陳旭杰,羅 明
(南陽市第二人民醫(yī)院1 心血管內科;2 婦產(chǎn)科,河南 473000)
慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是各種心臟疾病的最終結局[1],臨床主要表現(xiàn)為呼吸困難和體液潴留,5 年存活率與惡性腫瘤相仿[2]。有研究表明,miR-21 參與心肌梗死、冠心病等多種心血管疾病發(fā)生過程[3]。組織基質金屬蛋白酶抑制劑-3(tissue matrix metalloproteinase inhibitors,TIMP3)是miR-21 靶基因之一,可導致心肌纖維化[4]。本研究選取 2016 年 4 月—2018 年 6 月我科收治的 114 例CHF 患者,探討血清miR-21、TIMP3 表達情況及其與心肌重構和心功能的相關性,為臨床評估CHF 提供參考指標。
1.1 一般資料 CHF 患者114 例,其中男性54 例,女性 60 例;年齡 38~67 歲,平均 52.38±6.29 歲;按《慢性心力衰竭診斷治療指南》[5]進行心功能分級:Ⅰ~Ⅱ級35 例、Ⅲ級40 例、Ⅳ級39 例。納入標準:(1)符合《慢性心力衰竭診斷治療指南》關于CHF 診斷標準,并經(jīng)心電圖、超聲心動圖、胸部X 線檢查確診;(2)心臟病史 6 個月以上。排除標準:(1)合并肝、腎等多器官衰竭者;(2)入院前30 天內接受介入術治療者;(3)伴有心臟瓣膜病、肺動脈栓塞者。另取同期健康體檢正常者40 例為對照組。所有研究對象簽署參加本研究的知情同意書。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準。
1.2 方法
1.2.1 血清miR-21、TIMP3 mRNA 檢測:抽取研究對象早晨空腹靜脈血5 mL,-4 ℃冷凍離心10 min,分離血清,-80 ℃保存待測。采用qRT-PCR 法測定血清miR-21、TIMP3 mRNA 相對表達量。按Trizol試劑盒說明書操作提取組織總RNA,按miRNA 反轉錄試劑盒操作步驟將2 μg RNA 反轉錄為cDNA,按SYBR Green RCR master mix 試劑說明配置反應體系。qRT-PCR 反應體系 20 μL:SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL,cDNA 2.0 μL,上下游引物各 0.8 μL,ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL,ddH2O 6.0 μL。在熒光定量PCR 儀上進行反應,程序設定:95 ℃預變性 4 min;95 ℃ 15 s ,60 ℃ 30 s,72 ℃ 15 s,共 41個循環(huán),72 ℃終延伸 10 min。miR-21 以 U6 為內參基因,TIMP3 mRNA 以β-actin 為內參基因。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物設計見表1。每個樣品設置3 個平行,對所得數(shù)據(jù)Ct 值進行分析,采用 2-ΔΔCt算法[7]計算 miR-21 和 TIMP3 mRNA 相對表達量。
表1 qRT-PCR 引物序列
1.2.2 超聲心動圖檢測:檢測左室舒張末內徑(LVEDD)、左心房內徑(LAD)、左心室后壁厚度(LVPW)、左室質量指數(shù)(LVMI)、左室重構指數(shù)(LVRI),利用二維上平面法檢測反映心功能的心輸出量(CO)和左室射血分數(shù)(LVEF)。
1.2.3 血清N-末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)檢測:采用武漢明德生物科技有限責任公司試劑盒,免疫層析法檢測血清心衰標志物NT-proBNP 水平。
1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以表示,多組間比較行方差分析,兩組間比較采用t 檢驗,采用Pearson 法進行相關性分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 miR-126 及 TIMP3 表達水平比較 各組間miR-126 表達水平比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);CHF 患者miR-126 表達高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);CHF 心功能各級患者miR-126 表達高于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);隨著心功能分級的提高,miR-126 表達逐漸增加,其中Ⅳ級患者高于Ⅲ級患者,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組間 TIMP3 表達水平比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。CHF 患者 TIMP3 表達低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);CHF 心功能各級患者TIMP3 表達低于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且Ⅳ級<Ⅲ級<Ⅰ~Ⅱ級,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。
表2 各組miR-126 及TIMP3 表達情況
2.2 心肌重構、 心功能及心衰標志物水平比較 與對照組比較,CHF 各級心功能組LVPW、LVMI 升高,CO、LVER、NT-proBNP 降低,Ⅲ級、Ⅳ級LVEDD、LAD 升高,LVRI 降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);CHF 組 LVEDD、LAD、LVPW、LVMI、NT-proBNP 隨心功能分級升高而升高,LVRI、CO、LVER 隨心功能分級降低而降低。見表3。
2.3 血清miR-21 與TIMP3 表達相關性 Pearson相關分析顯示,miR-21 與 TIMP3 呈負相關(r=-0.719,P=0.006)。
2.4 血清miR-21、TIMP3 表達與心肌重構、心功能及心衰標志物相關性 miR-21 與LVEDD、LVPW、NT-proBNP 呈顯著正相關(r=0.624,0.593,0.671,P<0.05),與 LAD 呈一般正相關(r=0.476,P<0.05),與LVMI 無明顯相關性(r=0.193,P>0.05),與 LVRI、CO、LVER 呈顯著負相關(r=-0.624,-0.509,-0.602,P<0.05)。TIMP3 與 LVEDD、LVMI 呈顯著負相關(r=-0.537,-0.596,P<0.05),與 LVPW 呈一般負相關(r=-0.436,P<0.05),與 LVRI、LVER、NT-proBNP 呈顯著正相關(r=0.613,0.674,0.693,P<0.05),與 LAD、CO 無顯著相關性(r=-0.264,0.126,P>0.05)。見表 4。
表4 miR-21、TIMP3 與心肌重構、心功能及心衰標志物相關性分析
CHF 常伴隨呼吸困難、咳嗽、大咯血等癥狀[6-8],其病理機制非常復雜,研究表明心肌重構在其中發(fā)揮重要作用[9]。研究發(fā)現(xiàn),通過藥物增加TIMP3 蛋白表達對心室重構的改善有一定作用[10],CHF 患者血清miR-21 顯著增加[11]。miRNA 參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展進程,其異常表達與疾病診斷、分期、預后密切相關,研究miRNA 與心肌重構的關系具有廣闊前景[12]。miR-21 是心肌細胞分化重要調節(jié)因子,在心肌肥厚中研究已有多年歷史,但其表達存在爭議。張一思等[13]發(fā)現(xiàn),miR-21 在小鼠心臟病模型的成纖維細胞中表達上調,但劉振等研究結果相反,在心衰心肌組織中miR-21 表達下調。miR-21 通過下調其靶基因Spry2,使心肌細胞間產(chǎn)生特異性絲狀連接。本研究結果顯示,CHF 患者血清miR-21 表達水平顯著高于正常組,提示miR-21 可能與CHF 發(fā)生有關。NT-proBNP 是重要心衰標志物,可反映左室舒張功能和瓣膜功能障礙。Pearson 分析顯示,血清miR-21與 LVEDD、LVPW、NT-proBNP 呈顯著正相關,與LAD 呈一般正相關,與 LVRI、CO、LVER 呈顯著負相關,進一步說明血清miR-21 表達水平與心室重構、心衰標志物密切相關。
近年發(fā)現(xiàn),TIMP3 編碼組織金屬蛋白酶抑制物3 蛋白質,鈣蛋白可抑制組織中基質金屬蛋白酶(MMPs),MMPs/TIMP 失衡可導致心室肌間質纖維化,心室肌間質纖維化是由于組織外膠原過度堆積,導致心室變硬,進而影響心臟收縮舒張功能,纖維化程度隨時間而加重[12]。心肌纖維化影響Na+、K+離子通道,導致細胞間電交聯(lián)異常,同時細胞嚴重缺氧。因此,心室肌間質纖維化影響心肌代謝與性能,最終影響心室功能。壓力負荷可使MMPs 升高,正常膠原被MMPs 降解,并被缺乏連接結構的纖維性結構取代,從而室壁變薄,心室擴張,心功能下降。張一思等[13]研究表明,基質金屬蛋白酶表達升高及其抑制物-1 表達下降參與心肌重構的病理過程,是影響心衰患者心功能的重要因素之一。Dai 等[14]通過抑制miR-21 表達,上調TIMP3 表達來抑制心力衰竭,表明miR-21 可通過調控TIMP3,使 MMPs/TIMPs 失衡,造成心肌重構。Villa 等[15]敲除小鼠TIMP3 基因,導致心肌膠原含量下降,左心室?guī)缀涡螤畎l(fā)生改變,造成心肌重構。本研究結果顯示,與體檢健康者相比,CHF 患者血清TIMP3 表達量降低,提示TIMP3可能參與CHF 的發(fā)生進展進程。相關性分析顯示,TIMP3 與 LVEDD、LVMI 呈顯著負相關,與 LVPW 呈一般負相關,與 LVRI、LVER、NT-proBNP 呈顯著正相關,與LAD、CO 無顯著相關性,進一步說明血清TIMP3 表達水平與心室重構、心衰標志物密切相關。miR-21 與 TIMP3 呈負相關,揭示 miR-21 可能通過負調控TIMP3 表達,致使MMPs/TIMPs 失衡,參與心肌重構過程。
綜上所述,CHF 患者血清 miR-21 高表達,TIMP3 低表達,與心肌重構和心功能密切相關。關于miR-21 及TIMP3 在CHF 病理過程中的具體分子機制有待進一步研究。