加速溶劑萃取法結(jié)合超高效液相色譜-熒光法測(cè)定禽蛋中甲砜霉素殘留

刁志祥，王 波，趙 霞，謝愷舟*

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009；3.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

甲砜霉素（Thiamphenicol，TAP）是一種酰胺醇類(lèi)的廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌均有抑制作用，常用于畜禽疾病治療[1-2]。然而，TAP 可抑制機(jī)體紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板生成，同時(shí)具有較強(qiáng)的免疫抑制作用。如果長(zhǎng)期食用含有TAP 藥物的禽蛋，人類(lèi)會(huì)產(chǎn)生胃腸道反應(yīng)、腹瀉、惡心和嘔吐等癥狀，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。因此，中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局和歐盟都設(shè)定了動(dòng)物源性食品中TAP 最大殘留限量為50 μg/kg[3-5]。

目前，關(guān)于動(dòng)物源性食品中TAP 殘留的樣品前處理方法主要有液-液萃取法（LLE）[6-8]、固相萃取法（SPE）[9]、LLE-SPE 法[10]、LLE-薄層色譜純化法（TLC）[11]，可轉(zhuǎn)換親水性分散溶劑型液-液微萃?。⊿HDS-LLME）[12]、織物相吸附萃取法（FPSE）[13]、基質(zhì)固相分散萃取法（MSPD）[14]、亞臨界水萃取法（SWE）[15]及QuEChERS 法[16]。其中，LLE 方法提取樣品基質(zhì)操作簡(jiǎn)單，但消耗試劑多、耗時(shí)長(zhǎng)、不適合用于樣品的批量處理。SPE 工藝需使用昂貴的Oasis MCX SPE 柱，且提取、洗脫時(shí)間長(zhǎng)。LLETLC 方法操作復(fù)雜，凈化程序繁瑣，針對(duì)樣品基質(zhì)提取單一（主要用于飼料樣品的提取、凈化），而有關(guān)加速溶劑萃取法（Accelerated Solvent Extraction，ASE）提取禽蛋中的TAP 未見(jiàn)報(bào)道。ASE 法將高溫和高壓與液態(tài)溶劑相結(jié)合，通過(guò)少量溶劑即可從固體和半固體樣品中迅速萃取化合物，全自動(dòng)且節(jié)約時(shí)間和溶劑[17]。本試驗(yàn)采用ASE 樣品前處理方法，用乙腈飽和的正己烷去脂，乙腈:氨水（98:2，V/V）作為提取劑，建立禽蛋中TAP 殘留的UPLC-FLD 法，為禽蛋中TAP 殘留檢測(cè)提供新的，可靠的檢測(cè)方法和技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 本研究分別選取28 周齡產(chǎn)蛋京海黃雞30只（江蘇京海禽業(yè)集團(tuán)有限公司）、28～30 周齡產(chǎn)蛋高郵鴨30 只（江蘇高郵鴨集團(tuán)）、30 周齡產(chǎn)蛋揚(yáng)州鵝48只（揚(yáng)州天歌鵝業(yè)發(fā)展有限公司），試驗(yàn)前預(yù)試1 周，試驗(yàn)期間均飼喂不添加任何藥物的全價(jià)飼料，連續(xù)10 d每天收集禽蛋勻漿后分裝，樣品保存在-34℃低溫蛋庫(kù)中。

1.2 主要試劑及儀器 TAP 標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.0%）（德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH 有限公司）；乙腈（色譜純）（EMD Millipore 公司）；三乙胺（純度≥99.0%，色譜純）（賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）；磷酸二氫鈉（NaH2PO4，純度≥99.0%）、十二烷基硫酸鈉（純度≥95.0%，分析純）（北京索萊寶科技有限公司）。

Acquity UPLC 型超高效液相色譜儀、Acquity FLD熒光檢測(cè)器（Waters 公司）；ASE350 型加速溶劑萃取儀、Smart2-Pure 型智能一體化超純水系統(tǒng)（Thermo Fisher公司）；ScanSpeedVac40 型離心濃縮儀（LaboGene 公司）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取TAP 標(biāo)準(zhǔn)品4.04 mg（實(shí)際含TAP為4.00 mg），用乙腈定容于10 mL 棕色容量瓶中，制成400 μg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液，分裝、密封，置4℃冷藏保存。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品的提取 本試驗(yàn)采用LLE 和ASE 2 種樣品前處理方法分別對(duì)禽蛋樣品進(jìn)行提取、凈化。

LLE 方法：稱(chēng)取2.0 g（精確至0.01 g）均質(zhì)的禽蛋樣品于50 mL 聚丙烯離心管中，先后分別加入1 mL 30%的乙腈溶液、10 mL 乙腈氨水混合液（98:2），渦旋使之充分混合，振蕩萃取15 min，4℃條件下8 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 聚丙烯離心管中；重復(fù)提取1 次，合并上清液待用。

ASE 方法：稱(chēng)取2.0 g（精確至0.01 g）均質(zhì)的禽蛋樣品放于研缽中，加入適量硅藻土研磨均勻。充分研磨后，裝入22 mL 萃取池中并填滿，設(shè)定萃取溫度為80℃，萃取壓力為1 500 psi，萃取時(shí)間為5 min。沖洗溶劑為乙酸乙酯氨水混合液（98:2），用量約為40%的池體積，每個(gè)樣品之間自動(dòng)沖洗1 次，氮?dú)獯祾邥r(shí)間60 s，靜態(tài)循環(huán)萃取2 次，萃取液收集于60 mL 收集瓶。

1.4.2 樣品的凈化 禽蛋樣品經(jīng)LLE 或ASE 處理后，收集萃取液經(jīng)離心濃縮儀濃縮近干。再加入1 mL 乙腈，渦旋震蕩溶解殘?jiān)蠹尤?0 mL 乙腈飽和的正己烷除脂，渦旋震蕩1 min 后靜置5 min，棄去上層正己烷，重復(fù)去脂1 次。50℃條件下離心濃縮儀上將萃取液吹干，用2 mL 乙腈水溶液（36:64）復(fù)溶溶解殘?jiān)?，渦旋1 min 后以12 000 r/min 離心15 min，過(guò)0.22 μm 聚偏氟乙烯（PVDF）針式濾器，濾液供UPLC-FLD 檢測(cè)。

1.4.3 液相色譜-熒光條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流 動(dòng)相A：0.005 mol/L 的NaH2PO4溶液（內(nèi)含0.003 mol/L十二烷基硫酸鈉和0.05%的三乙胺，用85% H3PO4調(diào)pH 至5.3±0.1），流動(dòng)相B：乙腈，等度洗脫：A:B=64:36；流速：0.2 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量：10 μL。激發(fā)波長(zhǎng)229.8 nm，發(fā)射波長(zhǎng)285.3 nm，增益為1，掃描速率為5，時(shí)間常數(shù)模式為正常模式。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取適量的禽蛋空白樣品提取液添加一定濃度的TAP 標(biāo)準(zhǔn)溶液，使對(duì)應(yīng)雞蛋中TAP 的添 加濃度為9.7、20.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0 μg/kg，鴨蛋中TAP 的添加濃度為9.9、20.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0 μg/kg，鵝蛋 中TAP的添加濃度為9.8、20.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0 μg/kg，并將上述各濃度樣品進(jìn)行UPLC-FLD 檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.5 樣品回收率測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)?。?.0±0.02）g 勻漿好的空白禽蛋樣品，將樣品與硅藻土研磨均勻成粉末狀后，向其中加入TAP 標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，使雞蛋中TAP 添加濃度為9.7、25、50、100 μg/kg，鴨蛋中TAP 添加濃度為9.9、25、50、100 μg/kg，鵝蛋中TAP 添加濃度為9.8、25、50、100 μg/kg，每組設(shè)定6 個(gè)平行，再供UPLC-FLD 檢測(cè)，最后代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得濃度，并計(jì)算樣品回收率。

1.4.6 精密度測(cè)定 在同一天的不同時(shí)間點(diǎn)用同一臺(tái)儀器和同一條標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)4 個(gè)添加濃度分別進(jìn)行6 次樣品測(cè)定，求出日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。在1 周內(nèi)的不同天、用不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線（每天都繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線）、同一臺(tái)儀器同樣方法求出日間RSD。

1.4.7 檢測(cè)限和定量限測(cè)定 用空白基質(zhì)液逐級(jí)降低低濃度的TAP 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用已有的UPLC-FLD 方法進(jìn)行分析，每個(gè)濃度分析3 次，得出信噪比（S/N）平均值，得出方法對(duì)應(yīng)檢測(cè)限（Limit of Detection，LOD）和定量限（Limit of Quantitation，LOQ）。

2 結(jié)果

2.1 色譜圖 以雞蛋為例，圖1為T(mén)AP 標(biāo)準(zhǔn)品、空白雞蛋、雞蛋加標(biāo)色譜圖。在超高效液相色譜條件下，TAP 與干擾雜質(zhì)實(shí)現(xiàn)較好的分離，峰形對(duì)稱(chēng)且保留時(shí)間在1.50 min 左右，與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖目標(biāo)化合物的保留時(shí)間接近。

2.2 激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)譜圖 將25 μg/kg TAP 加標(biāo)禽蛋樣品基質(zhì)液通過(guò)熒光掃描，進(jìn)一步優(yōu)化目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)，確定在本試驗(yàn)條件下的目標(biāo)物質(zhì)的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。最終選擇激發(fā)波長(zhǎng)為229.8 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為285.3 nm。在此波長(zhǎng)下既保證了目標(biāo)物的高響應(yīng)值，又保證無(wú)雜質(zhì)的干擾（圖2）。

2.3 專(zhuān)屬性 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的色譜圖見(jiàn)圖1-A，空白雞蛋的色譜圖見(jiàn)圖1-B，雞蛋中陽(yáng)性添加（添加量為25 μg/kg）色譜圖見(jiàn)圖1-C。如圖1 可知，空白雞蛋中不含干擾測(cè)定的物質(zhì)；陽(yáng)性添加樣品中，目標(biāo)物保留時(shí)間在1.5 min左右，且峰形良好。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限和定量限 配制一系列甲砜霉素的標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度，添加到上述樣品前處理方法處理好的空白禽蛋中，最終在空白禽蛋中TAP 的添加濃度為L(zhǎng)OQ、20.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0 μg/kg，依次進(jìn)行UPLC-FLD 測(cè)定。以試樣加藥濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照1.4 中建立的方法進(jìn)行添加實(shí)驗(yàn)，按照信噪比（S/N）為3 確定LOD，按S/N為10 確定LOQ，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 精密度與回收試驗(yàn) 分別稱(chēng)量空白雞蛋、鴨蛋和鵝蛋樣品，進(jìn)行甲砜霉素的1 倍LOQ、0.5 倍最高殘留限量（Maximum Residue Limit，MRL）、1 倍MRL 和2倍MRL 這4 個(gè)濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，并且每個(gè)濃度水平進(jìn)行6 次平行實(shí)驗(yàn)，分別考察3 d，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算回收率，并用RSD 評(píng)價(jià)日內(nèi)、日間精密度，LLE 和ASE 2 種樣品前處理方法測(cè)定的結(jié)果見(jiàn)表2 和表3。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 本研究測(cè)定了甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液在-75℃下放置5 個(gè)月，每月測(cè)定1 次；4℃下放置1、5、10、15、20、25、30 d；25℃（室溫）下放1、5、10、15、20、25 h，進(jìn)行穩(wěn)定性考察。結(jié)果表明，在-75℃下，可以穩(wěn)定保存5 個(gè)月；4℃下，可以穩(wěn)定保存1 個(gè)月；在25℃（室溫）下可穩(wěn)定保存20 h。

2.7 實(shí)際樣品分析 本研究建立的測(cè)定禽蛋中TAP 的加速溶劑萃取-超高效液相色譜-熒光法可成功應(yīng)用于實(shí)際樣品分析中。對(duì)揚(yáng)州附近農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)中的雞蛋、鴨蛋和鵝蛋各40 個(gè)進(jìn)行抽樣測(cè)試，尚未檢出TAP 殘留。同時(shí)，在母雞產(chǎn)蛋期間，飼喂含有50 μg/kg TAP 的飼料2 周后收集1 周的雞蛋。按照本試驗(yàn)中1.1 和1.4 的方法進(jìn)行樣品收集和前處理，再經(jīng)UPLC-FLD 進(jìn)行檢測(cè)分析，成功檢測(cè)出質(zhì)量濃度為15～32 μg/kg。

3 討 論

3.1 色譜條件的優(yōu)化 本研究中流動(dòng)相體系采用乙腈-0.005 mol/L 的NaH2PO4溶 液（內(nèi) 含0.003 mol/L十二烷基硫酸鈉和0.05% 的三乙胺，用85% H3PO4調(diào)pH 至5.3±0.1，乙腈黏度較小，可以有效降低色譜體系壓力。流動(dòng)相中加入三乙胺可以消除色譜柱填料表面硅羥基作用，同時(shí)將流動(dòng)相的pH 調(diào)至5.3±0.1 以抑制解離，改變TAP 的峰形，減少峰拖尾現(xiàn)象[6]。通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的比例改變流動(dòng)相極性和離子強(qiáng)度，從而使目標(biāo)物與雜質(zhì)很好地分離。當(dāng)乙腈比例從20%調(diào)節(jié)到50%時(shí)，目標(biāo)物的出峰時(shí)間縮短；當(dāng)乙腈比例為40% 時(shí)，目標(biāo)物與雜質(zhì)峰重疊，無(wú)法檢測(cè)；當(dāng)乙腈比例為36% 時(shí)，目標(biāo)物與雜質(zhì)峰完全分離，峰形尖銳，可用于檢測(cè)禽蛋中TAP 殘留。在優(yōu)化好的熒光檢測(cè)和流動(dòng)相、等度洗脫程序條件下，TAP 能夠很好地在雞蛋、鴨蛋、鵝蛋中分離，檢測(cè)時(shí)間短，且峰形好。

表1 禽蛋中甲砜霉素基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量限和檢測(cè)限

表2 禽蛋中甲砜霉素檢測(cè)的回收率和精密度（LLE）（n=6）

表3 禽蛋中甲砜霉素檢測(cè)的回收率和精密度（ASE）（n=6）

3.2 提取條件的優(yōu)化 乙酸乙酯:乙腈:氨水（49:49:2）[6-7]、乙酸乙酯:氨水（98:2）[8,15]和乙腈:氨水（98:2）作為樣品前處理方法常用的提取劑，不僅可以從禽蛋樣品中提取TAP，還可以對(duì)禽蛋產(chǎn)生沉淀蛋白作用。通過(guò)比較試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上述3 種提取劑均能萃取出目標(biāo)物，而乙腈的去蛋白效果更好，禽蛋中最主要的干擾物質(zhì)就是蛋白質(zhì)，為了獲得更好的檢測(cè)效果，最終選擇乙腈∶氨水（98:2）作為提取劑。本研究采用LLE 和ASE 2 種方法對(duì)禽蛋樣品進(jìn)行處理，方法回收率均能滿足歐盟方法要求。在先前研究的基礎(chǔ)上[6-7]，LLE 方法進(jìn)行重新選擇了乙腈:氨水（98:2）作為提取劑。本研究重點(diǎn)優(yōu)化了ASE 方法的各項(xiàng)參數(shù)。ASE 的壓力條件一般在10.3 MPa左右，改變壓力對(duì)目標(biāo)物的回收率影響很小[18]。本試驗(yàn)研究了不同提取溫度（40、60、80、100、120℃）對(duì)目標(biāo)物提取回收率的影響，結(jié)果表明，80℃為最佳的提取溫度，在此溫度下目標(biāo)物的響應(yīng)值最高，萃取效果最佳。同時(shí)，研究還比較了不同的靜態(tài)萃取時(shí)間（2、3、5、8 min）和萃取次數(shù)（1 次和2 次）對(duì)目標(biāo)物提取回收率的影響，結(jié)果表明，5 min為最佳靜態(tài)萃取時(shí)間，萃取回收率最高；萃取2 次比1 次更加徹底，目標(biāo)物的回收率更高。萃取劑的體積為40% 的池體積時(shí)，目標(biāo)物可以充分萃取出來(lái)，因此沒(méi)必要再增加萃取劑的用量。綜上所述，最終確定ASE 的提取條件：80℃，10.3 MPa，40%的池體積，靜態(tài)萃取5 min，靜態(tài)萃取2 次。

3.3 與已有方法的比較 禽蛋樣品經(jīng)過(guò)LLE 方法前處理后，在1 LOQ、0.5 MRL、1 MRL 和2 MRL 4 個(gè)濃度水平，禽蛋中甲砜霉素的回收率均在82.9%～94.5%，日內(nèi)RSD、日間RSD 均小于5.9%；禽蛋樣品經(jīng)過(guò)ASE 方法前處理后，在LOQ、0.5 MRL、1 MRL 和2 MRL 4個(gè)濃度，禽蛋中甲砜霉素的回收率均在85.6%～95.3%，日內(nèi)RSD、日間RSD 均小于5.4%。與LLE 方法相比，ASE 方法樣品回收率和精密度高一些，同時(shí)ASE方法自動(dòng)化、耗時(shí)短和消耗試劑少，有利于批量處理樣品。另外，本研究樣品出峰時(shí)間1.5 min 較謝愷舟等[6]研究的4.28 min 早了許多，有利于節(jié)約檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率且減少溶劑的浪費(fèi)。本研究加標(biāo)回收率為82.9%～95.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.0% 以內(nèi)，檢測(cè)效果較前人研究均有較大提升，證明了本研究方法的優(yōu)越性。

3.4 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià) 在實(shí)際樣品分析中，基質(zhì)效應(yīng)不可避免，只能通過(guò)多種方法降低，例如優(yōu)化前處理方法、優(yōu)化色譜條件、稀釋進(jìn)樣濃度、減少進(jìn)樣體積等。本研究?jī)?yōu)化了提取條件及色譜條件，并采用空白基質(zhì)添加的方法盡可能降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度的影響。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)ASE 樣品前處理方法的萃取溶劑、萃取溫度、萃取時(shí)間及次數(shù)等多方面進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，并結(jié)合超高效液相色譜-熒光法進(jìn)行了禽蛋中甲砜霉素殘留檢測(cè)分析；同時(shí)與傳統(tǒng)的液-液萃取方法進(jìn)行了比較，該方法不僅具有消耗試劑少、耗時(shí)短以及適合批量處理樣品等優(yōu)勢(shì)，而且操作簡(jiǎn)單、自動(dòng)化、回收率和精密度高、準(zhǔn)確可靠，適用于禽蛋中甲砜霉素的快速篩查、定性篩選和定量測(cè)定。