藏豬FRZB 基因克隆及真核表達載體的構(gòu)建

王志秀，張紅亮，王統(tǒng)苗，梁文雙，張 博，張 浩*

（1.揚州大學動物科學與技術(shù)學院，江蘇揚州 225009；2.西藏自治區(qū)拉薩市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，西藏拉薩 860000；3.中國農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，北京 100193）

藏豬是我國獨特的高原型地方豬種，其長期生活在海拔較高的青藏高原地區(qū)，能適應低氧、低壓、高寒和強輻射環(huán)境，具有耐粗飼、抗逆性強的優(yōu)良特性[1]。分泌型卷曲相關(guān)蛋白3（sFRP3）由FRZB基因編碼，通過競爭性抑制Wnt/beta catenin 信號途徑參與胚胎發(fā)育調(diào)控[2]。FRZB是Wnt 信號通路的負調(diào)控因子，過表達可以抑制前列腺癌PC-3 細胞的成瘤性和生長性，并降低金屬蛋白酶的分泌和活性，具有抑癌基因的作用[3]。在對胃黏膜、大腸黏膜和腫瘤組織FRZB基因表達的檢測中發(fā)現(xiàn)該基因具有腫瘤抑制的功能[4]。FRZB基因也可調(diào)控心臟房室膜墊發(fā)育，通過下調(diào)Wnt-9a 途徑介導的β-catenin 信號發(fā)揮作用[5]。FRZB基因與骨骼的形態(tài)發(fā)生有密切關(guān)系，有研究發(fā)現(xiàn)FRZB基因和Wnt 受體基因的表達均與膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有關(guān)[6]。FRZB基因的突變位點與骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松癥發(fā)生等密切相關(guān)[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)豬FRZB基因位于15 號染色體上，由6個外顯子組成，已鑒定出3 個多態(tài)位點，其表達與肌肉生長呈負相關(guān)，與脂肪沉積呈正相關(guān)[8]。FRZB基因位點多態(tài)性與大白豬背膘厚呈極顯著相關(guān)[9]，并對淮豬新品系的生長性能具有顯著影響[10]。本研究旨在克隆藏豬FRZB基因CDS 序列，構(gòu)建真核表達載體，為后期研究該基因的重要功能及其在細胞增殖、分化方面的機理奠定基礎(chǔ)，也為構(gòu)建FRZB轉(zhuǎn)基因豬提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 藏豬飼養(yǎng)在西藏農(nóng)牧學院實習牧場，6月齡時屠宰，采集新鮮肝臟組織，置于凍存管放入液氮罐中速凍，然后于-80℃冰箱保存，用于總RNA 提取。

1.2 主要試劑 TRIzol、2×PCR Mix、限制性內(nèi)切酶Bgl II 和 Sal I 均購自TaKaRa 公司；DNA 純化回收試劑盒、RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、T4 連接酶購自天根生化科技有限公司；DMEM、Opti-MEM、胰 酶、DMSO、胎 牛 血 清（FBS） 均 購 自Gibco 公司；Lipofectamine 2000、去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（Plasmid Mini Kit Ⅰ）購自Invitrogen 公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pMD18-T、pIRES2-EGFP 載體及C2C12 細胞均由中國農(nóng)業(yè)大學動物遺傳資源實驗室保存提供。

1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank 豬FRZB基因mRNA序列（登錄號：NM_001243330），利用Primer premier 5設(shè)計引物，擴增FRZB基因的完整CDS 區(qū)序列。FRZB引物序列：F： 5'-GAAGATCTATTGTGTCCACTTCCA GGGGT-3'；R：5'-GCGTCGACGTTGCGTGCTTGCC GAGGGTTA-3'，預計擴增產(chǎn)物長1 067 bp，其中下劃線部分分別為Bgl II 和Sal I 酶切位點。引物由華大基因科技股份有限公司合成。

1.4 RNA 提取和cDNA 合成 采用TRIzol 與RNApure Tissue Kit 提取肝臟組織總RNA，用NanoDrop?ND-1000 紫外分光光度計檢測濃度及純度。利用兩步反轉(zhuǎn)法合成cDNA，第一步：5×gDNA Buffer 2μL，Total RNA 7 μL，RNase-Free ddH2O 1μL，42℃孵育3 min；第二步：在第一步產(chǎn)物中依次加入10×Fast RT Buffer 2 μL，RT Enzyme Mix 1 μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μL，RNase-Free ddH2O 5 μL，反應程序為42℃孵育15 min，95℃孵育3 min。

1.5 PCR 反應 以cDNA為模板擴增藏豬FRZB基因CDS 序列。PCR 反應體系20 μL：2×PCR Mix 10 μL，上、下游引物（10 pmol/L）各0.5 μL，cDNA（50 ng/μL）1 μL，RNase-Free ddH2O 8 μL。PCR 反 應 程 序：95 ℃預變性15 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸65 s，35 個循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃結(jié)束反應。取5 μL PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠（1.5%）電泳，檢測產(chǎn)物條帶。

1.6 生物信息分析 對藏豬FRZB基因進行生物信息學分析，利用ExPASy 相關(guān)在線服務(wù)器分析藏豬FRZB編碼蛋白質(zhì)氨基酸組成、理論分子、親水性和等電點等；利用DNAMAN 軟件對預測氨基酸序列進行同源比對；利用MEGA 6 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；利用SWISSMODEL 預測FRZB 蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。

1.7 克隆與測序 將擴增目的片段回收、純化，并TA 克隆至pMD18-T 載體上，連接體系10 μL：Solution 4 μL，pMD18-T 載體1 μL，擴增目的片段5 μL。16℃恒溫過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，并在含有卡那霉素的LB 固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)。挑取單克隆，將其置于含卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，挑取陽性菌落進行擴大培養(yǎng)，送至生工生物工程股份有限公司進行測序。重組質(zhì)粒命名為pMD18-TFRZB。

1.8 真核表達載體的構(gòu)建 將測序正確的菌液提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Bgl II 和Sal I 酶對重組質(zhì)粒pMD18-T-FRZB和質(zhì)粒pIRES2-EGFP 進行雙酶切，分別回收相應片段的酶切產(chǎn)物。利用T4 DNA 連接酶將目的片段與pIRES2-EGFP 骨架載體進行連接，連接體系10 μL：目的片段4 μL、骨架載體4 μL、T4 連接酶1 μL、10×Buffer 1 μL?；靹蚝笾糜?6℃孵育過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選后，挑取單個菌落接種至含卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中，得到重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-FRZB，經(jīng)雙酶切鑒定和PCR 驗證后，將鑒定正確的質(zhì)粒送至生工生物工程股份有限公司進行測序。

1.9 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將生長狀態(tài)良好的C2C12 細胞進行傳代至6 孔細胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞匯合度達70%～80% 時，將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒pIRES2-EGFPFRZB經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到C2C12 細胞中，同時以未轉(zhuǎn)染外源基因的細胞作為陰性對照。48 h 后在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達。

2 結(jié)果

2.1FRZB基因PCR 擴增及序列分析 藏豬FRZB基因PCR 擴增特異性條帶為1 067 bp（圖1），與預期產(chǎn)物長度一致，且無非特異性擴增雜帶。經(jīng)測序證明與豬FRZB基因序列高度一致。

2.2FRZB基因蛋白質(zhì)的生物信息學分析 藏豬FRZB蛋白質(zhì)含有325 個氨基酸，理論分子質(zhì)量為36.16 ku，分子式為C1580H2553N455O465S25，等電點為8.81，總平均親水性為-0.278，表現(xiàn)為親水性。藏豬FRZB 蛋白三級結(jié)構(gòu)預測見圖2，發(fā)現(xiàn)含有多種二級結(jié)構(gòu)單元，有明顯的折疊層次，疏水側(cè)鏈埋藏在分子內(nèi)部，親水側(cè)鏈暴露在分子表面。

藏豬FRZB 蛋白氨基酸序列與GenBank 中狗（XP_025316201.1）、小鼠（NP_035486.1）、綿羊（XP_011987 239.1）、黃牛（NP_776484.1）、馬（XP_001501445.1）和人（NP_001454.2）的同源性依次為91.13%、91.38%、94.46%、96.69%、97.23%和96.92%。由圖3 可知，F(xiàn)RZB基因在不同的動物中具有較高的序列保守性。

2.3FRZB基因真核表達載體的構(gòu)建 將重組質(zhì)粒pMD18-T-FRZB和載體骨架pIRES2-EGFP 雙酶切，產(chǎn)物可見1 067 bp 和5 308 bp 的條帶（圖4），條帶清晰明亮，與預期結(jié)果一致。

切膠回收酶切產(chǎn)物載體骨架pIRES2-EGFP 和FRZB的目的條帶，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化，挑單克隆擴繁，對菌液PCR 擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，結(jié)果如圖5 所示，目的條帶清晰，其大小約為1 067 bp，與預期結(jié)果一致，表明pIRES2-EGFP-FRZB載體構(gòu)建成功。用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取pIRES2-EGFPFRZB真核表達載體。

重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-FRZB的Bgl II 和Sal I 雙酶切結(jié)果如圖6 所示，可見一條1 067 bp 條帶，與目的基因條帶大小一致；另一條約為5 308 bp，與載體骨架大小一致。

2.4 細胞轉(zhuǎn)染 利用Lipofectamine2000 瞬時轉(zhuǎn)染的方法將重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-FRZB轉(zhuǎn)染至C2C12 細胞，培育48 h 后，在熒光顯微鏡下觀察到細胞有綠色熒光（圖7），表明pIRES2-EGFP-FRZB真核表達載體構(gòu)建成功且能轉(zhuǎn)染C2C12 細胞。

3 討 論

Wnt/β-catenin 信號通路在調(diào)控細胞分化、增殖及凋亡中扮演重要角色，同時這一信號通路異常會伴隨動物機體發(fā)育、生長和穩(wěn)態(tài)的異常[11]。分泌型卷曲相關(guān)蛋白家族（sFRPs）有一個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，與卷曲受體的細胞外配體結(jié)合域高度同源，因此，sFRPs可通過隔離Wnt 配體與卷曲受體形成非功能性復合物來抑制Wnt 信號通路[3]，這在胚胎發(fā)育和腫瘤形成等方面發(fā)揮著重要功能[12]。Qin 等[13]在胃癌細胞中發(fā)現(xiàn)敲除FRZB基因能增加細胞的生長和遷移，同時伴隨Wnt/β-catenin 信號通路被激活，將進一步促進胃癌的蔓延。馬玉玲等[14]對人FRZB基因進行克隆，獲得了慢病毒重組表達質(zhì)粒，并研究其在肝癌細胞中的抗癌潛力，發(fā)現(xiàn)慢病毒表達體系對Wnt 信號通路的分子靶向藥物研究具有重要意義。司維柯[15]研究猜測FRZB 可能是一種天然抗腫瘤因子。瞿穎等[16]研究發(fā)現(xiàn)FRZB與胃癌的分化和腸型及彌漫型的發(fā)生相關(guān)，并構(gòu)建FRZB真核表達載體轉(zhuǎn)染人胃癌細胞系SGC-7901 細胞，發(fā)現(xiàn)FRZB基因的高表達能夠抑制腫瘤細胞的增殖、成瘤性和侵襲能力[17]。這充分說明FRZB基因在抑制腫瘤方面具有重要的意義。

目前，豬FRZB基因的研究報道相對較少，已鑒定出豬FRZB基因有3 個多態(tài)位點，其表達分別與肌肉生長呈負相關(guān)[10]、與脂肪沉積呈正相關(guān)[8]、與背膘厚呈極顯著相關(guān)性[9]。藏豬是少有的高原型豬種，生長緩慢，適應性極強，屬典型的地方品種，因具有胴體瘦肉率高、肉質(zhì)細嫩、適口性極好等特點，屬奢侈品消費行列，市場上供不應求。本實驗首次克隆藏豬FRZB基因并成功構(gòu)建真核表達載體，通過對FRZB基因的生物信息學分析發(fā)現(xiàn)FRZB基因在不同家畜物種及進化過程中具有較高的序列保守性，提示FRZB基因潛在的分子功能應用價值很大，尤其是研究耐低氧低壓、高寒強輻射的藏豬，對藏豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展和高原醫(yī)學的研發(fā)具有重要意義。盡管當前FRZB基因調(diào)控豬生長性能的分子機制尚不明確，但構(gòu)建藏豬FRZB基因的真核表達載體能夠為后期研究該基因的重要功能及其在細胞增殖、分化方面的機理奠定基礎(chǔ)，為探索豬肌細胞分化過程中特異基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控和生產(chǎn)轉(zhuǎn)FRZB基因豬提供理論依據(jù)，對挖掘藏豬品種資源的利用具有巨大的開發(fā)指導價值。

4 結(jié) 論

豬FRZB基因在進化過程中的保守性非常穩(wěn)定，本實驗成功構(gòu)建了藏豬FRZB真核表達載體pIRES2-EGFP-FRZB，并在C2C12 細胞中成功表達，為豬生長性能調(diào)控機制方面的研究奠定了基礎(chǔ)。