基于指紋圖譜的歐拉羊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)定量分析

陳學(xué)敏 朱國茵 羅海玲 余忠祥 羅 潔 張 昊，6

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京100193;3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193;4.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧810016;5.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙410128;6.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京100083)

0 引言

相比于食物的味道和質(zhì)地，揮發(fā)性風(fēng)味是更能區(qū)別肉類食品的重要質(zhì)量特征［1-2］。肉類食品風(fēng)味物質(zhì)的前體主要包括水溶性的氨基酸、還原糖、核糖、硫胺素等小分子物質(zhì)以及肌間和皮下脂肪［3］。在一定熟制條件下，前者通過美拉德反應(yīng)或熱降解，后者通過脂肪氧化分解等途徑，產(chǎn)生雜環(huán)化合物、醛、酮、酯和酸等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。羊肉的特征風(fēng)味成分主要包括支鏈脂肪酸(如4-甲基辛酸、4-乙基辛酸、4-甲基壬酸等致膻類物質(zhì)［4］)和短鏈脂肪醛(如己醛、辛醛等具有水果和青草氣味特征的物質(zhì))［5］。目前，我國已成為世界上綿羊和山羊飼養(yǎng)量、出欄量、羊肉產(chǎn)量最多的國家［6］，肉羊品種繁多，其中灘羊、湖羊和杜泊羊都是優(yōu)良綿羊品種。灘羊是我國寧夏地區(qū)特有的肉裘兼用型地方良種，湖羊在全國主要養(yǎng)羊產(chǎn)區(qū)作為肉用羊或作為母羊進(jìn)行雜交改良，兩者在我國的飼養(yǎng)量均超過百萬只［7-8］。杜泊羊自南非引入我國，其適應(yīng)性強(qiáng)、生長發(fā)育快、生產(chǎn)穩(wěn)定［9］，國內(nèi)大部分地區(qū)利用羊的生物學(xué)特性與地方綿羊品種進(jìn)行雜交利用［10］。羊的品種及相關(guān)遺傳因素對羊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成具有重要影響［11-12］，因此需對不同品種羊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成特點(diǎn)進(jìn)行研究。

歐拉羊?qū)俨叵稻d羊，生活在青藏高原，其羊肉符合消費(fèi)者對天然、綠色高端羊肉產(chǎn)品的需求。目前對歐拉羊的研究主要集中于營養(yǎng)品質(zhì)方面［13-14］，缺乏對其特征風(fēng)味的研究。本文利用頂空固相微萃取(Solid-phase microextraction，SPME)對羊肉風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行吸附，繼而通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)對這些物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析，最后采用嗅覺檢測器鑒定呈香化合物，并與國內(nèi)具有代表性的主要肉用綿羊品種的羊肉揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行比較，明確歐拉羊肉的特征風(fēng)味，并建立相應(yīng)指紋圖譜，以促進(jìn)歐拉羊肉產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從青海省黃南州河南蒙古族自治縣隨機(jī)選取自由放牧的10 只歐拉羊，皆為1.5 歲齡羯羊，當(dāng)?shù)靥烊徊輬鲋脖灰愿吆莸轭悶橹?，植被以線葉嵩草、小嵩草、火絨草、萎陵菜、披堿草、早熟禾、風(fēng)毛菊等為主。同時(shí)選取相同年齡、性別，且自由放牧的灘羊、湖羊、杜泊羊各10 只作為對照。宰前禁食24 h、停水2 h，宰后取背最長肌300 g，裝入自封袋于-18℃保存。

C7-C30 正構(gòu)烷烴混標(biāo)，美國Sigma 公司;鄰二氯苯標(biāo)準(zhǔn)品、正己烷(色譜純)，中國百靈威公司;氯化鈉(分析純)，天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

手動(dòng)SPME 進(jìn)樣器、75 μm 碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)萃取頭，美國Supelco 公司;7890B-5977B 型氣質(zhì)聯(lián)用儀、DB-WAX UI 型色譜柱(30 m ×0.250 mm)，美國Agilent 公司;ODP3 型嗅覺檢測器，德國Gerstel 公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

參照文獻(xiàn)［15］的方法并稍作修改，將羊肉自然解凍，除去筋膜并絞碎，取10 g 樣品置于40 mL 頂空瓶中，加入2 g 氯化鈉固體，再加入50 μL 質(zhì)量濃度為5 ×10-7g/mL 的鄰二氯苯溶液作為內(nèi)標(biāo)。封口后在120℃下加熱30 min，冷卻至室溫(20℃)，60℃恒溫水浴，以SPME 進(jìn)樣器吸附30 min，吸附過程保持密封狀態(tài)，吸附完畢后進(jìn)樣。

1.3.2 GC-MS 分析和呈香物質(zhì)的鑒定

色譜條件:萃取頭解吸5 min，進(jìn)樣口溫度250℃，不分流，載氣為氦氣，流速0.8 mL/min。色譜柱采用程序升溫，起始柱溫40℃，保持3 min，以6℃/min 升至230℃，保留3 min。

質(zhì)譜條件:電離方式EI(70 eV)，離子源溫度230℃，燈絲電流200 μA，檢測電壓350 V，接口溫度240℃，掃描速度1 562 u/s，掃描質(zhì)量(質(zhì)荷比)范圍為45 ～350。

嗅辨儀分析:氣相色譜儀流出物在毛細(xì)管末端以1∶1的分流比分別流入氫焰離子化檢測器和嗅覺檢測器。在嗅覺檢測器的嗅聞端口由8 名經(jīng)過培訓(xùn)的感官評價(jià)員進(jìn)行嗅聞評定實(shí)驗(yàn)，同一相對嗅聞時(shí)間內(nèi)可以同時(shí)被4 名及以上人員感覺到時(shí)記錄結(jié)果，鑒定出呈香化合物。

定性方法:根據(jù)Mainlib/NIST/Wiley 7 質(zhì)譜庫對風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行初步定性(匹配度大于800)，然后計(jì)算待測物質(zhì)的保留指數(shù)并與該物質(zhì)的文獻(xiàn)參考值比較，相差在100 以內(nèi)則認(rèn)為定性結(jié)果準(zhǔn)確。

正構(gòu)烷烴標(biāo)品在以上色譜與質(zhì)譜條件下進(jìn)樣分析，待測物質(zhì)的保留指數(shù)計(jì)算公式為

式中 N——保留時(shí)間小于且最接近待測物質(zhì)的正構(gòu)烷烴碳數(shù)

TX——待測物質(zhì)的保留時(shí)間，min

TY——小于且最接近待測物質(zhì)的正構(gòu)烷烴保留時(shí)間，min

TZ——大于且最接近待測物質(zhì)的正構(gòu)烷烴保留時(shí)間，min

定量方法:根據(jù)各風(fēng)味物質(zhì)峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比計(jì)算相對含量，響應(yīng)因子取1［11，16］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 軟件進(jìn)行t 檢驗(yàn)或單因素方差分析，同時(shí)用Dunnett 法進(jìn)行多重比較，顯著性水平均設(shè)為0.05，并對風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行主成分分析。采用Matlab 對風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性分析

由表1 可知，歐拉羊肉中共檢測到揮發(fā)性風(fēng)味成分53 種，其中具有氣味活性的成分41 種，占總物質(zhì)數(shù)目77%。湖羊、杜泊羊、灘羊羊肉中分別檢測到24、31、28 種揮發(fā)性成分。在檢測到的歐拉羊肉風(fēng)味成分中，大部分為醛類風(fēng)味物質(zhì)，共20 種，它們主要是不飽和脂肪酸的衍生物。已有研究表明，歐拉羊肉的不飽和脂肪酸水平較高［14，17］，為其風(fēng)味形成提供了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。與其他3 種羊肉類似，歐拉羊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中具有庚醛、壬醛、己醛等直鏈醛，分別具有油脂、青草味，是構(gòu)成羊肉揮發(fā)性風(fēng)味的主要物質(zhì)。在4 種羊肉中均檢測到了由苯丙氨酸通過Strercker 途徑降解形成的苯乙醛［18］，具有蜂蜜甜味，氣味閾值較低。不同之處在于，歐拉羊肉風(fēng)味物質(zhì)中含有特征性的癸醛、4-乙基苯甲醛以及更多種單不飽和、多不飽和醛，具體包括(E)-2-己烯醛、(E)-2-庚烯醛、(E，E)-2，4-庚二烯醛、(E，Z)-2，6-壬二烯醛、(E，E)-2，4-辛二烯醛。其中，(E，E)-2，4-庚二烯醛(堅(jiān)果味)、(E，Z)-2，6-壬二烯醛(黃瓜味)是α-亞麻酸衍生物［19］，這些風(fēng)味成分的差異主要是由羊脂肪酸組成差異所致。

在檢測到的呈味雜環(huán)類化合物中，烷基衍生物大多是脂肪的降解產(chǎn)物，如2-正戊基呋喃、2-乙基吡啶分別是亞油酸［20］和二十碳五烯酸［7］的氧化分解產(chǎn)物，二者分別提供了烤肉味和焦糖味，其中2-乙基吡啶是歐拉羊肉中的特征風(fēng)味物質(zhì)。含硫雜環(huán)化合物大多是含硫氨基酸參與美拉德反應(yīng)得到的衍生物，如2-乙?；量┦枪入赘孰?葡萄糖反應(yīng)體系的產(chǎn)物［21］，其具有堅(jiān)果味和面包香。同時(shí)，在歐拉羊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中檢測到特征性的苯并噻唑，屬于熟肉的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)之一［22］，主要來源于半胱氨酸和葡萄糖反應(yīng)體系，氣味閾值較低［23］，對羊肉油脂香味有很大貢獻(xiàn)。此外，區(qū)別于湖羊，沒有在歐拉羊肉中發(fā)現(xiàn)糠醇這一物質(zhì)，其具有焦味。

與其他3 種羊不同，在歐拉羊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中檢測到了沉香醇，屬于鏈狀萜烯醇類，具有柑橘味。其他特征性風(fēng)味物質(zhì)包括烷烴類的檸檬烯、4-異丙基甲苯和酮類的6-甲基-5-庚烯-2-酮、3-辛烯-2-酮、3，5-辛二烯-2-酮、苯乙酮等。另一方面，沒有在歐拉羊肉中檢測到具有氣味活性的戊醇和2-十一酮，也沒有發(fā)現(xiàn)辛酸、己酸等膻味物質(zhì)。

圖1 展示了4 種羊肉不同種類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類數(shù)量所占百分比情況。歐拉羊肉揮發(fā)性成分中醛類數(shù)目占比最高，超過1/3 的物質(zhì)為醛類，所含雜環(huán)類、烷烴類和醇類的數(shù)目占比次之，均占15%左右。與其他品種羊肉相比，歐拉羊肉風(fēng)味中雜環(huán)類和酮類物質(zhì)種類占比相對較高，醇類物質(zhì)數(shù)目占比相對較低，并且沒有發(fā)現(xiàn)酸類物質(zhì)。羊肉風(fēng)味物質(zhì)中大多數(shù)酸類物質(zhì)是脂肪酸等前體物質(zhì)在綿羊體內(nèi)經(jīng)過一系列代謝形成的［24］，這些代謝途徑受到細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450 2A6，CYP2A6)、驅(qū)動(dòng)蛋白樣蛋白KIF12(Kinesin-like protein 12，KIF12)、細(xì)胞溶質(zhì)磺基轉(zhuǎn)移酶1C1(Sulfotransferase 1C1，SULT1C1)等關(guān)鍵酶和蛋白的調(diào)控［25］，歐拉羊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中未發(fā)現(xiàn)酸類物質(zhì)可能與其體內(nèi)相應(yīng)酶和蛋白的基因表達(dá)程度有關(guān)。

2.2 定量分析

圖2(圖中* 表示與歐拉羊相比差異顯著，p ＜0.05)顯示了相對含量占比大于5%的4 類風(fēng)味物質(zhì)對羊肉整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)。醛類物質(zhì)在4 種羊肉風(fēng)味物質(zhì)中的相對含量均超過50%，在歐拉羊中占62%，在湖羊中最高達(dá)72%。與其他羊相比，歐拉羊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成中雜環(huán)類化合物含量占比相對較大，相對含量為10%，烷烴類物質(zhì)含量占比相對較低，相對含量為20%。由表1 可知，歐拉羊肉中每類化合物含量較高的代表性物質(zhì)分別為己醛((2 004 ±614)ng/(100 g))、2-正 戊 基 呋 喃((672±164)ng/(100g))、辛醇((251 ±67)ng/(100 g))、苯乙 烯((1 014 ± 264)ng/(100 g))、3-辛 稀-2 酮((72 ±1)ng/(100 g))等，其中己醛是所有揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中含量最高的，它們均有氣味活性。歐拉羊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中(E，E)-2，4-己二烯醛含量顯著高于其他3 種羊，增強(qiáng)了風(fēng)味中的青草氣味。鄰二甲苯含量顯著低于其他3 種羊，辛醛、苯甲醛、苯乙醛、苯甲醇和1-辛烯-3-醇水平較低，顯著低于杜泊羊和灘羊，這可能與綿羊體內(nèi)脂肪酸、氨基酸等前體物質(zhì)的組成有關(guān)［26］。

表1 歐拉羊肉及其他品種羊肉揮發(fā)性風(fēng)味組成Tab.1 Identified volatile compounds of Oula lamb meat and other kinds of lamb meat

圖1 4 種羊肉揮發(fā)性風(fēng)味中各類物質(zhì)種類數(shù)量占比Fig.1 Distribution of amount of each volatile compound class in four kinds of lamb meat

圖2 4 種羊肉主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類的相對含量Fig.2 Percentage of main volatile compound classes content in four kinds of lamb meat

2.3 主成分分析和聚類分析

2.3.1 主成分分析

以4 種羊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量原始數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行主成分分析，降維后提取前兩個(gè)主成分，累積貢獻(xiàn)率為87.709%，表明信息保留程度較為完整，且可以通過前兩個(gè)主成分較好地區(qū)分4 種羊肉風(fēng)味。將旋轉(zhuǎn)后的成分矩陣投影到二維空間平面圖內(nèi)，直接觀察樣本點(diǎn)之間的相似關(guān)系及分布特點(diǎn)［27］，根據(jù)主成分分析原則，樣品點(diǎn)間距離越接近，其揮發(fā)性風(fēng)味組成越相似［28］。由圖3 可知，絕大多數(shù)歐拉羊肉樣品區(qū)別于其他3 種羊肉樣品單獨(dú)聚集在一起，說明在整體風(fēng)味輪廓上歐拉羊肉與其他品種羊肉存在明顯差異。

圖3 4 種羊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分分析Fig.3 PCA loadings plot of volatile compounds of lamb meat

2.3.2 聚類分析

為了進(jìn)一步觀察4 種羊肉樣品組內(nèi)和組間的相似程度與差異，并且在建立歐拉羊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)指紋圖譜時(shí)，排除組內(nèi)差異較大樣本的干擾，得到更為標(biāo)準(zhǔn)化的信息［29］，因此對4 個(gè)品種羊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行聚類分析。方法上采用組間聯(lián)接法，對原始變量采用Z 得分法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的預(yù)處理，以歐氏距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，得到聚類譜系圖。根據(jù)聚類原則，樣本間歐氏距離越短其相似性越高。由圖4(編號1 ～10、11 ～20、21 ～30、31 ～40 分別表示歐拉羊、湖羊、杜泊羊、灘羊樣本)可知，在歐氏距離小于12 時(shí)，10 個(gè)湖羊樣本、9 個(gè)杜泊羊樣本、10 個(gè)灘羊樣本、8 個(gè)歐拉羊樣本分別聚為一類，形成4 個(gè)組，說明4 種羊肉揮發(fā)性風(fēng)味各自具有一定區(qū)別度，這與PCA 分析結(jié)果一致。當(dāng)歐氏距離為10.5 時(shí)，前3組，即其他3 種羊肉樣本共同聚為一大類，說明歐拉羊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與其他3 種羊具有一定差異。對于歐拉羊來說，第一大類具有8 個(gè)樣本，歐氏距離最大差值為11.5，隨著距離的繼續(xù)增大，樣本5 和樣本4 才相繼并入第一大類，說明樣本5 和樣本4與其余樣本之間相似度低，不宜將其納入后續(xù)指紋圖譜信息的計(jì)算中，以免影響對共有峰識別結(jié)果的可信度。

2.4 指紋圖譜構(gòu)建

根據(jù)聚類分析的結(jié)果，選取相似性最高的8 個(gè)歐拉羊樣本為代表性樣品，根據(jù)其GC-MS 定性定量結(jié)果和嗅聞識別結(jié)果，在色譜峰分析過程中刪除峰面積低于10 000(濃度過低)和保留時(shí)間大于35 min 的峰(此類峰一般為高沸點(diǎn)化合物，沒有香氣)［30-31］，以40 種具有氣味活性物質(zhì)的共有峰建立指紋圖譜。如圖5 所示，大多數(shù)風(fēng)味物質(zhì)的保留時(shí)間集中在5 ～25 min。響應(yīng)值較高的物質(zhì)主要是己醛、庚醛、壬醛、辛醛等直鏈脂肪醛及2-正戊基呋喃、苯乙烯等雜環(huán)類和烷烴類物質(zhì)，它們具有油脂味、青草味等令人愉悅的氣味，對歐拉羊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)輪廓的構(gòu)建貢獻(xiàn)很大。此外，一些歐拉羊肉獨(dú)有的特征性風(fēng)味物質(zhì)，包括具有花香味的苯乙酮、沉香醇，具有柑橘味的4-異丙基甲苯、檸檬烯，具有堅(jiān)果味的(E，E)-2，4-庚二烯醛、3-辛烯-2-酮以及其他氣味閾值較低的風(fēng)味物質(zhì)如苯并噻唑、二甲基三硫醚等，都使歐拉羊揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)輪廓更加豐富，共同構(gòu)成了歐拉羊肉的風(fēng)味物質(zhì)指紋圖譜。

圖4 4 種羊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)聚類分析Fig.4 Cluster pedigree diagram of volatile compounds of lamb meat

圖5 歐拉羊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)指紋圖譜Fig.5 Fingerprint of volatiles of Oula lamb meat

3 結(jié)束語

利用SPME-GC-MS 和嗅聞技術(shù)對歐拉羊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，檢測到揮發(fā)性物質(zhì)53 種，同時(shí)檢測到湖羊、杜泊羊、灘羊3 種羊肉的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分別為24、31、28 種，與這3 種羊肉相比，歐拉羊肉揮發(fā)性風(fēng)味中雜環(huán)類含量占比高，烷烴類含量占比相對較低，未發(fā)現(xiàn)酸類物質(zhì)。歐拉羊肉特征性風(fēng)味物質(zhì)主要包括(E)-2-己烯醛、(E，E)-2，4-庚二烯醛、(E，E)-2，4-辛二烯醛、3-辛烯-2-酮等不飽和醛酮，以及4-異丙基甲苯等烷烴類和苯并噻唑等其他呈味物質(zhì)，它們共同貢獻(xiàn)了水果香、堅(jiān)果味、青草味等令人愉悅的氣味。從主成分分析和聚類分析的結(jié)果可以看出，歐拉羊肉的整體風(fēng)味物質(zhì)輪廓與其他3 種羊有顯著性區(qū)別。最終建立了歐拉羊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)指紋圖譜，以為后續(xù)相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。