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    醫(yī)院膠囊制劑微生物限度檢查方法的建立及結(jié)果分析

    2020-07-06 06:28:26李亞楠李甜甜楊莉娜楊曉東
    關(guān)鍵詞:試液菌液無(wú)菌

    李亞楠,李甜甜,沙 淼,楊莉娜,楊曉東

    (西安市食品藥品檢驗(yàn)所微生物室,陜西 西安 710054)

    微生物限度檢查方法是指非無(wú)菌制劑及其原料、輔料受到微生物污染程度的檢查方法,其中包括微生物計(jì)數(shù)法和控制菌檢查法。該方法可用于判斷非無(wú)菌制劑及其原料、輔料等是否符合《中華人民共和國(guó)藥典》的規(guī)定,也可用于指導(dǎo)生產(chǎn)過(guò)程中間產(chǎn)品微生物質(zhì)量監(jiān)控[1]。檢查項(xiàng)目包括需氧菌總數(shù)測(cè)定、霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定以及控制菌檢查。本實(shí)驗(yàn)研究所用的3種醫(yī)院膠囊制劑(黃參胰生膠囊、祛風(fēng)寧膠囊和松萜靈膠囊)為含多種中藥成分的復(fù)方制劑,處方配伍較復(fù)雜,其中所含的黃參、黃芪、川楝子及丹參等均具有較強(qiáng)的抑菌能力[2-4]。含抑菌成分的制劑在進(jìn)行微生物限度檢查時(shí),需消除制劑的抑菌活性后再根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢查[5-7]。對(duì)3種醫(yī)院膠囊制劑按照《中華人民共和國(guó)藥典:四部》(2015年版)“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查”中微生物計(jì)數(shù)法(通則1105)和控制菌檢查(通則1106)分別進(jìn)行方法驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)膠囊制劑對(duì)于細(xì)菌的抑菌性極高,但在拆分膠囊殼分別對(duì)膠囊劑內(nèi)容物和膠囊殼進(jìn)行試驗(yàn)后,發(fā)現(xiàn)藥物本身通過(guò)常規(guī)方法即可完成微生物限度檢查。目前,對(duì)膠囊制劑的微生物限度檢查普遍集中于如何消除藥物的抑菌性,但鮮有考慮該抑菌性是否由于膠囊殼自身原因引起。本研究旨在提示進(jìn)行膠囊制劑微生物限度檢查采用常規(guī)方法難以消除藥物抑菌性時(shí),建議關(guān)注膠囊殼是否在其中起到抑菌作用,從而為微生物限度檢查法提供新思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 儀器:LRH-250型需氧菌及控制菌培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司);MJ-Ⅱ型霉菌和酵母菌培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司);SX-500型壓力蒸汽滅菌器(日本TOMY公司)。

    1.1.2 藥品及培養(yǎng)基:3種醫(yī)院膠囊制劑(黃參胰生膠囊、祛風(fēng)寧膠囊和松萜靈膠囊)均由西安市某醫(yī)院提供。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(tryptose agar,TSA)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Sabouraud’s dextrose agar,SDA)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(trypticase soy broth,TSB)、麥康凱液體培養(yǎng)基、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基及沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(Sabouraud’s dextrose broth,SDB)由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn);麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、木糖賴(lài)氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養(yǎng)基由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn);紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基由北京陸橋技術(shù)股份有限公司生產(chǎn);RV沙門(mén)菌增菌液體培養(yǎng)基由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)。

    1.1.3 菌株:金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、乙型副傷寒沙門(mén)菌[CMCC(B)50094]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]和黑曲霉[CMCCF(F)98003]均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院,且為第2代。

    1.2 方法

    1.2.1 菌液的制備:取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物,分別用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋?zhuān)瞥珊鷶?shù)<10 000 CFU/ml的菌懸液,備用;取黑曲霉新鮮培養(yǎng)物,用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液3~5 ml,將孢子洗脫,然后采用適宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi),用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成含孢子數(shù)<10 000 CFU/ml的孢子懸液,備用;取大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和沙門(mén)菌新鮮培養(yǎng)物,分別用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋?zhuān)瞥珊鷶?shù)<100 CFU/ml的菌懸液,備用。

    1.2.2 供試液的制備:稱(chēng)取供試品10 g,加入pH為7.0的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(耐膽鹽革蘭陰性菌檢查用TSB作為稀釋劑)至100 ml,混勻,制成1∶10的供試液。取1∶10供試液50 ml,加入pH為7.0的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml,混勻,制成1∶20的供試液。取1∶10供試液20 ml,加入pH為7.0的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml,混勻,制成1∶50的供試液。取1∶10供試液10 ml,加入pH為7.0的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml,混勻,制成1∶100的供試液。

    1.2.3 需氧菌總數(shù)測(cè)定方法適用性試驗(yàn):(1)試驗(yàn)組。取上述1∶10(或1∶20)的供試液分裝于5個(gè)無(wú)菌試管中,每管9.9 ml,分別加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉菌懸液(<10 000 CFU/ml)0.1 ml,混勻后分別注入培養(yǎng)皿,每皿1 ml,33 ℃下培養(yǎng)5 d,測(cè)定試驗(yàn)組菌數(shù)。(2)供試品對(duì)照組。取上述1∶10(或1∶20)的供試液,以菌液稀釋液(0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液)代替菌液同試驗(yàn)組操作,測(cè)定供試品本底菌數(shù)。(3)菌液組。取pH為7.0的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液,按試驗(yàn)組操作加入菌液,測(cè)定各試驗(yàn)菌菌數(shù)。

    1.2.4 霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定方法適用性試驗(yàn):(1)試驗(yàn)組。取上述1∶10的供試液分裝于2個(gè)無(wú)菌試管中,每管9.9 ml,分別加入白色念珠菌、黑曲霉菌懸液(<10 000 CFU/ml)0.1 ml,混勻后分別注入培養(yǎng)皿,每皿1 ml,23 ℃下培養(yǎng)7 d,測(cè)定試驗(yàn)組菌數(shù)。(2)供試品對(duì)照組。取上述1∶10的供試液,以菌液稀釋液(0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液)代替菌液同試驗(yàn)組操作,測(cè)定供試品本底菌數(shù)。(3)菌液組。取pH為7.0的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液,按試驗(yàn)組操作加入菌液,測(cè)定各試驗(yàn)菌菌數(shù)。(4)需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)按《中華人民共和國(guó)藥典:四部》(2015年版)“微生物回收”規(guī)定的方法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù),若(試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對(duì)照組菌落數(shù))/菌液組菌落數(shù)的比值在0.5~2.0范圍內(nèi),認(rèn)為該方法可用于該樣品的菌落計(jì)數(shù)。

    1.2.5 大腸埃希菌檢查方法適用性試驗(yàn):(1)試驗(yàn)組。取TSB 1份(100 ml),加入1∶10的供試液10 ml和<100 CFU的大腸埃希菌。(2)陽(yáng)性對(duì)照組。取TSB 1份(100 ml),加入與試驗(yàn)組相同的菌液。(3)陰性對(duì)照組。取TSB 1份(100 ml),加入稀釋液10 ml。(4)供試品對(duì)照組:取TSB 1份(100 ml),加入1∶10的供試液10 ml。按《中華人民共和國(guó)藥典:四部》(2015年版)通則1106“大腸埃希菌”項(xiàng)下方法進(jìn)行試驗(yàn)。

    1.2.6 沙門(mén)菌檢查方法適用性試驗(yàn):(1)試驗(yàn)組。取TSB 1份(200 ml),加入10 g供試品和<100 CFU的乙型副傷寒沙門(mén)菌。(2)陽(yáng)性對(duì)照組。取TSB 1份(200 ml),加入與試驗(yàn)組相同的菌液。(3)陰性對(duì)照組。取TSB 1份(200 ml),加入稀釋液10 ml。(4)供試品對(duì)照組。取TSB 1份(200 ml),加入10 g供試品。按《中華人民共和國(guó)藥典:四部》(2015年版)通則1106“沙門(mén)菌”項(xiàng)下方法進(jìn)行試驗(yàn)。

    1.2.7 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法適用性試驗(yàn):(1)試驗(yàn)組。取腸道菌增菌液體培養(yǎng)基6管(每管10 ml),分為兩組各3管,第1組分別加入1∶10、1∶100和1∶1 000的供試液各1 ml,同時(shí)每管加入<100 CFU的大腸埃希菌;第2組的方法同第1組,分別加入<100 CFU的銅綠假單胞菌。(2)陽(yáng)性對(duì)照組。取腸道菌增菌液體培養(yǎng)基2管(每管10 ml),分別加入與試驗(yàn)組相同的大腸埃希菌和銅綠假單胞菌。(3)陰性對(duì)照組。取腸道菌增菌液體培養(yǎng)基1管(10 ml),加入稀釋液1 ml。(4)供試品對(duì)照組。取腸道菌增菌液體培養(yǎng)基3管(每管10 ml),分別加入1∶10、1∶100和1∶1 000的供試液各1 ml。按《中華人民共和國(guó)藥典:四部》(2015年版)通則1106“耐膽鹽革蘭陰性菌”項(xiàng)下方法進(jìn)行試驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 1∶10供試液平皿法需氧菌總數(shù)及霉菌、酵母菌總數(shù)測(cè)定結(jié)果

    1∶10供試液平皿法測(cè)定3種醫(yī)院膠囊制劑對(duì)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn),上述供試品對(duì)白色念珠菌和黑曲霉無(wú)顯著抑制作用,回收率在0.5~2.0范圍內(nèi),符合《中華人民共和國(guó)藥典》關(guān)于“微生物回收”的要求;但銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均為0,說(shuō)明1∶10供試液對(duì)細(xì)菌的抑菌性極強(qiáng),需對(duì)供試液進(jìn)行稀釋。

    2.2 1∶20、1∶50和1∶100供試液平皿法對(duì)3種細(xì)菌的回收率測(cè)定結(jié)果

    1∶20、1∶50和1∶100供試液平皿法測(cè)定3種醫(yī)院膠囊制劑對(duì)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn),將供試液稀釋至1∶100時(shí),上述3種細(xì)菌回收率仍為0,未能消除供試液的抑菌性。

    表1 1∶10供試液平皿法回收率測(cè)定結(jié)果(%)

    注:“*”表示回收率分別為T(mén)SA和SDA培養(yǎng)基上的2組結(jié)果

    Note: “*” indicates that the recoveries are the results of two groups on TSA and SDA media

    表2 1∶20、1∶50和1∶100供試液平皿法對(duì)3種細(xì)菌的回收率測(cè)定結(jié)果(%)

    2.3 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

    分別取1∶10、1∶100和1∶1 000供試液1 ml進(jìn)行耐膽鹽革蘭陰性菌檢查;取1∶10供試液10 ml進(jìn)行大腸埃希菌檢查;取供試品10 g進(jìn)行沙門(mén)菌檢查,結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn),3種醫(yī)院制劑1∶10、1∶100供試液取1 ml,加入10 ml腸道菌增菌液體培養(yǎng)基體積未能使革蘭陰性菌生長(zhǎng),1∶1 000供試液取1 ml時(shí)方可使革蘭陰性菌生長(zhǎng);在將腸道菌增菌液體培養(yǎng)基體積擴(kuò)大至50 ml時(shí),1∶100供試液1 ml試驗(yàn)組可檢出耐膽鹽革蘭陰性菌;分別將TSB的體積擴(kuò)大至1 500、3 000 ml,仍未檢出大腸埃希菌和沙門(mén)菌,說(shuō)明培養(yǎng)基稀釋法未能消除上述3種制劑的抑菌性。

    2.4 膠囊制劑內(nèi)容物、膠囊殼需氧菌總數(shù)及霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定結(jié)果

    膠囊制劑內(nèi)容物、膠囊殼平皿法回收率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn),1∶20供試品內(nèi)容物對(duì)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉無(wú)顯著抑制作用,回收率在0.5~2.0范圍內(nèi),符合《中華人民共和國(guó)藥典》關(guān)于“微生物回收”的要求;但1∶20稀釋后的膠囊殼對(duì)3種細(xì)菌的抑菌未消除,細(xì)菌回收率為0,隨后將膠囊殼濃度稀釋至1∶200進(jìn)行試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)膠囊殼的抑菌性仍未消除,3種細(xì)菌的回收率為0。

    表3 控制菌驗(yàn)證結(jié)果

    注:“+”表示正常生長(zhǎng);“-”表示未生長(zhǎng);“/”表示已通過(guò)數(shù)據(jù)無(wú)需進(jìn)行試驗(yàn)

    Note: “+” indicates normal growth; “-” indicates no growth; “/” indicates the data has passed and no test is required

    表4 膠囊制劑內(nèi)容物、膠囊殼平皿法回收率測(cè)定結(jié)果(%)

    注:“*”表示回收率分別為T(mén)SA和SDA培養(yǎng)基上的2組結(jié)果;“/”表示已通過(guò)數(shù)據(jù)無(wú)需進(jìn)行試驗(yàn)

    Note: “*” indicates that the recoveries are the results of two groups on TSA and SDA media; “/” indicates the data has passed and no test is required

    2.5 膠囊制劑內(nèi)容物控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

    膠囊制劑去除膠囊殼后,對(duì)內(nèi)容物進(jìn)行控制菌檢查方法適用性試驗(yàn),結(jié)果顯示,耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌和沙門(mén)菌均可通過(guò)《中華人民共和國(guó)藥典》所規(guī)定的常規(guī)法檢出,見(jiàn)表5。

    表5 膠囊制劑內(nèi)容物控制菌驗(yàn)證結(jié)果

    注:“+”表示正常生長(zhǎng)

    Note: “+” indicates normal growth

    3 討論

    3種醫(yī)院膠囊制劑的內(nèi)容物可按《中華人民共和國(guó)藥典:四部》(2015年版)通則1105“平皿法”(1∶20供試液,每皿1 ml)進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查;按《中華人民共和國(guó)藥典:四部》(2015年版)通則1106“常規(guī)法”進(jìn)行控制菌檢查。但在不去除膠囊殼的情況下,需氧菌總數(shù)檢查、控制菌檢查均不能通過(guò)稀釋供試液或擴(kuò)大培養(yǎng)基體積的方法獲得結(jié)果。以上結(jié)果均表明,膠囊殼中含有顯著抑制微生物生長(zhǎng)的成分。

    膠囊制劑已成為除片劑以外的口服固體制劑的主要?jiǎng)┬椭?。明膠膠囊所用明膠是由動(dòng)物的骨、皮經(jīng)水解制得,屬于蛋白類(lèi)物質(zhì)(骨膠或皮膠)[8-11]。明膠膠囊殼作為一種特殊的藥用輔料,其質(zhì)量與藥性發(fā)揮程度息息相關(guān)。劣質(zhì)膠囊殼不僅會(huì)對(duì)藥品質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面作用,嚴(yán)重時(shí)甚至影響人體健康[12]。影響明膠空心膠囊質(zhì)量的因素繁多,總結(jié)歸納大致可分為3類(lèi),即重金屬含量超標(biāo)、防腐劑和抑菌劑的超標(biāo)使用以及獸藥、抗菌藥物等的殘留[13]。重金屬含量超標(biāo)的原因是由于不法生產(chǎn)企業(yè)使用皮革廢料代替藥用明膠,廢料中含較多重金屬元素(特別是鉻離子),而以目前的脫鉻技術(shù)難以去除鉻離子[14-15]。同時(shí),生產(chǎn)企業(yè)為了達(dá)到膠囊殼微生物指標(biāo)合格的目的,人為加入過(guò)量的防腐劑(如對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi))和抑菌劑(如環(huán)氧乙烷)。此外,明膠的生產(chǎn)材料多為豬、牛和羊等的骨、皮毛,其上殘留的獸藥、抗菌藥物等對(duì)明膠空心膠囊的質(zhì)量?jī)?yōu)劣形成潛在風(fēng)險(xiǎn)。

    目前,關(guān)于膠囊殼殘留重金屬、防腐劑、抑菌劑、獸藥及抗菌藥物對(duì)微生物生長(zhǎng)是否產(chǎn)生影響或產(chǎn)生何種影響,并無(wú)相關(guān)報(bào)道。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對(duì)本研究中所使用的膠囊殼進(jìn)行理化檢驗(yàn),分析其所含成分;同時(shí),針對(duì)其成分選取不同種類(lèi)的中和劑,驗(yàn)證是否可消除膠囊殼的抑菌性,使微生物限度檢查方法更加科學(xué)、系統(tǒng)和完善。

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