單菌落效價測定在阿維菌素菌種篩選中的應用研究

程曦 劉麗虹 劉進峰 高亞琪

摘要 ? ?為減少阿維菌素菌種篩選的工作量，縮短篩選時間，提高篩選效率，本文對阿維菌素菌種單菌落效價進行測定，用單菌落效價初步表達菌株的產(chǎn)抗能力，探索固態(tài)下單菌落效價與液態(tài)下?lián)u瓶效價的相關性。結(jié)果表明，阿維菌素菌種固態(tài)下產(chǎn)抗能力和液態(tài)下產(chǎn)抗能力正關聯(lián)，相關系數(shù)r=0.924?？梢灾粚湫r高的菌株做進一步的搖瓶培養(yǎng)及效價測定，減少篩選工作量，提高篩選效率。

關鍵詞 ? ?阿維菌素菌種;單菌落;篩選;效價測定

中圖分類號 ? ?TQ453 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）12-0129-02 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

阿維菌素（avermectins，AVMs）是由阿維鏈霉菌（Strept-omyces avermitilis）代謝產(chǎn)生的一種效果極佳的大環(huán)內(nèi)酯類殺螨殺蟲劑和潛在的抗生素藥物[1]。其作用機制獨特，與其他抗寄生蟲藥物無交叉耐藥性，毒性低、無殘留[2]。阿維鏈霉菌發(fā)酵液中通常含有8種阿維菌素組分，即A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a和B2b，其中B1組分，尤其是B1a組分的殺蟲效果最佳，目前B1a組分也是商品化阿維菌素產(chǎn)品的主要成分[3-4]。在近20年的阿維菌素工業(yè)化生產(chǎn)中，通過菌種篩選、發(fā)酵配方和控制工藝的不斷優(yōu)化，發(fā)酵水平不斷提高，特別是中國科學院微生物研究所引進合成生物學技術，將阿維菌素單位產(chǎn)量提高1 000倍，至9 g/L[5]。然而，當下阿維菌素的生產(chǎn)中仍然存在生產(chǎn)穩(wěn)定性差、高消耗、高污染、片面追求生產(chǎn)規(guī)模的粗放發(fā)展等問題，若要從根本上解決這些問題，就需要對阿維菌素的生產(chǎn)菌種——阿維鏈霉菌進行持續(xù)的改良篩選。

誘變篩選是進行阿維鏈霉菌改良的主要方法。阿維鏈霉菌菌株經(jīng)過誘變處理后，正變異率極低。傳統(tǒng)的篩選方法是根據(jù)單菌落外觀（如形狀、顏色）挑選單菌落并進行后續(xù)培養(yǎng)及液態(tài)下的搖瓶效價測定。該方法存在隨機性強、篩選工作量大以及耗時長等問題。如果測定固態(tài)下的單菌落效價，用單菌落效價表達菌株產(chǎn)能，就避免了大量的斜面培養(yǎng)、種子瓶培養(yǎng)和發(fā)酵瓶培養(yǎng)操作過程，可以極大地減少工作量，提高篩選效率。采用該方法時需要解決的一個關鍵問題是阿維鏈霉菌在固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生效價時，其在搖瓶培養(yǎng)中是否產(chǎn)生效價，如果產(chǎn)生，2種情況下效價的關聯(lián)程度如何。例如，日本明治制果公司曾從土壤中分離出放線菌，并對其在固態(tài)和液態(tài)下的產(chǎn)抗能力（即效價）做了相關統(tǒng)計。結(jié)果顯示，在將這些固態(tài)發(fā)酵中有抗菌活性的1 300株菌種，再做液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)有活性的占1 275株，而25株在液態(tài)發(fā)酵時變得無抗菌活性[6]。阿維鏈霉菌屬于放線菌的一種，其在固態(tài)菌落發(fā)酵和液態(tài)培養(yǎng)瓶發(fā)酵存在一定的差別，目前關于阿維鏈霉菌在固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵下所產(chǎn)生效價之間的關聯(lián)性尚不明確。

基于上述研究背景，本文對阿維菌素菌種——即阿維鏈霉菌在固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵下所產(chǎn)生效價之間的關聯(lián)性進行系統(tǒng)研究，進而有助于根據(jù)固態(tài)下的單菌落效價對菌株進行初步篩選，以達到減少阿維菌素菌種篩選工作量和提高篩選效率的目的。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗材料

1.1.1 ? ?菌株。試驗菌株為河北興柏農(nóng)業(yè)科技有限公司生產(chǎn)用菌種AV-37。

1.1.2 ? ?培養(yǎng)基。①單菌落及斜面孢子。組分為葡萄糖15 g/L、牛肉粉3 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、天冬氨酸0.5 g/L、瓊脂粉25 g/L。培養(yǎng)條件為溫度28～29 ℃，時間10～12 d。②搖瓶種子。組分為玉米淀粉25 g/L、黃豆餅粉8 g/L、花生餅粉10 g/L、酵母膏4 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈷0.01 g/L。培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速220 r/min，溫度28～29 ℃，時間45～50 h。③搖瓶發(fā)酵。組分為玉米淀粉140 g/L、淀粉酶0.6 g/L、豆餅粉25 g/L、酵母粉10 g/L、輕質(zhì)碳酸鈣0.5 g/L、硫酸銨0.25 g/L、氯化鈷0.02 g/L、鉬酸鈉0.02 g/L、硫酸錳0.01 g/L。搖瓶裝量40 mL，接種量2 mL，培養(yǎng)條件為溫度27～28 ℃，轉(zhuǎn)速220 r/min，時間12 d。

1.2 ? ?試驗方法

1.2.1 ? ?單菌落制備及培養(yǎng)。生產(chǎn)用斜面孢子作為出發(fā)菌株。將20 mL無菌水加入茄子瓶中，用接種環(huán)刮下孢子做成孢子懸浮液。取7 mL孢子懸浮液，加入到放置有磁力攪拌棒的規(guī)格為90 mm×15 mm的培養(yǎng)皿中，在磁力攪拌的作用下（轉(zhuǎn)速100 r/min），進行UVC波段（254 nm）間歇照射30 min（20 min+10 min）。取照射后的懸液1 mL進行梯度稀釋，分別取10-4～10-3稀釋液0.2 mL，與0.3 mL濃度為0.5 mol/L的氯化鋰溶液混合，涂于無菌雙碟培養(yǎng)基上，用牛皮紙包裹，在28～29 ℃條件下倒置培養(yǎng)至第4～5天，用無菌牙簽有選擇地將原菌落（An）接種至另一支雙碟培養(yǎng)基中，并做好相應的標識，繼續(xù)培養(yǎng)至11 d。