魔芋葡甘低聚糖對肥胖大鼠高脂血癥及肝損傷的調(diào)節(jié)作用

李浩霞 周中凱 商文婷 莊 敏 趙亞麗

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院 天津300457）

肥胖是一種慢性代謝疾病，在大多數(shù)情況下，是由于長期能量攝入超過能量消耗導(dǎo)致能量失衡，從而使體內(nèi)多余的脂肪積累[1-2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，截止到2016年，全世界約有13%的成年人肥胖（其中男性占11%， 女性占15%），還有超過3.4 億5～19 歲的兒童和青少年超重或肥胖，1975年至2016年間全球肥胖流行率增長近3 倍[3]。日益嚴(yán)重的肥胖問題還會增加患糖尿病、高血壓、心臟病、痛風(fēng)、關(guān)節(jié)炎、睡眠呼吸暫停和癌癥等疾病的風(fēng)險[4-6]。 當(dāng)下人們一直將預(yù)防肥胖和減輕體重的重心放在關(guān)注飲食和加強體育鍛煉上，然而效果并不明顯，而且長期的體育鍛煉很難堅持。此外，治療肥胖的藥理學(xué)方法的發(fā)展一直受到不良療效和嚴(yán)重副作用的困擾[7]。

魔芋（Amurphophallus konjac）在我國已有數(shù)千年的種植栽培和食用歷史，且資源豐富[8-9]。其主要成分是魔芋葡甘聚糖 （konjac glucomannan，KGM），這是一種可溶性膳食纖維，具有抗肥胖、降血糖、改善高膽固醇血癥、潤腸通便、抗炎等功能活性[9-11]。KGM 雖然具有良好的生理功能，但是其膨脹系數(shù)大，溶于水后黏度較高、流動性不好，使得提取困難，提高了生產(chǎn)成本，因此在食品工業(yè)的應(yīng)用中受到限制[12]。 現(xiàn)在越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)其降解產(chǎn)物魔芋葡甘低聚糖（KOS）除了具有較好的理化性質(zhì)和生理功能外， 還具有一些獨特的生理功能[13]，突出表現(xiàn)在促進雙歧桿菌生長、提高機體抗氧化能力、防治高脂血癥、降血脂、護肝、排毒與增強免疫功能等[14]。

目前對于KOS 研究較多的是制備條件和理化性質(zhì)，而關(guān)于KOS 對肥胖模型大鼠抗肥胖作用的報道很少。 本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)的方法建立營養(yǎng)性肥胖大鼠動物模型，觀察KOS 對肥胖大鼠體重、 脂質(zhì)代謝、 氧化應(yīng)激及肝功能方面的影響， 探討其在調(diào)節(jié)肥胖大鼠高脂血癥及肝損傷中可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 新鮮的白魔芋，購買于有中國“魔芋之鄉(xiāng)” 之稱的陜西省安康市嵐皋縣。 葡甘露聚糖酶， 由實驗室分離的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）發(fā)酵制得。 魔芋葡甘低聚糖，以新鮮白魔芋為原料，通過酶解法制備，由天津科技大學(xué)食品學(xué)院糧油科學(xué)與工程研究中心提供，純度在90%以上，含有少量單糖，基本無蛋白質(zhì)等其它成分檢出。

1.1.2 動物和飼料 實驗動物：選用體重80～100 g 的4 周齡健康SD 雄性大鼠為受試對象。 由人民解放軍軍事科學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。 生產(chǎn)許可證編號：SCXK （軍）2012-0004。

基礎(chǔ)飼料配方：粗蛋白≥18.0%，粗脂肪≥4.0%，粗纖維≤5.0%，水分≤10.0%，灰分≤8.0%，鈣1.0%～1.8%。 高脂飼料配方：63.8%基礎(chǔ)飼料，15%豬油，10%蔗糖，1%膽固醇，0.2%膽酸鈉，10%蛋黃粉。干預(yù)飼料：用5% KOS 替代高脂飼料中的基礎(chǔ)飼料，其它相同。

1.1.3 試劑 甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、 丙二醛（MDA）、 超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、 谷丙轉(zhuǎn)氨酶 （ALT）和堿性磷酸酶（AKP）試劑盒，購于南京建成生物工程研究所。

1.2 主要儀器、設(shè)備

YC-015 實驗室噴霧干燥機，上海雅程儀器設(shè)備有限公司；Sorvall ST 8R 高性能通用臺式冷凍離心機， 美 國Ther-mo Fisher 公司；YXQ-LS-75511 立式壓力蒸汽滅菌器， 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Epoch2 酶標(biāo)儀， 美國Bio-Tek公司；Thermo991 超低溫冰箱，美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備 KOS 的制備流程如圖1 所示。

1.3.2 動物實驗設(shè)計 30 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為2 組，基礎(chǔ)飼料組10 只，高脂飼料組20 只。喂養(yǎng)8 周后，將肥胖抵抗型大鼠剔除（高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠中體重低于正常飼料喂養(yǎng)大鼠平均體重20%），然后隨機分為2 組：高脂組（MC）和魔芋葡甘低聚糖干預(yù)組（KOS），連續(xù)干預(yù)6 周。每天記錄各組的食物攝入量， 每周固定時間給大鼠稱重并記錄。試驗期間大鼠均自由攝食和飲水，飼養(yǎng)環(huán)境清潔，溫度22～25 ℃，濕度50%～55%，正常采光。

圖1 KOS 制備流程圖Fig.1 Flow chart of KOS preparation

1.3.3 指標(biāo)及檢測 干預(yù)末禁食不禁水12 h，稱大鼠體重并記錄。 麻醉后股動脈取血，4 ℃5 000 r/min 離心10 min，取上層血清分裝后放于-80 ℃超低溫冰箱貯存。 斷頸處死后立即解剖取出肝臟稱重并計算肝臟指數(shù)。

肝臟指數(shù)（%）=肝質(zhì)量（g）/體重（g）×100

血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、MDA、SOD、GSH-Px、AST、ALT 及AKP 的測定嚴(yán)格按照測試盒說明書操作，每個樣品重復(fù)測3 次，結(jié)果取平均值。

1.3.4 肝組織病理學(xué)觀察 大鼠處死后， 速取肝小葉置于福爾馬林中， 固定24 h 用水沖洗后，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯作透明劑、常規(guī)石蠟包埋處理后切成5 μm 厚薄片，HE 染色， 在顯微鏡下觀察肝切片的形態(tài)學(xué)變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行處理，采用單因素方差分析進行檢驗，P＜0.05 表示具有顯著性差異，P＜0.01 表示差異極其顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 KOS 對肥胖大鼠體重的影響

如表1 所示，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，在建模初各組體重?zé)o顯著性差異， 說明分組是合理的。 建模末，剔除肥胖抵抗大鼠后，高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠體重比基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)的大鼠高20.67%（P<0.01），表明成功建立了肥胖大鼠動物模型， 與之前的報道一致[15-17]。 如圖2a 所示， 從干預(yù)的第3 周開始，KOS 組與MC 組相比，體重出現(xiàn)顯著性差異（P<0.05）。 連續(xù)干預(yù)6 周后，KOS 組比MC 組體重降低8.01%（P<0.05）。 如圖2b 所示， 經(jīng)過6 周的干預(yù)，KOS 組體重增加量與MC 組存在極顯著的差異（P<0.01）。 說明KOS 能有效減緩肥胖大鼠體重的增加。

表1 建模期間大鼠體重Table 1 Body weight of rats during the modeling

圖2 干預(yù)期間體重的變化Fig.2 Changes in body weight during administration

2.2 KOS 對肥胖大鼠血清脂質(zhì)組成的影響

表2 總結(jié)了干預(yù)結(jié)束時大鼠的血脂水平。 結(jié)果顯示， 與NC 組相比，MC 組大鼠血清中TG、TC和LDL-C 水平顯著升高（P<0.01），HDL-C 水平顯著降低（P<0.01），表明高脂飲食會導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂。 與MC 組相比，經(jīng)KOS 干預(yù)后，血清中TG、TC 和LDL-C 水平顯著降低（P<0.01），而HDL-C水平有升高趨勢，表明KOS 能夠有效改善肥胖大鼠的血脂水平，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂。

2.3 KOS 對肥胖大鼠氧化應(yīng)激的影響

如表3 所示，MDA 水平由低到高分別是KOS組、NC 組和MC 組， 且與MC 組相比，KOS 組和NC 組差異都極其顯著（P<0.01），表明高脂飲食會引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生較多的脂質(zhì)過氧化物，而KOS 則可以降低過氧化物的產(chǎn)生量。 SOD 和GSH-PX 水平由高到低分別是KOS 組、NC 組和MC 組，且KOS 組和NC 組水平接近，與MC 組相比，差異極其顯著（P<0.01），表明高脂飲食會使體內(nèi)產(chǎn)生較多的氧自由基，而KOS 則可以提高機體的氧自由基清除能力。

2.4 KOS 對肥胖大鼠肝重和肝臟指數(shù)的影響

由圖3 可知， 高脂飲食會引起大鼠肝重和肝臟指數(shù)的升高（分別見圖3a、圖3b）。 與NC 組相比，MC 組大鼠肝重和肝臟指數(shù)分別增加了1.23倍和63.67%，差異極其顯著（P<0.01）。 經(jīng)KOS 干預(yù)后，與MC 組相比，肝重和肝臟指數(shù)分別降低了18.85%和8.83%。

表2 KOS 對血清脂質(zhì)組成的影響Table 2 The effect of KOS on the blood lipids composition

表3 KOS 對氧化應(yīng)激的影響Table 3 The effect of KOS on the oxidative stress

圖3 KOS 對肝重和肝臟指數(shù)的影響Fig.3 The effect of KOS on the liver weight and liver index

2.5 KOS 對肥胖大鼠肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)酶活力的影響

如表4所示，MC 組 與NC組相比，AST 和ALT 活力均顯著性提高， 分別是27.74%（P<0.05）和51.75%（P<0.01）。 經(jīng)KOS 干預(yù)后，與MC 組相比，AST 和ALT 活力均顯著性降低， 分別降低了16.1%（P<0.05）和29.1%（P<0.01）。 此外，MC 組AKP 活力高于NC 組，但差異不顯著，而KOS 組AKP 活力與MC 組相近，但有降低趨勢。

表4 肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)酶活力的變化Table 4 Changes in activity of hepatic lipid metabolism enzymes

2.6 KOS 對肥胖大鼠肝組織的影響

圖4 為大鼠肝組織切片HE 染色結(jié)果， 可以看出，NC 組（見圖4a）大鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，細(xì)胞中央有大而圓的細(xì)胞核且細(xì)胞質(zhì)均勻；MC 組（見圖4c）大鼠肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞內(nèi)脂滴增多、體積增大且排列紊亂，胞質(zhì)疏松，肝細(xì)胞內(nèi)可見嚴(yán)重的脂肪空泡，且細(xì)胞核偏位；KOS 組（見圖4b）大鼠肝細(xì)胞體積較MC 組大鼠減小，細(xì)胞內(nèi)脂滴減少，肝細(xì)胞脂肪變性的程度減輕。

圖4 KOS 對肝組織的影響Fig.4 The effect of KOS on the liver

3 結(jié)論

久坐的生活方式， 體力勞動的減少以及高能量密度食物的攝入過多等因素， 使得肥胖癥成為危害人類健康的主要問題之一[18-19]。 此外，肥胖還會引發(fā)一系列的并發(fā)癥。 作為一個嚴(yán)重的公共健康問題， 肥胖已引起世界范圍的關(guān)注。 KOS 作為KGM 的降解產(chǎn)物， 除具有KGM 較好的生理功能外，還具有良好的理化特性和獨特的功能活性。本研究觀察了KOS 對肥胖大鼠體重、 血脂組成、氧化應(yīng)激、肝重、肝臟指數(shù)、肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)酶以及肝組織形態(tài)的干預(yù)效果， 并探討了其在調(diào)節(jié)肥胖大鼠高脂血癥及肝損傷中可能的機制。

經(jīng)KOS 連續(xù)6 周的干預(yù)，大鼠體重、血脂組成、 氧化應(yīng)激及肝功能相關(guān)指標(biāo)均發(fā)生了一定的變化。與MC 組相比，KOS 干預(yù)能夠顯著減緩高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠體重的增加（P<0.01），說明KOS 對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖有較好的保護作用。與NC 組相比， 高脂飲食引起了更高的血清TG、TC、LDL-C 水平（P<0.01），降低了血清HDL-C 水平，說明肥胖會引起明顯的大鼠脂質(zhì)代謝紊亂。而KOS 可以顯著降低血清TG、TC 和LDL-C 水平（P<0.01），同時升高HDL-C 水平，表明KOS 對肥胖大鼠的高脂血癥有明顯的調(diào)控效果。

氧化應(yīng)激是細(xì)胞和組織內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)間失去平衡，表現(xiàn)為氧化的一種狀態(tài)[20-21]。MDA 的量可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度， 間接反映出細(xì)胞損傷的程度[22]。 而SOD 和GSH-Px 則間接地反映了機體抗氧化與清除自由基的能力[23-24]。結(jié)果顯示， 與NC 組相比，MC 組MDA 水平顯著提高（P<0.01），同時SOD 和GSH-Px 水平顯著降低（P<0.01）。 這表明攝入高熱量的高脂肪食物能夠加速大鼠的能量代謝， 加快葡萄糖氧化使得氧化產(chǎn)物過多生成，而與抗氧化能力相比，這些產(chǎn)物的氧化能力更強，因此會導(dǎo)致機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，這與之前的報道一致[25]。而KOS 組MDA 水平比NC 組低24.23%，SOD 和GSH-Px 水平也高于NC 組，表明KOS 可顯著提高機體清除氧自由基和脂質(zhì)過氧化物的能力，降低氧化損傷程度，這與之前報道的KOS 具有較強的抗氧化性一致[22]。

已有許多研究將肝臟指數(shù)作為評價肝臟損傷程度的一個指標(biāo)[26-28]。結(jié)果顯示，與NC 組相比，MC組肝重和肝臟指數(shù)均顯著增加（P<0.01），而KOS干預(yù)可以降低肝重和肝臟指數(shù)，表明KOS 可以降低肥胖引起的肝臟損傷。 此外，血清ALT、AST 水平的高低可以反映肝細(xì)胞的損傷程度[29-30]。 與NC組相比，MC 組血清ALT、AST 水平顯著升高，說明高脂飲食會破環(huán)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)， 誘發(fā)大鼠肝細(xì)胞損傷。與MC 組相比，KOS 干預(yù)顯著降低了血清ALT（P<0.01）、AST（P<0.05）水平。 與此同時，通過肝組織切片觀察可以看到，與MC 組相比，KOS 組肝細(xì)胞脂肪變性的程度減輕，說明KOS 可以顯著減輕高脂飲食誘發(fā)的大鼠肝損傷。

綜上所述，高熱量、高脂肪食物的長期攝入會誘發(fā)肥胖，引起脂質(zhì)代謝紊亂，降低機體抗氧化能力，對肝臟產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷。通過使用酶解鮮魔芋制備KOS，添加5%到高脂飼料中進行干預(yù)可控制肥胖大鼠體重，有效改善脂質(zhì)代謝紊亂，提高氧化應(yīng)激能力，降低脂質(zhì)代謝相關(guān)酶的活力，減輕高脂血癥癥狀，對抗肥胖引起的肝臟損傷。