基于高通量測(cè)序挖掘功能lncRNA 在豬中的研究進(jìn)展

吳垚群 ，周剛剛，王相國(guó)，齊曉龍，盛熙暉，倪和民，郭 勇，王楚端，郭建軍，邢 凱*

（1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2.國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局，北京，100088；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；4.北京雄特牧業(yè)有限公司，北京 100101）

現(xiàn)有研究表明人類基因組能夠轉(zhuǎn)錄的基因大約有83.5%，然而能編碼蛋白質(zhì)的只占其中的1%～3%[1-2]。基因組中存在著大量非編碼RNA 基因，此部分基因以前被人類認(rèn)為是無(wú)用的，而隨著對(duì)RNA 的研究不斷深入，逐漸認(rèn)識(shí)到非編碼RNA 基因在動(dòng)物生命活動(dòng)過(guò)程中扮演著非常重要的角色。以往對(duì)復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程調(diào)控機(jī)制的研究大多數(shù)局限于基因組上的編碼部分，而針對(duì)基因組上大量存在的非編碼部分的研究很少。近年來(lái)，隨著高通量基因組測(cè)序技術(shù)快速發(fā)展，大量研究表明基因組的非編碼部分在調(diào)控生物學(xué)過(guò)程中同樣發(fā)揮重要作用[3]。非編碼RNA 基因中一個(gè)非常重要的組成部分是長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long Noncoding RNAs，lncRNA）。目前，研究者們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到lncRNA 在動(dòng)物復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程中有著很重要的作用，也越來(lái)越重視lncRNA 在各種動(dòng)物中的研究。本文簡(jiǎn)述lncRNAs 并對(duì)與豬經(jīng)濟(jì)性狀、繁殖性狀以及疾病等方面相關(guān)lncRNAs的研究進(jìn)行綜述，以期為進(jìn)一步探索研究lncRNAs 對(duì)豬相關(guān)性狀的影響。

1 lncRNA 簡(jiǎn)述

2002 年，lncRNA 由Okazaki 等[4]在對(duì)小鼠的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序過(guò)程中首次發(fā)現(xiàn)。最初，lncRNA 被研究人員認(rèn)為是“轉(zhuǎn)錄噪聲”而不被重視，隨著對(duì)其功能的研究增加，對(duì)lncRNA 的認(rèn)識(shí)也逐步改善。

1.1 lncRNA 的結(jié)構(gòu) lncRNA 是一類RNA 分子，其核苷酸序列長(zhǎng)度大于200 nt，蛋白質(zhì)編碼能力很弱甚至不存在。大部分真核生物lncRNA 是由RNA 聚合酶II轉(zhuǎn)錄形成，具有典型的多聚腺苷酸化信號(hào)位點(diǎn)，部分lncRNA 具有5' 端帽子結(jié)構(gòu)和3' 端PolyA 尾結(jié)構(gòu)，且lncRNA 在物種之間相對(duì)于蛋白編碼基因保守性較低[5]，lncRNA 基因具有與蛋白編碼基因相似剪接信號(hào)的多外顯子組合物，因此可以剪接成具有不同功能結(jié)構(gòu)和表型的不同種型[6]。然而，它們通常包含有比蛋白編碼基因更少且稍長(zhǎng)的外顯子[7-8]。lncRNA 是一類位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中具有功能性的RNA 分子[9]，具有保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在組織中的表達(dá)具有時(shí)空特異性。

1.2 lncRNA 的分類 測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步產(chǎn)生了大量新的轉(zhuǎn)錄物，新轉(zhuǎn)錄本需要進(jìn)行分類和功能注釋。

1.2.1 根據(jù)lncRNA 長(zhǎng)度分類 200 nt 的長(zhǎng)度是用于區(qū)分大或長(zhǎng)ncRNA 與小或短ncRNA 的界線，然而，lncRNA 的長(zhǎng)度差異很大，超過(guò)10 kb 長(zhǎng)度的屬于非常長(zhǎng)的基因間（vlinc）RNA 和宏lncRNA。這些轉(zhuǎn)錄本具有一些特殊的特征，使它們與其他lncRNA 區(qū)別開(kāi)來(lái)：它們很少或沒(méi)有剪接、3'端多聚腺苷酸化較弱、由特定的基因組位點(diǎn)產(chǎn)生。大多數(shù)vlincRNA 位于相鄰或相反鏈上的蛋白編碼基因啟動(dòng)子附近，并發(fā)揮鄰近基因轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)因子順式作用。宏lncRNA 通常與蛋白編碼基因反義，并且以原始親本特異性方式從印跡簇產(chǎn)生。宏lncRNAs 可通過(guò)其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物觸發(fā)表觀遺傳染色質(zhì)修飾或通過(guò)轉(zhuǎn)錄干擾機(jī)制沉默附近的印跡基因[10]。

1.2.2 根據(jù)蛋白編碼基因與lncRNA 位置分類 根據(jù)基因內(nèi)lncRNA 與蛋白編碼基因的位置關(guān)系，可以分為反義、雙向、內(nèi)含和重疊意義的lncRNA。反義lncRNAs（asRNAs 或ancRNAs）最初在單基因研究中被發(fā)現(xiàn)，但最近熱門(mén)的RNA-seq 技術(shù)確定了其具有真核生物轉(zhuǎn)錄組常見(jiàn)的全基因組特征[11-13]，其可調(diào)節(jié)來(lái)自其他基因組位置的非配對(duì)基因的表達(dá)[14-16]。最近有研究表明，與lincRNA 和內(nèi)源性lncRNA 相比，asRNA 的表達(dá)特異性和穩(wěn)定性更高[17]。由于與正義鏈配對(duì)的mRNA 或前mRNA 的序列具有互補(bǔ)性，因此可以通過(guò)RNA-RNA配對(duì)來(lái)發(fā)揮作用，從而確保特異性靶向asRNA 的調(diào)節(jié)活性。雙向lncRNA 源自蛋白編碼基因鏈的相反鏈，并且轉(zhuǎn)錄物與成對(duì)的蛋白編碼基因鏈的5' 區(qū)不發(fā)生重疊或僅部分重疊[18-19]。目前，雙向lncRNA 的數(shù)量被大大低估，一方面是因?yàn)榛蚪M中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和啟動(dòng)子位置不確定，另一方面是ncRNA 的高度不穩(wěn)定性使其難以被檢測(cè)。內(nèi)含子lncRNA 來(lái)源于蛋白編碼基因內(nèi)含子，可能是獨(dú)立的特殊轉(zhuǎn)錄物，也可能是前mRNA 加工的副產(chǎn)物，其包括從去分支中脫出的環(huán)狀內(nèi)含子產(chǎn)生的內(nèi)含子（Ci）RNA[20]和從內(nèi)含子中產(chǎn)生的帶有2個(gè)嵌入的noRNA 基因的sno-incRNAs[21]，這些內(nèi)含子lncRNA 可以通過(guò)在轉(zhuǎn)錄基因座附近積累來(lái)正調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄或剪接。重疊意義lncRNA 包括外顯子或包含內(nèi)含子的整個(gè)蛋白編碼基因，沒(méi)有任何意義上的外顯子重疊，并且在相同意義方向上轉(zhuǎn)錄。

1.2.3 根據(jù)特定DNA 調(diào)控元件和基因座內(nèi)的lncRNA 亞基進(jìn)行分類 除蛋白編碼基因外，哺乳動(dòng)物基因組含有數(shù)萬(wàn)種假基因，眾多假基因在整個(gè)生物進(jìn)化過(guò)程中失去了編碼潛力。重要的是，它們中的許多在正義和反義方向上都轉(zhuǎn)錄為lncRNA。鑒于與親本基因序列的高度相似性，假基因產(chǎn)生的lncRNA 可以通過(guò)RNA-RNA 配對(duì)來(lái)調(diào)節(jié)蛋白編碼基因的表達(dá)、作為miRNA 海綿、產(chǎn)生內(nèi)源性siRNAs 或與mRNAs 相互配對(duì)[22-24]。超保守區(qū)域是在人、小鼠和大鼠等物種間表現(xiàn)出100%DNA 序列保守性的基因組區(qū)段，比如人類基因組中包含基因內(nèi)（39%）、內(nèi)含子（43%）和外顯子（15%）序列中的481 個(gè)超保守區(qū)域[25]，這些區(qū)域被廣泛轉(zhuǎn)錄為T(mén)-UCR lncRNA[26-27]。端粒是染色體末端的保護(hù)性核蛋白結(jié)構(gòu)，在所有真核生物中轉(zhuǎn)錄成含有非編碼端粒重復(fù)序列的RNA-TERRA，該轉(zhuǎn)錄物家族以細(xì)胞周期依賴性方式從Watson 和Crick 鏈中產(chǎn)生[28-29]。最新研究發(fā)現(xiàn)，包括人類在內(nèi)的不同真核生物在從有絲分裂晚期到早期G1期間，著絲粒重復(fù)序列被積極轉(zhuǎn)錄成lncRNAs[30]，著絲粒lncRNA 與不同的著絲粒特異性核蛋白組分發(fā)生物理性結(jié)合，使動(dòng)粒能夠正確組裝并維持著絲粒的完整性。核糖體（r）DNA 位點(diǎn)由rRNA 基因反義RNA 聚合酶II轉(zhuǎn)錄為被稱作PAPAS（啟動(dòng)子和前rRNA 反義）的一個(gè)lncRNAs 群體，其在靜止的細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)，并觸發(fā)組蛋白H4K20 甲基轉(zhuǎn)移酶Suv4-20h2 向核糖體RNA 基因募集，用于組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄沉默[31]，PAPAS 還允許異染色質(zhì)形成和抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的基因沉默。增強(qiáng)子衍生的lncRNA（eRNA）的終止取決于整合子復(fù)合物，其確保了3′末端轉(zhuǎn)錄物的剪切。啟動(dòng)子相關(guān)lncRNA 在啟動(dòng)子區(qū)域在正、反義方向轉(zhuǎn)錄，并與基因的5′端部分重疊[32]，此類轉(zhuǎn)錄物包括高度不穩(wěn)定的PROMPT（啟動(dòng)子上游轉(zhuǎn)錄物）和上游反義RNA（uaRNA）[33-35]。uaRNA 內(nèi)存在一個(gè)剪接的內(nèi)含子 NAS 可促進(jìn)基因循環(huán)，使終止因子在雙向啟動(dòng)子附近終止，從而確保RNA 聚合酶II 對(duì)蛋白編碼基因的定向性[36]。

1.2.4 根據(jù)lncRNA 功能分類 通常，根據(jù)功能對(duì)lncRNA進(jìn)行分類，其典型的生物學(xué)分子活動(dòng)主要有支架、引導(dǎo)、誘餌、核糖激活劑、海綿和小ncRNA 前體。lncRNA支架在RNP 復(fù)合物的裝配中起作用。lncRNAs 的結(jié)構(gòu)可塑性使它們具有復(fù)雜且動(dòng)態(tài)的三維結(jié)構(gòu)，對(duì)蛋白質(zhì)具有高度親和力[37]。支架通常是基因表達(dá)調(diào)控的表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄控制的參與者，相對(duì)于其轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)，支架以反式或順式起作用[38]。構(gòu)建型lncRNAs 是lncRNA 支架的一個(gè)亞類，對(duì)于特定核亞結(jié)構(gòu)的組裝是必不可少的[39]，其高度富集的重復(fù)序列可能產(chǎn)生復(fù)雜的RNA 折疊結(jié)構(gòu)，對(duì)其支架功能具有至關(guān)重要的作用，能夠?qū)⒄{(diào)節(jié)蛋白隔離，引導(dǎo)RNP 復(fù)合物到達(dá)特定的染色質(zhì)位點(diǎn)，從而改變基因表達(dá)。誘導(dǎo)型lncRNA 具有變構(gòu)修飾、抑制催化活性、阻斷結(jié)合位點(diǎn)、發(fā)揮核糖核酸抑制劑的作用，除此之外lncRNA 還可以作為核糖核酸激活劑，對(duì)蛋白質(zhì)功能激活或增強(qiáng)蛋白質(zhì)活性至關(guān)重要。另一個(gè)亞類是lncRNA 轉(zhuǎn)錄共激活因子，也稱為激活ncRNA（ncRNA-a），具有增強(qiáng)子樣特性[40]。競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNAs，也被稱為lncRNA 海綿，以lncRNAs 和circRNAs為代表，與蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄本部分序列相似，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)miRNA 結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄后控制來(lái)發(fā)揮作用[41]。許多l(xiāng)ncRNAs 攜帶小RNA 基因作為小ncRNA的前體，參與RNAi 通路（pi/siRNAs）的作用過(guò)程。部分piRNA 簇被發(fā)現(xiàn)映射到lncRNA 基因上，主要位于外顯子，也可出現(xiàn)在富含移動(dòng)元件的非外顯子區(qū)域，從而構(gòu)成特定的pi-lncRNA 前體[42]。內(nèi)含子siRNA 可以通過(guò)lncRNA 基因內(nèi)的反向重復(fù)序列產(chǎn)生，也可以從任何反義基因轉(zhuǎn)化而來(lái)的雙鏈lncRNA 前體中產(chǎn)生[43-44]。

1.3 lncRNA 的作用機(jī)制 lncRNA 作為基因表達(dá)的重要調(diào)控分子，可以通過(guò)多種作用機(jī)制，從轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平以及染色質(zhì)水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控生命活動(dòng)[45]。

1.3.1 lncRNA 在轉(zhuǎn)錄水平的作用機(jī)制 lncRNA 在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制是影響基因表達(dá)過(guò)程中最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，其發(fā)揮調(diào)控作用機(jī)制的方式包括調(diào)控相鄰蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄、與轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、與蛋白形成復(fù)雜復(fù)合物調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄等。例如lncRNA 可以作為DNA 功能元件并與轉(zhuǎn)錄因子競(jìng)爭(zhēng)從而影響相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，一個(gè)典型例子是GAS5（生長(zhǎng)停滯特異性5）可以通過(guò)模擬其基因組DNA 糖皮質(zhì)激素響應(yīng)元件（GRE）而充當(dāng)糖皮質(zhì)激素受體（GR）的誘餌。GAS5與GR 的相互結(jié)合從而阻止GR 與GRE 結(jié)合，最終抑制GR 調(diào)節(jié)的基因表達(dá)，從而影響許多細(xì)胞功能，如代謝、細(xì)胞存活和對(duì)凋亡刺激的反應(yīng)等[46]。lncRNA 可作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)蛋白復(fù)合體的支架，來(lái)控制復(fù)合體的正常生物學(xué)功能，如HOTAIR 可以識(shí)別許多靶標(biāo)，通過(guò)在細(xì)胞核中與PRC2 或0Lsd1 或REST 或coREST 等復(fù)合物相互作用，將它們靶向特定的基因組位置從而影響組蛋白修飾和基因沉默[47]。lncRNA 還可以作為核蛋白激活劑，對(duì)蛋白質(zhì)功能激活或增強(qiáng)蛋白質(zhì)活性至關(guān)重要，如lnc-DC lncRNA 可以促進(jìn)STAT3 轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化和活化[48]。

1.3.2 lncRNA 在轉(zhuǎn)錄后水平的作用機(jī)制 lncRNA 在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控作用涉及mRNA 加工的不同方面。與小調(diào)控RNAs（如微小RNAs 和小核仁RNAs）類似，主要功能包括與目標(biāo)基因進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，形成RNA 雙鏈發(fā)揮作用，可能影響轉(zhuǎn)錄后水平基因表達(dá)的每一步，包括前體mRNA 加工、剪接、運(yùn)輸、翻譯以及降解。例如反義lncRNAs（asRNA）可以通過(guò)RNARNA 配對(duì)發(fā)揮作用，從而確保特異性靶向asRNA 的調(diào)節(jié)活性。BACE1-as 在阿爾茨海默病患者中高度表達(dá)，可以穩(wěn)定BACE1-mRNA，導(dǎo)致BACE1 編碼的β-分泌酶的表達(dá)增加和β淀粉樣蛋白在腦內(nèi)積累[49]。來(lái)自腫瘤抑制基因PTEN的lncRNA-PTENP1 是首批報(bào)道的具有致癌功能的非編碼miRNA 海綿，PTENP1 能夠與相關(guān)microRNA 結(jié)合，遏制microRNA 與其靶基因的結(jié)合，從而導(dǎo)致其對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制功能喪失[50]。

1.3.3 lncRNA 在染色質(zhì)水平的作用機(jī)制 lncRNA 可以通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞核組織來(lái)影響表觀遺傳的狀態(tài)，某些特定lncRNA 可激活或沉默組蛋白修飾，還可以與染色質(zhì)修飾酶或其他DNA 結(jié)合蛋白的結(jié)合間接的與染色質(zhì)結(jié)合，從而達(dá)到調(diào)控表觀遺傳的作用。例如lncRNA 通過(guò)組蛋白的甲基化和乙?；揎棧谷旧|(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。PAPAS 在靜止的細(xì)胞中被誘導(dǎo)表達(dá)，并觸發(fā)組蛋白H4K20 甲基轉(zhuǎn)移酶Suv4-20h2 向核糖體RNA 基因募集，用于組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄沉默[31]。PAPAS 還允許異染色質(zhì)的形成和細(xì)胞生長(zhǎng)抑制基因的表達(dá)沉默。NeST 可以通過(guò)結(jié)合并刺激組蛋白H3 賴氨酸4 甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物亞基的活性，從而導(dǎo)致相關(guān)靶基因的表達(dá)上調(diào)[51]。HOTAIR 可以識(shí)別許多靶標(biāo)，通過(guò)與細(xì)胞核中的PRC2 或0Lsd1 或REST 或coREST 等復(fù)合物相互作用，將它們靶向特定的基因組位置從而影響組蛋白修飾和基因沉默[47]。

2 高通量測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介

高通量測(cè)序技術(shù)又被稱為二代測(cè)序（Next Generation Sequencing,NGS）技術(shù)，第一代DNA 測(cè)序技術(shù)（Sanger法）誕生于1977 年，已經(jīng)有四十多年的歷史。如今，測(cè)序技術(shù)已經(jīng)從第一代發(fā)展到了第三代乃至第四代，測(cè)序技術(shù)日益優(yōu)化，測(cè)序結(jié)果也日益精準(zhǔn)。如今，在測(cè)序的廣大市場(chǎng)中，二代測(cè)序占有很大優(yōu)勢(shì)。高通量測(cè)序技術(shù)將實(shí)驗(yàn)成本和實(shí)驗(yàn)時(shí)間大大縮小，已在多個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，如基因組重測(cè)序、基因組結(jié)構(gòu)變異、全基因組分型、基因挖掘等。

高通量測(cè)序技術(shù)包含3 種主流測(cè)序技術(shù)：Roche/454焦磷酸測(cè)序 （2005 年）、Illumina/Solexa 聚合酶合成測(cè)序（2006 年）、ABI/SOLiD 連接酶測(cè)序（2007 年）。這3 種技術(shù)在不同方面存在差異，包括數(shù)據(jù)產(chǎn)出量及質(zhì)量、單次測(cè)序周期、測(cè)序成本等[52]。其中，Roche/454焦磷酸測(cè)序技術(shù)其測(cè)序讀長(zhǎng)最長(zhǎng)，可達(dá)400 bp 以上，但缺點(diǎn)是單次運(yùn)行的數(shù)據(jù)產(chǎn)出量較低，僅為0.5～1 Gb，比較適合用于未知基因組的從頭測(cè)序。Illumina/Solexa聚合酶合成測(cè)序技術(shù)其測(cè)序讀長(zhǎng)為100 bp 左右，雖然較Roche/454 焦磷酸測(cè)序技術(shù)的測(cè)序讀長(zhǎng)短，但其測(cè)序通量大、結(jié)果較準(zhǔn)確、成本低，常用的Illumina Hiseq2000 測(cè)序平臺(tái)的數(shù)據(jù)產(chǎn)出可以達(dá)到200 Gb/ 次，比較適用于大規(guī)模的基因組測(cè)序等。ABI/SOLiD 連接酶測(cè)序技術(shù)雖然測(cè)序讀長(zhǎng)最短，僅僅為50 bp，但是由于其采用雙堿基編碼原理，測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確率大大提高，特別適用于SNPs 檢測(cè)。

高通量測(cè)序技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)發(fā)生了革命性的改變，單次測(cè)序可對(duì)幾十萬(wàn)條乃至幾百萬(wàn)條DNA 分子進(jìn)行序列測(cè)序。在轉(zhuǎn)錄組水平上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，也稱為RNA-Seq。RNA-Seq 主要用于發(fā)現(xiàn)基因剪切轉(zhuǎn)錄物、轉(zhuǎn)錄后修飾、SNPs 檢測(cè)以及小和長(zhǎng)鏈非編碼RNA 等的研究[53]。RNA-Seq 的研究對(duì)象為特定組織或細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下能夠轉(zhuǎn)錄出的RNA 總和。RNA-Seq 結(jié)果可以分析基因在不同組織中的差異表達(dá)情況、選擇性剪切（Alternative Splicing，AS）、SNPs和基因融合等特征。主要步驟：①建庫(kù)。提取樣品總RNA，利用脫氧核糖核酸酶（DNAaseI）除去樣品中殘留DNA，而后用含多聚體的磁珠對(duì)mRNA 分離純化。純化后的RNA 序列被隨機(jī)打斷成小片段，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。②上機(jī)測(cè)序。一般采用雙向測(cè)序以提高準(zhǔn)確度[54]。③生物信息學(xué)分析。將數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的reads 與參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，進(jìn)行基因表達(dá)注釋、新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)、SNPs[55]以及AS[56]等分析。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序RNA-seq 是基于深度測(cè)序技術(shù)的新一代高通量測(cè)序技術(shù)的代表?，F(xiàn)在科學(xué)家們通過(guò)RNAseq 技術(shù)結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)等方法，在各種家畜中對(duì)lncRNA 展開(kāi)了全面研究。不僅僅用于挖掘新的lncRNA，同時(shí)分析lncRNA 的表達(dá)情況和生物學(xué)功能。

3 豬lncRNA 與經(jīng)濟(jì)性狀

豬的經(jīng)濟(jì)性狀在養(yǎng)豬生產(chǎn)中有著非常重要的地位，主要包括繁殖性狀、生長(zhǎng)性狀以及肉質(zhì)性狀。這些性狀的好壞直接關(guān)系到養(yǎng)豬生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)利益，對(duì)豬經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行遺傳改良將對(duì)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大影響。通過(guò)研究lncRNA 在豬經(jīng)濟(jì)性狀方面發(fā)揮的功能作用，可以為豬育種提供一定的幫助。借助于高通量二代測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，目前已經(jīng)鑒定出相當(dāng)數(shù)量的與豬相關(guān)的lncRNAs。

3.1 lncRNA 在豬繁殖性狀上的研究 繁殖性狀是豬重要的經(jīng)濟(jì)性狀之一，通過(guò)對(duì)繁殖性狀的相關(guān)基因的深入研究，可以為豬育種工作提供一些有用信息，進(jìn)而有效提高豬的繁殖能力。睪丸組織的相關(guān)生物學(xué)過(guò)程直接影響豬的繁殖性狀，已有利用高通量測(cè)序技術(shù)探索不同豬種睪丸組織中差異表達(dá)lncRNA 的研究報(bào)道。2011 年，Anna 等[57]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析在伊比利亞豬和大白豬的睪丸組織中發(fā)現(xiàn)一部分差異表達(dá)的lncRNA 參與精子發(fā)生過(guò)程。2016 年，Ran 等[58]對(duì)豬成熟和未成熟的睪丸組織進(jìn)行高通量測(cè)序分析，一共檢測(cè)到101 個(gè)lncRNA 差異表達(dá)，主要發(fā)生在豬出生前后不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的睪丸組織中，涉及的生物功能包括生精小管直徑變化、生精細(xì)胞和支持細(xì)胞的數(shù)量。2017 年，Weng 等[59]對(duì)豬睪丸組織的發(fā)育過(guò)程進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)lncRNA 及其靶基因在睪丸發(fā)育和精子發(fā)生的代謝途徑中發(fā)揮作用。影響豬繁殖性狀的一個(gè)重要方面是子宮組織和胚胎發(fā)育，相關(guān)研究表明lncRNA 在子宮組織和胚胎發(fā)育過(guò)程中同樣有著重要作用。2017 年，Wang 等[60]在對(duì)豬妊娠期和非妊娠期間的子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行高通量測(cè)序，一共鑒定出34 個(gè)lncRNA 的表達(dá)顯著差異，參與細(xì)胞黏附、結(jié)合、核酸代謝等多種生物學(xué)過(guò)程。2016 年，Li等[61]對(duì)豬胚胎發(fā)育過(guò)程進(jìn)行高通量測(cè)序并對(duì)lncRNA的鑒定和分析，發(fā)現(xiàn)多個(gè)lncRNA 能夠調(diào)節(jié)受精卵的相關(guān)基因表達(dá)，并且和受精卵植入前胚胎發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞周期的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄和代謝機(jī)制相關(guān)。2017 年，馬力鵬[62]通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)梅山豬和杜洛克豬的中等卵泡進(jìn)行l(wèi)ncRNA 的鑒定和分析，結(jié)果得到3 554 個(gè)差異表達(dá)的lncRNA，其中有1 997 個(gè)得到注釋，發(fā)現(xiàn)lncRNA-ENSSSCT00000018610 的潛在靶基因TNIP1、CYP2J2、SCARB1、IBSP等與豬產(chǎn)仔性狀相關(guān)，并且參與豬卵泡發(fā)育過(guò)程，提示其可能通過(guò)對(duì)靶基因的調(diào)控間接參與卵泡發(fā)育過(guò)程。

高通量測(cè)序技術(shù)為研究影響豬繁殖性狀的調(diào)控基因提供了另一個(gè)思路，發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的調(diào)控基因。如果把這些基因用于標(biāo)記輔助選擇（MAS），進(jìn)行豬育種工作，能夠提高豬種的繁殖性狀，進(jìn)而提高豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。

3.2 lncRNA 在豬生長(zhǎng)性狀上的研究 生長(zhǎng)性狀是影響?zhàn)B豬業(yè)效益的關(guān)鍵因素，受到多種因素的影響，包括品種、性別、日常管理、營(yíng)養(yǎng)、疾病控制、遺傳等。提高和改善豬生產(chǎn)性狀一直是研究熱點(diǎn)，也是豬育種工作的重點(diǎn)。我國(guó)地方豬種肉質(zhì)優(yōu)良但生長(zhǎng)緩慢，而國(guó)外引進(jìn)豬種生長(zhǎng)迅速但肉質(zhì)較差，這可能與不同品種間骨骼肌發(fā)育的差異性有很大的關(guān)系。已有研究表明lncRNA 在骨骼肌增殖和分化的過(guò)程中扮演重要角色[63]。隨著高通量技術(shù)發(fā)展，越來(lái)越多的與骨骼肌相關(guān)的lncRNA 被發(fā)現(xiàn)。2009 年，Ren 等[64]在對(duì)通城豬和長(zhǎng)白豬妊娠第90 天的胎兒骨骼肌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn) lncRNATncRNA 在二者胎兒骨骼肌中表達(dá)顯著差異，說(shuō)明lncRNA-TncRNA 可能在胎兒的骨骼肌發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。2015 年，Zhao 等[65]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)豬胎兒的骨骼肌進(jìn)行分析，結(jié)果共鑒定出570 個(gè)lncRNA 作用于豬胎兒骨骼肌發(fā)育過(guò)程，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其中有259 個(gè)lncRNA 位點(diǎn)在其蛋白編碼基因（＜10 kb）附近轉(zhuǎn)錄，這些蛋白編碼基因主要作用于發(fā)育過(guò)程、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和生物合成過(guò)程。2017 年，Xing 等[66]研究了閹割對(duì)豬肌肉發(fā)育的影響，構(gòu)建了閹割和非閹割淮南公豬背最長(zhǎng)肌轉(zhuǎn)錄組圖譜，結(jié)果顯示有8 946 個(gè)lncRNAs 的表達(dá)受到閹割影響，其中有385 個(gè)lncRNAs 及其靶基因可能參與雌激素受體信號(hào)通路以及骨骼和肌肉的發(fā)育過(guò)程。2017 年，Sun 等[67]通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)將長(zhǎng)白豬和藍(lán)塘豬背最長(zhǎng)肌組織中l(wèi)ncRNA 的表達(dá)譜進(jìn)行了分析，結(jié)果共鑒定出5 566 個(gè)lncRNA 的表達(dá)顯著差異，同時(shí)鑒定出有19個(gè)lncRNA 參與到由miRNA 介導(dǎo)的多種海綿調(diào)控因子參與的調(diào)控過(guò)程。這些調(diào)控因子均與肌肉發(fā)育相關(guān)，為不同品種間肌肉發(fā)育的研究提供有用信息。2019 年，Shen 等[68]通過(guò)RNA-seq 技術(shù)對(duì)慶余豬和杜洛克豬的骨骼肌進(jìn)行l(wèi)ncRNA 的表達(dá)分析，結(jié)果鑒定出911 個(gè)差異表達(dá)的lncRNA，參與氧化還原過(guò)程，糖酵解過(guò)程和脂肪酸代謝等代謝途徑，都與氧化和糖酵解肌肉之間的不同表型密切相關(guān)，這些研究結(jié)果可能會(huì)從表觀遺傳學(xué)的角度增進(jìn)對(duì)肌肉代謝和發(fā)育的理解。

目前，一些與不同品種豬骨骼肌發(fā)育相關(guān)的差異表達(dá)的lncRNA 已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，這些基因的鑒定及其分子遺傳機(jī)制的闡明可以幫助人們分析影響豬種間性狀差異的原因。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析可以比較分析地方豬和國(guó)外豬種之間的骨骼肌lncRNA 轉(zhuǎn)錄組水平，并篩選出差異表達(dá)的lncRNA，進(jìn)而從轉(zhuǎn)錄組水平探究影響骨骼肌差異表達(dá)的分子機(jī)制。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和研究?jī)?nèi)容的深入，相信這種分子機(jī)制將會(huì)越來(lái)越明確。

3.3 lncRNA 在豬肉質(zhì)性狀上的研究 豬肉是中國(guó)居民主要的肉類食品來(lái)源，在中國(guó)居民肉類消費(fèi)中占60%以上，其產(chǎn)量在肉類產(chǎn)量中占有主導(dǎo)的地位。隨著居民對(duì)健康的要求日益增高，使得肌內(nèi)脂肪含量指標(biāo)得到極大的重視，而肌內(nèi)脂肪含量及其脂肪酸組成與豬肉的嫩度、多汁性和風(fēng)味高度相關(guān)，因此研究豬的脂肪代謝有利于改善胴體和肉質(zhì)性能。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有很多通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)脂肪型和瘦肉型豬種在肉質(zhì)等性狀進(jìn)行差異表達(dá)分析，取得了很大的研究成果。已有利用高通量測(cè)序技術(shù)研究陸川豬、萊蕪豬和金華豬等國(guó)內(nèi)品種和杜洛克豬、大白豬和長(zhǎng)白豬等國(guó)外品種在肉質(zhì)性狀方面的差異。2014 年，Zhou 等[69-70]通過(guò)RNA-seq 技術(shù)對(duì)93 個(gè)豬樣本進(jìn)行l(wèi)ncRNA 表達(dá)譜分析，同時(shí)，還對(duì)lncRNA 在豬脂肪和肌肉組織中的甲基化模式進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)一些lncRNA 在豬脂肪和肌肉組織中均呈現(xiàn)出不同程度的甲基化，表明lncRNA 在影響豬肌肉品質(zhì)中發(fā)揮作用。2017 年，Wang 等[71]通過(guò)RNA-seq 技術(shù)比較分析了閹割和非閹割淮南公豬皮下脂肪組織間的差異表達(dá)基因和lncRNAs，共檢測(cè)到343 個(gè)lncRNAs，其中18 個(gè)lncRNAs 在2 個(gè)組中差異表達(dá)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)lncRNAs 的靶基因可能參與了脂肪酸合成、胰島素敏感性和細(xì)胞因子等信號(hào)通路。為了探究脂肪型豬種和瘦肉型豬種之間的lncRNAs 表達(dá)差異，2018 年，Yu 等[72]分析了陸川豬和杜洛克豬肝臟、肌肉和脂肪組織中的lncRNAs 水平，最終獲得4 868 個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs，通過(guò)與QTL數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)預(yù)測(cè)得到，lncRNA TCONS_00185144 和TCONS_00181156 與長(zhǎng)鏈脂肪酸家族成員6（ELOVL6）共表達(dá)，說(shuō)明ELOVL6可能是其靶基因。2017 年，Huang 等[73]比較分析了萊蕪豬和大白豬皮下脂肪組織的轉(zhuǎn)錄組，檢測(cè)到54 個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs，其中XLOC_014379、XLOC_011279、XLOC_064871、XLOC_019518 和XLOC_013639 可能分別靶向SCD、LPIN1、TRIB3、EGR2 和FABP3 發(fā)揮調(diào)控脂肪沉積的作用。2018 年，Miao 等[74]對(duì)金華豬和長(zhǎng)白豬兩者之間的脂肪組織中的lncRNA 進(jìn)行了鑒定，共發(fā)現(xiàn)了119個(gè)差異表達(dá)的lncRNA，其中參與脂肪沉積和脂肪代謝相關(guān)代謝途徑的lncRNA 有6 個(gè)。2018 年，Sun 等[75]選擇了脂肪型和瘦肉型豬種各3 頭仔豬，分離了它們的肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞，在肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中分4個(gè)階段進(jìn)行了RNA 測(cè)序，最終鑒定出1 932 個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs，并篩選得到了與脂肪合成密切相關(guān)的lnc_000414，該lncRNA 可抑制豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的增殖。

這些研究結(jié)果表明lncRNA 影響豬肉質(zhì)性狀，且在不同豬品種中，影響豬脂肪酸、脂肪沉積和脂肪合成等生物學(xué)過(guò)程。這些研究結(jié)果有助于篩選影響不同品種間肉質(zhì)性狀差異的關(guān)鍵基因，從而可以啟發(fā)育種工作者利用高通量測(cè)序技術(shù)研究中國(guó)地方豬種肉質(zhì)性狀的特異基因，再將這些基因利用分子育種運(yùn)用到實(shí)際生產(chǎn)中，提高豬肉品質(zhì)，打造獨(dú)特的地方品種和豬肉品牌。

4 豬lncRNA 與疾病

研究表明，lncRNA 不僅對(duì)豬的各種性狀具有調(diào)控作用，還可能對(duì)豬的某些疾病具有重要影響。2012 年，Ramayo 等[76]對(duì)豬肝臟組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，研究高脂肪酸和低脂肪酸豬肝臟組織之間的差異，共鑒定出55 個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs，這些lncRNAs 均與脂肪酸的代謝相關(guān)，該研究為豬肝臟組織內(nèi)脂肪酸代謝的相關(guān)疾病提供新的參考。2016 年，Xia 等[77]對(duì)患有由高能量飲食引起的非酒精脂肪性肝炎（NASH）的小型豬進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有多個(gè)lncRNA 差異表達(dá)，同時(shí)可能通過(guò)調(diào)控NASH 相關(guān)靶蛋白編碼基因來(lái)影響NASH 的發(fā)生。2017 年，Xing 等[66]分析了淮南公豬患有睪酮缺乏癥時(shí)相關(guān)基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)lncRNA 及其靶基因可能參與了患有睪酮缺乏癥的豬骨骼肌發(fā)育的相關(guān)調(diào)控途徑。

5 展 望

近些年來(lái)，關(guān)于lncRNA 的研究大都還處于探索階段，其在生物代謝途徑中的作用機(jī)制還沒(méi)有得到一個(gè)清晰的闡述?，F(xiàn)在，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，關(guān)于lncRNA 的研究取得了很大進(jìn)展。高通量測(cè)序手段可以篩選更多的lncRNA，并且利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)lncRNA 的結(jié)構(gòu)特征，通過(guò)原位雜交技術(shù)、過(guò)表達(dá)技術(shù)、RNAi 技術(shù)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段來(lái)研究lncRNA 對(duì)豬的各種生物代謝途徑相關(guān)的調(diào)控作用機(jī)理，了解lncRNA 的生物學(xué)功能，從而可以為研究豬經(jīng)濟(jì)性狀、疾病預(yù)防等方面提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)，同時(shí)為豬的育種工作提供一定的支持。