秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)模型在食品安全研究中的應(yīng)用

夏程程 楊 番 鐘曉凌 李 琴 李 茜 張智源 史文博 徐 寧吳 茜 胡 勇 柳志杰 汪 超 周夢(mèng)舟*

（1 湖北工業(yè)大學(xué) 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心 湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心 武漢430068 2 武漢市環(huán)境檢測(cè)中心 武漢430015 3 湖北省阿克瑞德檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司 武漢430077）

隨著人們生活水平的日益提高， 簡(jiǎn)單的溫飽已不能滿(mǎn)足絕大多數(shù)人的需求， 人們現(xiàn)在更關(guān)心食品的營(yíng)養(yǎng)及安全問(wèn)題。 由于食品安全關(guān)系人民群眾的身體健康、生命安全及社會(huì)穩(wěn)定，因此近年來(lái)都成為研究熱點(diǎn)。由于生物進(jìn)化的保守性，科學(xué)研究中常用模式生物來(lái)研究一些生命現(xiàn)象并得到一些信息和結(jié)論，從而類(lèi)推到其它生物。常見(jiàn)的模式生物有果蠅、斑馬魚(yú)、小鼠等生物。然而，哺乳動(dòng)物存在倫理性、試驗(yàn)周期過(guò)長(zhǎng)和操作復(fù)雜等問(wèn)題。因秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans）具有培育時(shí)間短、理化性質(zhì)明顯、遺傳信息清楚、信號(hào)通路高度保守以及個(gè)體化差異小等優(yōu)勢(shì)， 而作為一種理想的模式生物被廣泛應(yīng)用在生命科學(xué)領(lǐng)域。在食品安全方面， 它可作為一種有效的手段去檢測(cè)食品中的有毒物質(zhì)。 線(xiàn)蟲(chóng)在食品安全領(lǐng)域主要作用歸納為：（1）環(huán)境毒理學(xué)評(píng)價(jià)；（2）研究食品危害源的毒理機(jī)制；（3）研究抑制食品危害的物質(zhì)的保護(hù)機(jī)制以及對(duì)其的篩選。 隨著包括RNAi 在內(nèi)的全基因組篩選以及蛋白質(zhì)組學(xué)等高通量篩選技術(shù)的發(fā)展， 可利用秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行毒性影響下體內(nèi)生物活性分子篩選， 使得生物標(biāo)志物體系的建立成為可能[1-4]，相關(guān)技術(shù)還被應(yīng)用在建立保護(hù)線(xiàn)蟲(chóng)抵抗病原菌的益生菌快速篩選模型等方面。現(xiàn)對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)在食品安全領(lǐng)域中的應(yīng)用做如下綜述。

1 利用秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)作為模式生物的優(yōu)勢(shì)

秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)是一種在世界各地土壤中自由生長(zhǎng)的小型線(xiàn)蟲(chóng)， 是主要以細(xì)菌為食的一種假體腔動(dòng)物。 有典型線(xiàn)蟲(chóng)的基本結(jié)構(gòu)，有口、咽、腸、性腺還有肌肉和各種系統(tǒng)，如神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、排泄系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等。 線(xiàn)蟲(chóng)的壽命為2～3 周，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度在20 ℃左右時(shí)，線(xiàn)蟲(chóng)發(fā)育一代僅需3 d。 只需顯微鏡和鉑絲挑蟲(chóng)器即可操作，用保存液和甘油混合放在-80 ℃冷凍保存，活化時(shí)將冷凍的線(xiàn)蟲(chóng)倒在有食物的NGM 培養(yǎng)基上即可。操作簡(jiǎn)便， 成本低以及試驗(yàn)周期短是秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)作為模式生物的主要優(yōu)勢(shì)。

秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)作為模式生物的另一大優(yōu)勢(shì)就是它的部分基因以及信號(hào)通路與人類(lèi)的同源性高[5]。Sulston 繪制了世界上第一幅線(xiàn)蟲(chóng)的細(xì)胞譜系圖，還發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞凋亡途徑， 并通過(guò)遺傳突變和基因克隆手段克隆了十幾個(gè)控制細(xì)胞凋亡的基因[6-8]。同期對(duì)人及哺乳動(dòng)物細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)， 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的細(xì)胞凋亡基因與人及哺乳動(dòng)物的基因有高度的相似性， 所以線(xiàn)蟲(chóng)和人的細(xì)胞凋亡的控制機(jī)制和免疫機(jī)制是高度保守的。 線(xiàn)蟲(chóng)是第一個(gè)完成全基因測(cè)序的動(dòng)物，在線(xiàn)蟲(chóng)的20 000 多個(gè)基因之中，有40%的基因和人類(lèi)基因具有同源性。同時(shí)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)還具有完備的發(fā)育和解剖學(xué)的特征以及復(fù)雜的遺傳學(xué)特征。 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)包含多種經(jīng)典的神經(jīng)遞質(zhì)如乙酰膽堿、 多巴胺、5-羥色胺、谷氨酸、γ-氨基丁酸和神經(jīng)肽等。這些神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)元中的合成、 儲(chǔ)存和代謝等過(guò)程都與哺乳動(dòng)物具有高度相似性[9]。線(xiàn)蟲(chóng)的大多數(shù)離子通道基因同樣也與哺乳動(dòng)物具有同源性[10]。

在食品安全研究領(lǐng)域中， 往往涉及到線(xiàn)蟲(chóng)的免疫調(diào)控相關(guān)的信號(hào)通路， 至少有3 個(gè)相對(duì)獨(dú)立的信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控路徑在線(xiàn)蟲(chóng)的免疫調(diào)控和生長(zhǎng)發(fā)育包括死亡中發(fā)揮重要作用[11-15]。線(xiàn)蟲(chóng)的這種免疫機(jī)制從線(xiàn)蟲(chóng)到哺乳動(dòng)物再到人類(lèi)都是高度保守的， 因?yàn)楦叩炔溉閯?dòng)物都是由簡(jiǎn)單的多細(xì)胞生物進(jìn)化而來(lái)， 同時(shí)在進(jìn)化過(guò)程中會(huì)增加新的附加作用，最后逐漸發(fā)育成完整的免疫系統(tǒng)[16]。 表1 列出了秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)中與免疫調(diào)控相關(guān)的主要信號(hào)通路，并且大多數(shù)都在人體中有同源基因。

表1 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)中與人類(lèi)同源的部分信號(hào)通路Table 1 Partial signaling pathways homologous to humans in C. elegans

1.1 DAF-2/DAF-16 信號(hào)途徑

DAF-2/DAF-16 信號(hào)途徑又稱(chēng)胰島素信號(hào)通路。 胰島素信號(hào)是通過(guò)Forkhead 家族的轉(zhuǎn)錄因子DAF-16 蛋白發(fā)揮著核心調(diào)控功能[26]。DAF-2 作為胰島素受體同源物定位于細(xì)胞膜上， 它與胞外類(lèi)似胰島素配體結(jié)合后，導(dǎo)致PI3K（磷脂酰肌醇激酶）催化亞基同源物AGE-1 活化，AGE-1 產(chǎn)生第二信使進(jìn)一步激活下游AKT/PKB 同源物絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT-1、AKT-2， 磷酸化DAF-16，從而抑制DAF-16 入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。對(duì)DAF-2 突變研究發(fā)現(xiàn)， 許多抗菌基因LYS、SPP-1 等表達(dá)上調(diào)[27]，不過(guò)對(duì)胰島素通路的下游基因的研究表明DAF-2 和AGE-1 的免疫調(diào)控可能參與了其它通路[20]。 研究表明，DAF-16 通路并不是線(xiàn)蟲(chóng)免疫的關(guān)鍵通路，而是線(xiàn)蟲(chóng)的免疫防御機(jī)制，是免疫和繁殖中的聯(lián)系通路。哺乳動(dòng)物PI3K 的直源同系基因PDK-1 和胰島素/IGF-1 受體InR 這兩個(gè)基因在胰島素/IGF-1 信號(hào)傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用，并且其它幾種途徑組分已經(jīng)顯示出可以調(diào)節(jié)果蠅、小鼠以及人的衰老， 這意味著該途徑對(duì)衰老的影響是保守的[28-29]。

1.2 MAPK 信號(hào)通路

MAPK（促分裂原活化蛋白激酶）包含有3 條信號(hào)傳導(dǎo)途徑：分別是P38MAPK（細(xì)胞因子抑制的抗炎藥物結(jié)合蛋白激酶）、ERK-MAPK （細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶）和JNK-MAPK（氨基末端激酶），這些途徑從酵母到哺乳動(dòng)物均高度保守。 這3 條途徑分別對(duì)應(yīng)于秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的PMK-1、MPK-1[30]和KGB-1 信號(hào)途徑，他們控制著線(xiàn)蟲(chóng)應(yīng)對(duì)外界刺激和壓力、 細(xì)胞增殖及凋亡等重要的生理活動(dòng)[31-33]。

P38MAPK 通路為秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵組分，研究表明P38MAPK 通路是通過(guò)NSY-1→SEK-1→PMK-1 級(jí)聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)線(xiàn)蟲(chóng)的免疫功能，其中PMK-1 在抗病原菌的免疫應(yīng)激中發(fā)揮重要作用[34]。 JNK 信號(hào)通路被認(rèn)為是線(xiàn)蟲(chóng)應(yīng)對(duì)外界各種應(yīng)激誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子， 參與對(duì)溫度、氧氣和滲透壓等變化的非生物應(yīng)激作用。ERK同樣是MAPK 家族的一員， 它的信號(hào)途徑是涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育及分裂的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的核心，遵循MAPKs 的三級(jí)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，Ras 作為其上游激活蛋白，Raf 作 為MAPKKK，MAPK/ERK激酶（MEK）作為MAPKK，ERK 即MAPK，即Ras-Raf-MEK-ERK 途徑。 但是對(duì)上游蛋白及各種激酶的激活機(jī)制正在進(jìn)一步研究中。

研究表明這3 種MAPK 途徑之間可相互作用，例如Kim 等[35]發(fā)現(xiàn)JNK 中的MEK-1 的MAPK激酶（MAPKK）和VHP-1 蛋白激酶磷酸酶（MKP）對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)生物應(yīng)激也有影響，并且也能調(diào)節(jié)PMK-1基因。 JNK 和P38MAPK 通路都是通過(guò)調(diào)節(jié)TTM-1 和TMM-2 基因抵御毒素[36]。P38 和ERK 信號(hào)通路間的雙向信號(hào)能協(xié)同促進(jìn)組織的修復(fù)，JNK 信號(hào)通路和ERK 信號(hào)通路存在負(fù)的相互作用[37-38]。

1.3 TGF-β 信號(hào)通路

TGF-β（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子）信號(hào)通路在成熟有機(jī)體和發(fā)育中的胚胎都參加了細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡等其它細(xì)胞功能。 線(xiàn)蟲(chóng)中TGF-β 的同源基因?yàn)镈BL-1。TGF-β 信號(hào)通路主要是由DBL-1 編碼的蛋白和AMA/DAF-4 受體復(fù)合物結(jié)合磷酸化后激活下游SAM 家族蛋白來(lái)調(diào)控的[39]。 TGF-β 家族的其它成員包括TIG-2、UNC-129、DAF-7， 其功能多與神經(jīng)和發(fā)育有關(guān)。線(xiàn)蟲(chóng)中對(duì)TGF-β 的免疫調(diào)控研究有助于我們了解動(dòng)物中的致病菌以及對(duì)致病菌的抵抗機(jī)制[40-42]。

2 食品中安全危害因素以及秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)在相關(guān)研究中的應(yīng)用

2.1 食品中化學(xué)物質(zhì)危害因素

食品中化學(xué)危害包括食品包裝材料、重金屬、天然毒素和農(nóng)藥殘留等，廣泛存在于日常食品中，當(dāng)劑量超過(guò)一定值，就可能導(dǎo)致食品安全問(wèn)題。食品中的化學(xué)危害一直以來(lái)都是研究熱點(diǎn)。

2.1.1 食品包裝材料 世界上廣泛使用的增塑劑鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）與其替代物鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）被應(yīng)用于玩具、食品包裝材料、醫(yī)用血袋和膠管、乙烯地板和壁紙、清潔劑、潤(rùn)滑油以及個(gè)人護(hù)理用品（如指甲油、頭發(fā)噴霧劑、香皂和洗發(fā)液）等數(shù)百種產(chǎn)品中，有研究表明[43]，DEPH 對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物有一定的急性毒性。Tseng 等[44]使用秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)為體內(nèi)模型來(lái)評(píng)估鄰苯二甲酸酯誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性和可能的相關(guān)機(jī)制， 通過(guò)抗氧化劑壞血酸預(yù)處理顯著降低了DEHP 暴露線(xiàn)蟲(chóng)的ROS 水平， 改善了運(yùn)動(dòng)和熱敏行為缺陷，以及保護(hù)了神經(jīng)元的損傷，表明鄰苯二甲酸酯對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的神經(jīng)毒性作用中氧化應(yīng)激起關(guān)鍵作用。 Pradhan 等[45]利用秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)研究了DEHP 和DEP 毒性以及致毒機(jī)理。 基因表達(dá)分析顯示，在線(xiàn)蟲(chóng)L1 至青年期階段期間DEHP 和DEP暴露改變了參與脂質(zhì)代謝和應(yīng)激反應(yīng)的基因表達(dá)情況。 與脂質(zhì)代謝有關(guān)的基因， 包括FASN-1，POD-2，F(xiàn)AT-5，ACS-6 和SBP-1 以及卵黃蛋白原上調(diào)， 應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)基因中，CED-1，WAH-1，DAF-21 和GST-4 上調(diào)，而CTL-1，CDF-2 和熱休克蛋白（HSP-16.1，HSP-16.48 和SIP-1）下調(diào)。 脂質(zhì)染色顯示在DEHP 暴露下， 線(xiàn)蟲(chóng)的脂質(zhì)含量顯著增加，生殖能力和壽命下降。

自從雙酚A（BPA）被禁止應(yīng)用在所有食品包裝材料中[46]以來(lái)，與BPA 結(jié)構(gòu)高度相似的雙酚S作為替代品廣泛應(yīng)用于各種食品包裝材料中。 但是BPS 同樣也有一定的危害，CHEN 等[47]發(fā)現(xiàn)BPS 和BPA 能引起秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)生殖系統(tǒng)損傷，增加生殖細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致胚胎死亡率上升，但是和BPA 的作用途徑不完全相同。低濃度的BPS 可能通過(guò)促進(jìn)ROS 的過(guò)度產(chǎn)生加速線(xiàn)蟲(chóng)衰老，從而顯著縮短線(xiàn)蟲(chóng)壽命， 因此得出結(jié)論雙酚S 并不能很好替代雙酚A。

2.1.2 重金屬 隨著工業(yè)科技的發(fā)展， 重金屬對(duì)食品安全的影響越來(lái)越大， 自然界中一般廣泛存在有一定濃度的重金屬。 但是隨著人類(lèi)開(kāi)采重金屬，隨意排放污水等活動(dòng)，很多重金屬進(jìn)入了生態(tài)系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)時(shí)間積累，以及食物鏈的富集，最終在生物體內(nèi)聚集，通過(guò)氧化作用，破壞生物體正常生理代謝活動(dòng)，最后給人體健康造成巨大影響。Yang[48]發(fā)現(xiàn)0.4 μmol/L 以上的鎘暴露可顯著抑制細(xì)胞增殖，并具有劑量效應(yīng)。

在20 世紀(jì)九十年代，Williams 和Dusenbery[49]首次研究了Ag，Hg，Cu，Cd 和As 等可以導(dǎo)致哺乳動(dòng)物致死的14 種金屬和非金屬鹽對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的毒性作用，測(cè)定了24，48，72 和96 h 的半致死劑量。 自此以后很多研究開(kāi)始使用線(xiàn)蟲(chóng)作為模式生物進(jìn)行重金屬評(píng)估。 Boyd 等[50-51]通過(guò)對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的研究表明Cd，Hg 和Pb 暴露均會(huì)導(dǎo)致秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)目顯著下降。 WANG 等[52]發(fā)現(xiàn)重金屬鎘通過(guò)促進(jìn)形成ROS（反應(yīng)性氧類(lèi)物質(zhì)）和損害抗氧化系統(tǒng)、DNA 修復(fù)、RNA/蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞的分化和增殖來(lái)對(duì)生物體造成嚴(yán)重的威脅。 為了研究秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)在嚴(yán)重鎘脅迫下的信號(hào)傳導(dǎo)途徑， 通過(guò)對(duì)照RNA-Seq 野生型和pmk-1 突變體在Cd 脅迫條件下進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)PMK-1 促進(jìn)了鎘脅迫動(dòng)物中轉(zhuǎn)錄因子SKN-1 / Nrf 和DAF-16 的靶基因的表達(dá)， 其中包括分子伴侶蛋白或免疫蛋白的基因。

砷中毒所涉及的機(jī)制尚不明確， 研究認(rèn)為砷可以改變多條細(xì)胞通路包括改變生長(zhǎng)因子， 抑制細(xì)胞周期檢查點(diǎn)蛋白和DNA 修復(fù)， 影響DNA 甲基化，削弱免疫監(jiān)視，破壞氧化劑的平衡，增加氧化應(yīng)激等[53]。

Anthony 等[54]通過(guò)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)發(fā)現(xiàn)三價(jià)砷和亞砷酸鹽可以誘導(dǎo)線(xiàn)粒體活性氧的產(chǎn)生， 抑制參與能量代謝的酶，并在體外誘導(dǎo)有氧糖酵解，提示砷可能通過(guò)影響代謝功能來(lái)誘導(dǎo)疾病的產(chǎn)生。此外， 亞砷酸鹽暴露還會(huì)引起嚴(yán)重的線(xiàn)粒體功能障礙。 游牧[53]以秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)為模式生物，建立了基于秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的抗砷脅迫模型。 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)熱激處理可以顯著提升線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)砷的耐受度， 其機(jī)理是熱激處理激活了胰島素先天的免疫調(diào)節(jié)功能，與胰島素途徑關(guān)鍵位點(diǎn)HSF-1 和DAF-16 有關(guān)，熱激處理促進(jìn)DAF-16 核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的時(shí)間和比率，提高抗脅迫能力，并且具有顯著的時(shí)間效應(yīng)。通過(guò)對(duì)HSF-1 和DAF-16 基 因下游HSP-4、HSP-6、HSP-16.2、HSP-60 和HSP-70 5 種熱休克蛋白的表達(dá)情況分析， 發(fā)現(xiàn)線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)砷暴露抗性涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線(xiàn)粒體的蛋白質(zhì)折疊過(guò)程， 并可能與機(jī)體的氧化應(yīng)激途徑有關(guān)。 游牧[53]還利用秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)多種突變品系， 發(fā)現(xiàn)辣椒素通過(guò)胰島素途徑對(duì)砷脅迫造成的氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用， 具體分子通路可能為： 辣椒素抑制胰島素信號(hào)， 活化DAF-16/FOXO 和SKN-1， 兩者獨(dú)立平行發(fā)揮作用，共同提高抗氧化酶如GST-4、SOD-3 和GCS-1 的表達(dá)，提高線(xiàn)蟲(chóng)氧化還原能力。 通過(guò)對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)這種模式生物的運(yùn)用，建立了抗砷脅迫模型，探討了胰島素途徑先天免疫調(diào)控功能對(duì)砷毒害的保護(hù)作用和分子機(jī)制。

研究者發(fā)現(xiàn)線(xiàn)蟲(chóng)的JNK 和P38 MAPK 信號(hào)通路都參與了對(duì)重金屬毒素的抵御， 任何一條通路中的關(guān)鍵基因PMK-1、KGB-1 敲除都會(huì)使線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)毒素極其敏感， 并且這兩條通路都是通過(guò)調(diào)節(jié)TTM-1 和TTM-2 基因抵御重金屬毒素。研究表明秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)MEK-1 基因在抗重金屬方面發(fā)揮重要作用，MEK-1 信號(hào)途徑MLK-1/MEK-1/KGB-1 介導(dǎo)對(duì)重金屬銅、鎘的抗性作用，在重金屬的刺激下，KGB 表達(dá)上調(diào)[55]。同時(shí)SEK-1、MEK-1 對(duì)PMK-1 和KGB-1 的激活作用與VHP-1 對(duì)它們的抑制作用在細(xì)胞內(nèi)達(dá)到平衡， 協(xié)調(diào)生物體內(nèi)的穩(wěn)定性[56]。

2.1.3 自然毒素 自然界中存在許多以食品的天然組分形式存在的自然毒素，由于毒性巨大，且與食品容易混淆，因此對(duì)人體的健康威脅巨大。自然毒素主要分為：有毒蛋白質(zhì)類(lèi)、有毒氨基酸類(lèi)、生物堿類(lèi)、蘑菇毒素、木藜蘆烷毒素、毒甙和酚類(lèi)衍生化物。

蓖麻毒素是一種核糖體失活蛋白（RIP），由能夠每分鐘失活1 500 個(gè)核糖體的異二聚體多肽組成，可中斷蛋白質(zhì)合成并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。傳統(tǒng)的蓖麻蛋白檢測(cè)方法使用基于抗體的免疫測(cè)定和酶連接免疫吸附測(cè)定， 但是這些方法需要使用產(chǎn)生更多抗體的高等動(dòng)物，但是這些動(dòng)物一般都受保護(hù)，而且存在倫理問(wèn)題。 Demant 等[57]利用秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)研究出一種可以量化蓖麻毒素的最佳生物測(cè)定方法，并選擇出最佳測(cè)定毒素的線(xiàn)蟲(chóng)品系。

青顫毒素（Penitrem A， PA）是由幾種陸地和少量海洋青霉菌物種產(chǎn)生的鹵化吲哚生物堿毒素， 發(fā)現(xiàn)可以防止PA 毒性效應(yīng)的天然產(chǎn)物對(duì)食品安全至關(guān)重要。 Goda 等[58]利用秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)和大鼠模型同時(shí)評(píng)估AST（蝦青素）和DHA（二十二碳六烯酸）對(duì)PA 誘導(dǎo)的毒性的體外保護(hù)活性。 最后發(fā)現(xiàn)DHA 和AST 處理有效抵消了PA 的毒性作用并使大多數(shù)生化參數(shù)（谷氨酸、天冬氨酸、血清中多巴胺、血清素和腎上腺素）正?；?并表示DHA 和AST 主要是通過(guò)抵消PA 誘導(dǎo)的BK 通道拮抗活性來(lái)抑制PA 對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的毒性，說(shuō)明DHA 和AST 可以作為有用的食品添加劑來(lái)預(yù)防和減少PA 食品引起的毒性。

上述食品中化學(xué)危害因子涉及到的與線(xiàn)蟲(chóng)免疫防御相關(guān)的信號(hào)通路如圖1 所示， 當(dāng)食品的化學(xué)危害因子如食品包裝材料中的有害物質(zhì)以及重金屬對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)產(chǎn)生刺激時(shí)， 影響線(xiàn)蟲(chóng)中脂質(zhì)代謝和應(yīng)激反應(yīng)的基因的表達(dá)，產(chǎn)生活性氧，降低了線(xiàn)蟲(chóng)的生殖能力以及壽命。 線(xiàn)蟲(chóng)中的JNK 通路和P38MAPK 通路都是通過(guò)調(diào)節(jié)TTM-1 和TTM-2 基因抵御毒素。KGB-1 為抗金屬的關(guān)鍵基因， 同時(shí)SEK-1、MEK-1 對(duì)PMK-1 和KGB-1 的激活作用與VHP-1 對(duì)它們的抑制作用在細(xì)胞內(nèi)達(dá)到平衡。而辣椒素可通過(guò)抑制胰島素信號(hào)，活化DAF-16/FOXO 和SKN-1， 兩者獨(dú)立平行發(fā)揮作用， 共同提高抗氧化酶如GST-4、SOD-3、GCS-1的表達(dá)， 提高線(xiàn)蟲(chóng)氧化還原能力來(lái)抵抗重金屬對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的影響。

圖1 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)中與食品化學(xué)危害因子相關(guān)的部分免疫防御信號(hào)通路示意圖Fig.1 Schematic diagram of some of the immune defense signaling pathways associated with chemical hazards in foods of Caenorhabditis elegans

2.2 食品中微生物

食品中的微生物危害包括細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)和真菌等方面的危害。 食品中的微生物危害涉及范圍廣，食品在加工、運(yùn)輸、貯藏和銷(xiāo)售等過(guò)程中都可能被微生物及其毒素污染， 導(dǎo)致食品衛(wèi)生質(zhì)量下降，對(duì)人體健康產(chǎn)生危害。在研究食品微生物危害方面利用秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)作為模式生物的研究中，主要與真菌及致病性細(xì)菌有關(guān)。

2.2.1 真菌 真菌毒素是一類(lèi)由真菌產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物， 通過(guò)污染食品進(jìn)入人類(lèi)和動(dòng)物體內(nèi)引發(fā)癌癥以及不孕等癥狀。因其分布廣泛，難以避免，故對(duì)人類(lèi)的健康有很大的影響。真菌主要的共同毒性歸結(jié)為細(xì)胞毒性和致DNA 損傷，而不同真菌又有其各自特點(diǎn)。 真菌毒素的毒理機(jī)制主要分為類(lèi)雌性激素效應(yīng)、氧化損傷、染色體畸變和誘發(fā)細(xì)胞凋亡。

黃曲霉毒素是由黃曲霉和曲霉菌產(chǎn)生的一種真菌毒素， 天然存在于各種動(dòng)物飼料和人類(lèi)食物中，特別是在谷物、堅(jiān)果和飼料中易被發(fā)現(xiàn)[59]。 黃曲霉毒素B1（AFB1）是已知的真菌毒素中毒性最強(qiáng)和致癌性最強(qiáng)的物質(zhì)。Leung 等[60]利用秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)研究黃曲霉毒素B1 對(duì)細(xì)胞色素酶P450 系列（CYP）的影響， 發(fā)現(xiàn)其會(huì)導(dǎo)致DNA 突變細(xì)胞衰亡。 這是公開(kāi)報(bào)道秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)可用于真菌毒素毒性研究的第一篇文章， 自此之后秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)被廣泛地應(yīng)用于真菌毒素研究中。研究表明AFB1主要通過(guò)其代謝物和DNA 形成加合物阻斷DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致DNA 的損傷。除了致癌作用，AFBI 還會(huì)在人和哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生其它嚴(yán)重的毒性作用，比如生長(zhǎng)延緩，免疫控制以及生殖功能障礙。 Eduardo 等[61]使用秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)作為體內(nèi)模型，著重研究AFB1 對(duì)生長(zhǎng)和繁殖以及DNA 損傷和生殖細(xì)胞凋亡的毒性作用。結(jié)果表明，將秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)暴露于A(yíng)FB1 會(huì)引起濃度依賴(lài)性生長(zhǎng)和繁殖抑制，核DNA 損傷和生殖細(xì)胞凋亡這些毒性效應(yīng)之間存在著潛在的相互關(guān)系，而且DNA 損傷為中心樞紐， 通過(guò)關(guān)鍵信號(hào)通路導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制和生殖細(xì)胞凋亡，后者進(jìn)一步抑制生殖。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）是由某些感染禾谷類(lèi)作物的鐮孢屬物種產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物。DON 能引起拒食、嘔吐、胃腸道病變、免疫抑制和家畜缺乏肌肉協(xié)調(diào)等癥狀， 又稱(chēng)嘔吐毒素。 DON降低了作物產(chǎn)量以及影響了牲畜和人類(lèi)健康。Gowrinathan 等[62]研究表明DON 可以抑制秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)野生型N2 和突變體品系A(chǔ)U1 后代數(shù)目，而且抑制作用與DON 暴露濃度有明顯劑量依賴(lài)關(guān)系，染毒濃度越大，后代數(shù)目越少。 而且這種情況還存在于鐮刀菌類(lèi)真菌毒素中， 因此推測(cè)鐮刀菌類(lèi)真菌毒素對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)存在生殖毒性。

Yang 等[63]選取秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)為模式生物，探索真菌毒素對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的毒性效應(yīng)， 深入研究了以玉米赤霉烯酮（ZEN）為代表的真菌毒素的毒性效應(yīng)與線(xiàn)蟲(chóng)代謝的相關(guān)性， 并分析其毒理機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)真菌毒素會(huì)抑制線(xiàn)蟲(chóng)的體型、壽命和后代數(shù)， 導(dǎo)致線(xiàn)蟲(chóng)性腺臂和產(chǎn)卵器缺陷以及行為能力缺陷。 微陣列結(jié)果顯示過(guò)半基因受ZEN 調(diào)控表達(dá)有異常， 其中DAY-17、COL-121、HCH-7、NLP-9 顯著差異表達(dá)， 分別與線(xiàn)蟲(chóng)表皮膠原蛋白合成、生殖細(xì)胞生產(chǎn)和免疫應(yīng)激功能相關(guān)。ZEN 使DPY-31、DAF-2、DAF-16 標(biāo)記基因在熒光線(xiàn)蟲(chóng)品系中強(qiáng)烈表達(dá)，顯示了ZEN 對(duì)表皮膠原蛋白的下調(diào)作用和DAF-2insulin-like 信號(hào)通路的上調(diào)作用。 推斷ZEN 的致死性、發(fā)育毒性、生殖毒性、神經(jīng)毒性與線(xiàn)蟲(chóng)表皮膠原蛋白合成信號(hào)通路以及DAF-2insulin-like 信號(hào)通路相關(guān)。 該研究構(gòu)建了一種有效評(píng)價(jià)真菌毒素毒性效應(yīng)的秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)模型， 可快速篩選毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)并在分子水平分析基因表達(dá)與毒性效應(yīng)相關(guān)性，闡明了毒理機(jī)制。

2.2.2 致病性細(xì)菌 食品致病菌是指可以引起食物中毒，或者以食品為傳播媒介的致病性細(xì)菌，是食品安全問(wèn)題的重要源頭。 常見(jiàn)的食品致病菌有痢疾桿菌、鼠疫桿菌、致病性大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、霍亂弧菌和豬丹毒桿菌等，對(duì)人類(lèi)的健康有很大影響。

產(chǎn)腸毒性大腸桿菌（ETEC）是一類(lèi)引起人和幼畜腹瀉的主要病原菌。 Zhou[64]使用秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)建立了ETEC 致死線(xiàn)蟲(chóng)模型和保護(hù)線(xiàn)蟲(chóng)抵抗ETECCJG280 的乳酸菌快速篩選模型， 并挑出保護(hù)效果最好的一株玉米乳桿菌來(lái)研究益生菌保護(hù)線(xiàn)蟲(chóng)的機(jī)理。 發(fā)現(xiàn)LB1 對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的保護(hù)作用與抑制ETECJG280 腸毒素有關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)活的LB1 能顯著提高M(jìn)APK 和DAF-16 信號(hào)通路中關(guān)鍵基因及抗菌肽基因的表達(dá)水平，抑制腸毒素基因的表達(dá)，顯著減少腸毒素克隆的致死作用。

Bolz 等[65]對(duì)感染鼠疫桿菌的秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn) PMK-1/P38MAPK 通路在宿主的先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用。 腸道沙門(mén)氏菌感染秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)導(dǎo)致性腺細(xì)胞的程序性死亡，推斷是菌體表面的LPS（lipopolysaccharide）和PMK-1 共同作用的結(jié)果。 RNAi 實(shí)驗(yàn)顯示PMK-1 信號(hào)途徑位于CED-9 上游[66]。 通過(guò)感染綠膿桿菌的秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)篩選出對(duì)病原菌敏感性增強(qiáng)（enhanced suscepttbility to pathogen，ESP）表型的突變株， 分析發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)MAPK 途徑中的SEK-1 和NSY-1 的基因ESP-2 和ESP-8 介導(dǎo)了秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)病原菌的抗性作用[34]。 在銅綠假單胞菌感染線(xiàn)蟲(chóng)過(guò)程中，TPA-1 和DKF-2 （蛋白激酶D）激活PMK-1，誘導(dǎo)宿主防御基因的表達(dá)[67]。銅綠假單胞菌感染導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)中的胰島素樣肽（INS-7）的產(chǎn)生，可激活DAF-2 并下調(diào)腸中DAF-16 的活性[68-69]，胰島素受體DAF-2 通過(guò)激酶級(jí)聯(lián)抑制下游轉(zhuǎn)錄因子DAF-16， 該激酶級(jí)聯(lián)包括磷酸肌醇3-激酶（AGE-1），磷酸肌醇依賴(lài)性激酶（PDK-1，AKT-1，AKT-2）和血清/糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶1（SGK-1）[70]。 DAF-2 或AGE-1 中的突變體在喂食革蘭氏陽(yáng)性菌后，激活了DAF-16，延長(zhǎng)了線(xiàn)蟲(chóng)的壽命，增強(qiáng)了線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)死亡的抗性[71]。 糞腸球菌[72-73]通過(guò)產(chǎn)生活性氧簇介導(dǎo)對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的致死作用， 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)通過(guò)DAF-2/DAF-16 信號(hào)途徑與熱休克因子HSF-1 之間的相互作用，調(diào)節(jié)CLT-1（過(guò)氧化氫酶）、CLT-2 和SOD-3（超氧化物歧化酶）等抗氧化基因的表達(dá)， 通過(guò)表達(dá)的這些酶分解活性氧簇[74-76]。

當(dāng)粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）感染線(xiàn)蟲(chóng)時(shí)，溶菌酶基因（LYS-1、LYS-7 和LYS-8）以及凝集素基因表達(dá)均上調(diào)，且LYS-8 受DBL-1 正調(diào)控[77]。 Mallo 和Ewbank[78-79]的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)突變株dbl-1（DBL-1 基因被敲除）被銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和粘質(zhì)沙雷氏菌感染時(shí)，和野生型相比壽命明顯減少。 Thomsen 等[80]利用秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)建立了李斯特菌的毒理分析模型。

秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)致病菌的防御主要涉及前文提到過(guò)的線(xiàn)蟲(chóng)免疫相關(guān)的3 條信號(hào)通路以及一些抗菌肽基因， 而且各種信號(hào)通路之間有一定的相互作用，共同維持細(xì)胞內(nèi)的平衡。 例如PMK-1 和DAF-16 都參與對(duì)病原菌的抵抗作用，PMK-1 的過(guò)量表達(dá)能增加DAF-2 突變引起的病原菌抗性作用[81]。另外，MAPK 和TGF-β 途徑都參與抗綠膿桿菌的抗性作用[82]。 說(shuō)明不同的信號(hào)途徑間在抗致病菌方面可能通過(guò)相互作用， 整體上協(xié)調(diào)細(xì)胞免疫防御機(jī)制。

線(xiàn)蟲(chóng)的免疫系統(tǒng)以及抗微生物相關(guān)信號(hào)通路的信號(hào)通路圖如下[83-84]：

圖2 線(xiàn)蟲(chóng)的免疫系統(tǒng)以及抗微生物因子相關(guān)信號(hào)通路示意圖Fig.2 Schematic representation of nematode immune system and antimicrobial signaling pathways

如圖， 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)自身的免疫防御機(jī)制主要如下：食品中微生物危害因子刺激下，TGF-β 通路的DBL-1 基因編碼的蛋白與SMA/DAF-4 受體復(fù)合物結(jié)合磷酸化后激活下游SAM 家族蛋白，使得溶菌酶基因和凝集素基因均上調(diào)； 胰島素信號(hào)通路上游神經(jīng)樣肽INS-7 激活DAF-2，抑制下游DAF-16 入核來(lái)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，上調(diào)了抗菌基因LYS、SPP-1 的表達(dá)并且和HSF-1 相互作用，調(diào)節(jié)抗氧化基因， 使其表達(dá)的蛋白分解活性氧簇。P38MAPK 通路主要是通過(guò)PMK-1 基因調(diào)控下游基因編碼的神經(jīng)樣肽、 抗菌肽以及自噬基因的表達(dá)。 同時(shí)MAPK 中的JNK-1 信號(hào)途徑中MEK-1對(duì)PMK-1 也有調(diào)控作用。

3 總結(jié)和展望

秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)因其具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、周身透明、生命周期短、 個(gè)體特異性小以及遺傳模式保守等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。在食品安全研究中，建立了許多線(xiàn)蟲(chóng)致死模型、線(xiàn)蟲(chóng)篩選模型和線(xiàn)蟲(chóng)抵抗模型。 研究了各種外界危害因子對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的毒性機(jī)理， 線(xiàn)蟲(chóng)自身的免疫防御的調(diào)控機(jī)制以及對(duì)有害物質(zhì)起抑制作用的物質(zhì)對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的保護(hù)作用機(jī)理， 充分說(shuō)明了線(xiàn)蟲(chóng)作為模式生物在這個(gè)領(lǐng)域的重要性。不過(guò)，盡管線(xiàn)蟲(chóng)與人類(lèi)基因具有高度保守性， 但是線(xiàn)蟲(chóng)和人類(lèi)在生理以及病理方面差異較大，線(xiàn)蟲(chóng)不具備完整的循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)， 所以它不完全能代替其它哺乳動(dòng)物進(jìn)行研究。由于線(xiàn)蟲(chóng)存活溫度的限制，所以縮小了可研究的病原菌范圍。此外，線(xiàn)蟲(chóng)強(qiáng)大的解毒系統(tǒng)，限制了一些調(diào)節(jié)宿主防御的化合物的發(fā)現(xiàn)。秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)模型在某些篩選模型中， 還需要后續(xù)的臨床試驗(yàn)[85]。 同時(shí)我們應(yīng)當(dāng)正確認(rèn)識(shí)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)在食品安全研究中的優(yōu)勢(shì)和不足， 進(jìn)行周密的試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)， 才能充分發(fā)揮線(xiàn)蟲(chóng)模型的真正價(jià)值， 使秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)在更多領(lǐng)域發(fā)揮其不可或缺的作用。

秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)今后在食品領(lǐng)域的應(yīng)用方向，可以借鑒保護(hù)線(xiàn)蟲(chóng)抵抗ETEC JG280 的乳酸菌快速篩選模型，利用線(xiàn)蟲(chóng)模型的快速篩選性，進(jìn)行體內(nèi)生物活性分子篩選， 也可以從食品中篩選出對(duì)人體有潛在危害的物質(zhì)。 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)這種模式生物的各種優(yōu)勢(shì)，在21 世紀(jì)，可能與生物信息學(xué)相結(jié)合，發(fā)揮更重要的作用。