CO2氣腹對裸鼠卵巢癌移植瘤中uPA、uPAR、PAI表達(dá)的影響

黃金智，洪龍年，陳惠娟，譚曉瑜，張玲莉* （.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東湛江5400；.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東湛江 5403）

腹腔鏡手術(shù)因其創(chuàng)傷小、康復(fù)快、住院時間短等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為婦科最常用的微創(chuàng)手術(shù)方式，越來越多地被用于婦科良惡性腫瘤的診斷與治療，但是對于腹腔鏡應(yīng)用過程中CO2氣腹是否會促進(jìn)惡性腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移目前仍存在一些爭議。前期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CO2氣腹處理的裸鼠，其卵巢癌移植瘤的分布面積更廣、數(shù)量更多、總質(zhì)量更大，且隨著CO2氣腹處理時間的延長該效應(yīng)更明顯[1]。尿激酶型纖溶酶原激活(uPA)系統(tǒng)在惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。本文采用免疫組化、real-time PCR和western blotting檢測裸鼠卵巢癌移植瘤組織中uPA、uPAR、PAI mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，觀察CO2氣腹對這3個基因表達(dá)的影響，以探討CO2氣腹影響卵巢癌生長轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 裸鼠卵巢癌移植瘤組織切片及新鮮組織

裸鼠卵巢癌移植瘤組織切片來自本實(shí)驗(yàn)室前期收集的裸鼠卵巢癌移植瘤組織蠟塊，切片制備；新鮮組織為前期收集，經(jīng)液氮速凍30 min，以錫箔紙包裹凍存于－86 ℃超低溫冰箱的組織。卵巢癌移植瘤模型造模過程簡述如下：7～8周齡，雌性Balb/c裸鼠予腹腔注射0.5 mL的2×106卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞懸液，造模后裸鼠隨機(jī)分為對照組、開腹組、CO2氣腹0.5 h組、CO2氣腹1 h組，每組10只。對照組裸鼠僅接受麻醉處理；開腹組裸鼠麻醉后，沿腹中線開2 cm切口，30 min后關(guān)閉腹腔；CO2氣腹0.5 h和CO2氣腹1 h組：裸鼠麻醉后，分別給予腹腔CO2通氣30、60 min(將2根鈍頭注射針分別從裸鼠左右下腹插入腹腔，其中一根注射器連接CO2鋼瓶，輸入氣體壓力為5 mmHg，氣流量為0.1 L/min，另一根用于排出CO2，通氣結(jié)束后拔除注射針，以輸液貼覆蓋針孔)。4組裸鼠均于造模后12周處死并取瘤體組織。

1.2 免疫組化

按照二步法免疫組化檢測試劑盒(PV-6002，中杉金橋)的操作說明進(jìn)行，抗原修復(fù)采用高壓修復(fù)法，即將脫蠟水化后的組織切片放入煮沸的檸檬酸緩沖液中，高壓鍋加熱噴氣2 min后停止，自然冷卻至室溫； 一抗uPA抗體(sc-14019)、uPAR抗體(sc-13522)和PAI-1抗體(sc-5297)的稀釋度均為1:50，4 ℃孵育過夜；以DAB顯色試劑盒(ZLI-9017，中杉金橋)進(jìn)行顯色，蘇木素復(fù)染2 min，剃度酒精依次脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察；以PBS代替一抗作為陰性對照。免疫組化結(jié)果判斷：陽性蛋白染色因表達(dá)強(qiáng)度不同可在鏡下呈現(xiàn)未著色(與背景相近)、淺黃色(略高于背景)、棕黃色(中度著色)和棕褐色(深度著色)，分別計為0、1、2、3分；其中1～3分均為陽性細(xì)胞，隨機(jī)取5個高倍視野，計算陽性細(xì)胞比例，陽性細(xì)胞比例<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%分別計為0、1、2、3、4分；兩種計分相加，總分為0～1、2～3、4～5、6～7分分別表示陰性、弱陽性(-/+)、中等陽性(++)和強(qiáng)陽性(+++)。

1.3 總RNA提取

以液氮研磨方式磨碎組織，然后按照RNAiso Plus試劑盒(D9108A，TAKARA)的操作說明提取總RNA，以1%瓊脂糖電泳判斷RNA完整性，并用紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度(OD260/OD280為1.8～2.0)。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR(real-time PCR)

每個樣本取1 μg提取的總RNA，采用Prime?Script RT reagent kit with gDNA Eraser (RR047A，TAKARA)試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：37 ℃ 15 min→85 ℃5 s→4 ℃ 1 h。采用實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒SYBR? Premix Ex Taq?II(RR820A，TAKARA)和LightCycler?480 System Real Time PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s→95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s(40個循環(huán))→95 ℃ 5 s→60 ℃ 1 min→50 ℃ 30 s→4 ℃ 1 h。以2-ΔΔCt計算目的基因mRNA的相對表達(dá)量。擴(kuò)增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如下：

1.5 總蛋白提取

每個樣本取100 mg組織，剪碎放入預(yù)冷的玻璃勻漿器，加入500 μL細(xì)胞裂解液RIPA(含1 mmol/L的PMSF)，冰上勻漿，將勻漿液吸入離心管，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，然后將上清轉(zhuǎn)移至干凈的離心管，用Bradford蛋白定量試劑(BB-3411，貝博生物)測試蛋白濃度，提取的總蛋白分裝，保存于－80℃冰箱備用。

1.6 western blotting

每組取等量混合蛋白樣本70 μg，用十二烷硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白條帶，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉溶液封閉膜，分別孵育一抗uPA、uPAR和PAI-1抗體和內(nèi)參GAPDH抗體(sc-47724)，二抗(辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠二抗A0216購自碧云天公司)，采用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測，凝膠成像系統(tǒng)采集蛋白條帶發(fā)光圖像信息，經(jīng)灰度掃描分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

由圖1所示，uPA和PAI-1蛋白的陽性表達(dá)主要定位于卵巢癌細(xì)胞質(zhì)中，uPAR蛋白的陽性表達(dá)主要定位于卵巢癌細(xì)胞膜中。與對照組及開腹組比較，CO2氣腹0.5 h和CO2氣腹1 h組可以增加卵巢癌移植瘤組織中的uPA、uPAR和PAI的陽性表達(dá)水平，且CO2氣腹1 h的表達(dá)水平更高，但組間比較差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖1 免疫組化圖(200×)

圖2 uPA、 uPA 和PAI在4組卵巢癌組織中表達(dá)強(qiáng)度的比較

2.2 Real-time PCR結(jié)果

由圖3所示，與對照組和開腹組相比，CO2氣腹0.5 h和CO2氣腹1 h組均能明顯促進(jìn)卵巢癌移植瘤組織中的uPA、uPAR和PAI的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)。CO2氣腹1 h組的uPA、uPAR和PAI mRNA表達(dá)水平雖略高于CO2氣腹0.5 h組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 Western blotting結(jié)果

與對照組和開腹組相比，CO2氣腹0.5 h和CO2氣腹1 h組均能明顯促進(jìn)卵巢癌移植瘤組織中的uPA、uPAR和PAI的蛋白表達(dá)(P<0.05)。uPA在CO2氣腹1 h組的蛋白表達(dá)水平略低于CO2氣腹0.5 h組，uPAR和PAI則高于CO2氣腹0.5 h組，但兩組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4、5。

圖3 CO2氣腹對裸鼠卵巢癌移植瘤中uPA、uPAR、PAI-1 mRNA表達(dá)水平的影響

圖4 CO2氣腹對裸鼠卵巢癌移植瘤中uPA、uPAR、PAI-1蛋白表達(dá)水平的影響

圖5 不同組間uPA、uPAR、PAI-1蛋白表達(dá)水平的比較

3 討論、論

近20年來，腹腔鏡手術(shù)因其手術(shù)損傷小出血量少、術(shù)中視野開闊清晰、患者恢復(fù)快、痛苦少、住院時間短等優(yōu)點(diǎn)，越來越多地被用于婦科良惡性腫瘤的診治，如子宮肌瘤、早期子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、早期卵巢癌等，但是有研究表明，腹腔鏡手術(shù)用于惡性腫瘤診治時，會增加腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，與開腹手術(shù)組相比，腹腔鏡手術(shù)組早期宮頸癌患者的無病生存率和總生存率均低，且研究認(rèn)為這與腹腔鏡手術(shù)過程中使用的CO2氣腹相關(guān)[2]。在前期研究中，我們用卵巢癌移植瘤裸鼠模擬CO2氣腹，發(fā)現(xiàn)同對照組與開腹組相比，CO2氣腹處理組裸鼠的腫瘤數(shù)量更多、腫瘤體積更大、分布部位更廣[1]，但其機(jī)制并不清楚。研究顯示CO2氣腹可能通過對腹腔產(chǎn)生的機(jī)械壓力，局部干冷、缺氧的環(huán)境導(dǎo)致腹腔pH降低，進(jìn)而抑制腹腔巨噬細(xì)胞功能，下調(diào)免疫功能，對腫瘤細(xì)胞的殺傷力大為減弱,從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的粘附、增殖，而缺氧環(huán)境又能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)多種細(xì)胞因子的表達(dá)，從而增加腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力[3]。

uPA是缺氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，它是一種絲氨酸蛋白水解酶，主要與細(xì)胞分化、遷移、組織重建、細(xì)胞周圍基質(zhì)降解有關(guān)，通過與uPAR 結(jié)合發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)多種惡性腫瘤細(xì)胞，包括卵巢癌細(xì)胞，可以分泌uPA。美國一項研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌uPA水平增高與患者預(yù)后相關(guān)，因而提出uPA可以作為危險評估因子和治療靶點(diǎn)[4]。uPA與uPAR結(jié)合后轉(zhuǎn)化為有活性的uPA-uPAR，從而使纖溶酶原(plasminogen)激活成纖溶酶(plasmin)，可激活前基質(zhì)金屬蛋白酶(proMMP)，從而激活 proMMP 引起膠原的降解；纖溶酶還可以通過增加血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的活性刺激血管的生成。另外，uPA/uPAR不僅能增強(qiáng)蛋白溶解，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附，還能促進(jìn)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管生成[5]。

PAI屬絲氨酸抑制因子家族，目前已知有PAI-1、PAI-2、蛋白酶nexin、蛋白酶C抑制劑(PCI)4種。PAI-1是有效的特異性uPA抑制劑，在生理條件下對uPA有極高的親和力。PAI-1不僅能結(jié)合可溶形式的uPA，還可以結(jié)合已與受體結(jié)合形式的uPA，從而抑制纖溶酶原的激活。uPA-PAI-1復(fù)合物的水平增高的乳腺癌患者預(yù)后不良，并影響患者的存活率[6]?；|(zhì)中uPA/PAI-1蛋白的協(xié)同表達(dá)則預(yù)示著乳腺癌患者較差的結(jié)局。uPA、uPAR、PAI常以一個相互作用的調(diào)控系統(tǒng)維持了纖溶酶系統(tǒng)的平衡狀態(tài)，維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，參與諸如細(xì)胞增殖、粘附、移動等活動。

因此，在本研究中我們采用了免疫組化、realtime PCR和western blotting檢測了裸鼠移植瘤組織中的uPA、uPAR、PAI基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)無論是mRNA水平還是蛋白水平，CO2氣腹處理組均高于開腹組和對照組，提示CO2氣腹處理有可能通過促進(jìn)uPA、uPAR、PAI的表達(dá)促進(jìn)卵巢癌的生長與轉(zhuǎn)移。

有研究證實(shí)在缺氧環(huán)境中uPA的表達(dá)會上調(diào)[7]。而CO2氣腹所致的高氣腹壓會導(dǎo)致腹腔暫時缺血、缺氧；同時CO2氣體具有組織低溶性，血液高溶性的特點(diǎn)，易致血液pH值下降，造成高碳酸血癥甚至酸中毒，在酸性環(huán)境中，腹腔局部血供減慢，進(jìn)一步加重局部缺血缺氧，這可能就是CO2氣腹引起該軸表達(dá)上調(diào)的原因。uPA、PAI的表達(dá)與缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)高度相關(guān)，HIF-1是缺氧刺激激活的一種重要的轉(zhuǎn)錄因子[8-9]。這可能也是本研究中CO2氣腹處理組裸鼠移植瘤中uPA、uPAR、PAI表達(dá)升高的原因，但是其具體的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。