不同濃度NAA和IBA的生根培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)，30 d后，調(diào)查生根情況(表3)。結(jié)果表明：莖芽在不添加生長素的MS培養(yǎng)基上也能生根，生根率為32%；在添加不同濃度NAA的MS培養(yǎng)基上，NAA為0.4 mg·L-1時(shí)生根率最高，且平均每株生根數(shù)也最高；在添加不同濃度IBA的MS培養(yǎng)基上，NAA為0.4 mg·L-1時(shí)生根率最高，但平均每株生根數(shù)以0.5 mg·L-1最高。因此，在MS培養(yǎng)基中，加入0.3～0.4 mg·L-1的NAA或0.3～0.5 mg·L-1的IBA均可促進(jìn)紫薯莖芽生根。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，NAA對(duì)紫薯莖芽生根效果更好，苗的長勢更強(qiáng)壯(圖2C)，而IBA處理組的組培苗偏細(xì)長，長勢較弱。因此，NAA濃度為0.4 mg·L-1更有利于無菌芽的生根。

圖2 欣薯2號(hào)紫薯組培苗A.誘導(dǎo)的愈傷組織；B.增殖莖芽；C.生根的組培苗

表3 不同濃度的NAA和IBA對(duì)無菌苗生根的影響

實(shí)驗(yàn)中，將增殖培養(yǎng)所得的健壯莖芽轉(zhuǎn)接到含有NAA 0.4 mg·L-1的三種基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察發(fā)現(xiàn)，在1/2MS培養(yǎng)基上生根率和平均每株生根數(shù)最高(表4)。這說明適當(dāng)降低培養(yǎng)基中無機(jī)鹽離子濃度有利于生根。

表4 不同無機(jī)鹽離子濃度對(duì)紫薯莖芽生根的影響

3 討論

外植體的消毒方法一般采用1%HgCl2溶液浸泡，滅菌效果好，成活率高， NaClO處理紫薯莖段的成活率不高，滅菌效果不佳。由于紫薯是一種天然、健康的保健食品，1%HgCl2溶液容易產(chǎn)生重金屬離子殘留污染等問題，因此實(shí)驗(yàn)中探索出欣薯2號(hào)外植體的消毒方案為：75%酒精處理30 s+2.5%NaClO溶液處理15 min+無菌水清洗3次。這樣得到的欣薯2號(hào)紫薯外植體成活率可達(dá)75%以上。

在紫薯外植體愈傷組織和莖芽誘導(dǎo)培養(yǎng)及莖芽增殖培養(yǎng)中，MS培養(yǎng)基中不同的植物生長調(diào)節(jié)劑的配比誘導(dǎo)莖尖分化成苗的是主要影響因素，紫薯莖尖的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合是：MS+6-BA 0.75 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，紫薯莖芽增殖培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基組合為：MS+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1?？梢?，適度增加細(xì)胞分裂素濃度有利于莖芽分化增殖。

欣薯2號(hào)紫薯組培苗在不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的1/2MS、MS和2MS培養(yǎng)基中，都可以生根，但是生根時(shí)間較久，根細(xì)長。在三種培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)生根的NAA和IBA，生根時(shí)間、根苗質(zhì)量均有所改善。其中NAA對(duì)根的誘導(dǎo)效果較IBA好，根粗壯、苗的長勢也較好。濃度實(shí)驗(yàn)表明，低濃度的生長素促進(jìn)細(xì)胞伸長，促進(jìn)生根，而高濃度的生長素抑制生長，甚至有可能導(dǎo)致植株死亡。紫薯無根組培苗最佳NAA生根濃度為0.4 mg·L-1。在添加NAA濃度為0.4 mg·L-1的1/2MS、MS和2MS三種培養(yǎng)基中，以1/2MS的效果最好，說明低濃度的無機(jī)鹽有利于生根，這與其他研究者的結(jié)果存在差異[2-5]。

欣薯2號(hào)紫薯在組織培養(yǎng)時(shí)也有出現(xiàn)褐化組培面莖細(xì)弱和玻璃化現(xiàn)象，褐化主要是因?yàn)橥庵搀w偏小造成的，外植體越小，其相對(duì)表面積越大，與空氣接觸的面積越大，組織中的酚類化合物越容易被氧化。玻璃化主要是因?yàn)榻M培苗在培養(yǎng)過程中光照不足或繼代培養(yǎng)次數(shù)過多造成的。

欣薯2號(hào)紫薯花青素含量高，產(chǎn)量高，可提取食用色素，加工提取淀粉，莖尖可做蔬菜，莖藤可做豬飼料等，開發(fā)利用前景廣闊。本研究初步探討了欣薯2號(hào)紫薯莖尖分化、增殖、生根的最適培養(yǎng)基，為該品種的快速繁殖奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。楊強(qiáng)強(qiáng)等研究表明通過胚性愈傷和體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)可進(jìn)一步提高徐紫薯8號(hào)的繁殖系數(shù)[5]，這是否可用于欣薯2號(hào)紫薯還有待進(jìn)一步研究。