右美托咪定對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠糖萼的影響

馬海波 楊迎春 劉晶晶 穆東亮 夏瑞

[摘要] 目的 探討右美托咪定對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠糖萼的影響。 方法 將C57BL6/J雄性成年小鼠45只按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、生理鹽水組和右美托咪定組，每組各15只。假手術(shù)組僅切開右側(cè)頸部皮膚，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈。右美托咪定組為造模前30 min，腹腔注射右美托咪定40 μg/kg，然后建立缺血60 min再灌注24 h后急性腦缺血再灌注損傷模型。生理鹽水組為造模前30 min，腹腔注射等容量生理鹽水，然后建立缺血60 min再灌注24 h后急性腦缺血再灌注損傷模型。采用TTC染色法計(jì)算腦梗死體積百分比;采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）表達(dá);采用ELISA檢測氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白[丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）]表達(dá)。 結(jié)果 與生理鹽水組比較，右美托咪定組的腦梗死體積顯著減小，神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。與生理鹽水組比較，右美托咪定組的活動(dòng)時(shí)間和活動(dòng)距離顯著延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。與生理鹽水組比較，右美托咪定組的HPSE/β-actin、TNF-α/β-actin、NF-κB/β-actin水平均顯著降低，SDC-1/β-actin、Tie-2/β-actin水平均顯著升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。與生理鹽水組比較，右美托咪定組的TNF-α和IL-6水平均顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。與生理鹽水組比較，右美托咪定組的MDA水平顯著降低，SOD水平顯著升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 右美托咪定對(duì)腦缺血再灌注損傷糖萼具有良好的保護(hù)作用，且具有腦保護(hù)作用，可減輕炎癥和應(yīng)激反應(yīng)。

[關(guān)鍵詞] 右美托咪定;腦缺血再灌注損傷;糖萼;炎性因子;氧化應(yīng)激

[中圖分類號(hào)] R-332? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）05（a）-0008-06

Effect of Dexmedetomidine on glycocalyx in mice with cerebral ischemia-reperfusion injury

MA Haibo1? ?YANG Yingchun2? ?LIU Jingjing3? ?MU Dongliang4? ?XIA Rui5▲

1.School of Medicine， Yangtze University， Hubei Province， Jingzhou? ?434023， China; 2.Department of Anesthesiology， Beijing Fengtai Hospital， Beijing? ?100071， China; 3.Department of Anesthesiology， Beijing Armed Police Corps Hospital， Beijing? ?100027， China; 4.Department of Anesthesiology， the First Hospital of Peking University， Beijing? ?100034， China; 5.Department of Anesthesiology， the First Hospital of Yangtze University， Hubei Province， Jingzhou? ?434000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Dexmedetomidine on glycocalyx in mice with cerebral ischemia-reperfusion injury. Methods Forty-five C57BL6/J male adult mice were randomly divided into sham operation group， normal saline group and Dexmedetomidine group， with 15 mice in each group. In sham operation group， only the skin of the right neck was cut and the right common carotid artery was exposed. In Dexmedetomidine group， 40 μg/kg Dexmedetomidine was injected intraperitoneally 30 minutes before the establishment of the model. The mice in normal saline group were injected with equal volume of normal saline 30 minutes before modeling， and then acute cerebral ischemia-reperfusion injury model was established 24 hours after 60 minutes of ischemia-reperfusion. The percentage of infarct volume was calculated by TTC staining， the expression of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， and the expression of oxidative stress-related proteins （malondialdehyde [MDA]， superoxide dismutase [SOD]） were detected by ELISA. Results Compared with normal saline group， the infarct volume and neurological deficit score of Dexmedetomidine group were significantly reduced， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Compared with normal saline group， the activity time and distance of Dexmedetomidine group were significantly lengthened， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with normal saline group， the levels of HPSE/β-actin， TNF-α/β-actin and NF-κB/β-actin in Dexmedetomidine group were significantly decreased， and the levels of SDC-1/β-actin and Tie-2/β-actin in Dexmedetomidine group were significantly increased， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Compared with normal saline group， the levels of TNF-α and IL-6 in Dexmedetomidine group were significantly reduced， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Compared with normal saline group， MDA level of Dexmedetomidine group was significantly decreased， and SOD level of Dexmedetomidine group was significantly increased， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Conclusion Dexmedetomidine can protect glycocalyx from cerebral ischemia-reperfusion injury， reduce inflammation and stress response.

[Key words] Dexmedetomidine; Cerebral ischemia-reperfusion injury; Glycocalyx; Inflammatory factors; Oxidative stress

缺血性腦卒中占腦卒中的大多數(shù)，具有較高致殘率和致死率[1-2]。當(dāng)出現(xiàn)缺血性腦卒中時(shí)，腦組織細(xì)胞在缺血缺氧后恢復(fù)血液灌注，從而導(dǎo)致組織損傷或功能障礙，其功能并未減輕或恢復(fù)，反而加重，稱為腦缺血再灌注損傷[3-4]。隨著我國老齡化社會(huì)的到來以及醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，外科手術(shù)的復(fù)雜性和難度逐步提高，使圍術(shù)期腦缺血再灌注損傷成為麻醉醫(yī)師關(guān)注的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[5-6]。近年來，發(fā)現(xiàn)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞糖萼成為研究腦缺血再灌注損傷的一個(gè)新方向，并且能夠作為腦損傷程度評(píng)估的新的生物標(biāo)志物之一，還能夠作為靶點(diǎn)預(yù)防以及治療圍術(shù)期腦缺血再灌注損傷[7]。右美托咪定是一種新型輔助麻醉藥物，其能夠通過與腎上腺素受體結(jié)合發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，且證實(shí)其具有腦保護(hù)作用[8-9]。本研究旨在探討右美托咪定對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠糖萼的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL6/J雄性成年小鼠45只，SPF級(jí)，8～12周齡，體重25～30 g。小鼠被安置在無菌環(huán)境中的（25±2）℃，濕度（55±5）%，12 h的光照循環(huán)，實(shí)驗(yàn)前至少7 d由專業(yè)動(dòng)物員飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)小鼠購自湖北省疾病預(yù)防控制中心[動(dòng)物合格證號(hào)：NO.42000600034352;許可證號(hào)：SYXK（鄂）2009-0027]，飼養(yǎng)于長江大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，所有實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過長江大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意，實(shí)驗(yàn)過程遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南》。

1.2 主要試藥

乙酰肝素酶（HPSE）、多配體聚糖-1（SDC-1）、血管生成素受體-2（Tie-2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、核因子κB（NF-κB）抗體均購自美國CST公司（#14669S、#12922S、#4224S、#3707S、#8242S），RIPA裂解液及BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物科技公司，TNF-α及白介素-6（IL-6）試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司，丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒購自上海晶抗生物有限公司，鹽酸右美托咪定購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理方法? 按照隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為假手術(shù)組、生理鹽水組和右美托咪定組，各15只。生理鹽水組與右美托咪定組建立缺血60 min再灌注24 h急性腦缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組僅切開右側(cè)頸部皮膚，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈。右美托咪定組為造模前30 min，腹腔注射右美托咪定40 μg/kg。生理鹽水組為造模前30 min，腹腔注射等容量生理鹽水。

1.3.2 腦缺血模型制備? 術(shù)前8 h禁食，允許進(jìn)水。3%異氟醚吸入麻醉，取仰臥位，頸部備皮消毒后，于小鼠頸部正中切口，且對(duì)組織進(jìn)行逐層鈍性分離，右側(cè)迷走神經(jīng)和頸總動(dòng)脈充分暴露且小心分泌，以及盡可能避免損傷迷走神經(jīng)，再向上分離至右側(cè)頸總動(dòng)脈Y型分叉處。小鼠右側(cè)頸外動(dòng)脈與右側(cè)頸總動(dòng)脈近心端分別應(yīng)用絲線縫扎，小動(dòng)脈夾夾閉右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈。于頸總動(dòng)脈近心端剪一破口，再將線栓于小鼠右側(cè)破口處插入，輕輕插入右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，插入9 mm左右，線栓妥善固定。阻塞60 min后將線栓拔出恢復(fù)灌注，縫合傷口。模型成功標(biāo)準(zhǔn)：小鼠清醒后出現(xiàn)損傷對(duì)側(cè)肢體癱瘓以及站立不穩(wěn)，并且提尾時(shí)向損傷對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)為其成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分及行為學(xué)實(shí)驗(yàn)? 神經(jīng)功能缺損評(píng)分采用Longa評(píng)分法，由雙盲觀察者與再灌注24 h后進(jìn)行評(píng)定。從0～4分細(xì)分5個(gè)等級(jí)，0分為正常，無明顯神經(jīng)功能缺失，4分最為嚴(yán)重，小鼠無法自發(fā)行走或有意識(shí)障礙。以Homecage監(jiān)測系統(tǒng)評(píng)價(jià)腦缺血再灌注24 h后于30 min內(nèi)小鼠自發(fā)活動(dòng)時(shí)間與活動(dòng)距離。

1.3.4 血清和腦組織標(biāo)本采集? 24 h后再次麻醉，16號(hào)鈍性針頭插入心臟至主動(dòng)脈根部，血管鉗固定針頭取血，每只小鼠采血量4～5 mL，常溫靜置30 min后，離心4000 r/min×10 min，離心半徑10 cm，分離血清，-80℃下儲(chǔ)存。再用生理鹽水50 mL迅速灌注，見肝臟變白，立即斷頭取腦，冰上取腦組織，-80℃下儲(chǔ)存。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 各組小鼠腦梗死體積變化? 切除小腦和腦干然后以冠狀面均勻切片，切片層厚為2 mm，以新鮮配制的1.5%TTC染色。Image J 圖像處理軟件計(jì)算腦梗死體積百分比。

1.4.2 各組小鼠糖萼損傷情況? Western blot檢測SDC-1、HPSE、Tie-2表達(dá)。取“1.3.4”項(xiàng)下腦組織標(biāo)本，加入0.8 mL細(xì)胞裂解液中，放置于低溫條件下超聲勻漿，離心，取上清液，于-20℃保存?zhèn)溆?。采用BCA法檢測各組蛋白含量。樣品中加入上樣緩沖液，充分混勻后于95℃變性處理5 min。上樣，以β-actin作為內(nèi)參，按0.1 mL/cm2加入一抗溶液，于4℃下過夜。加入二抗孵育1 h，采用Western blot檢測蛋白表達(dá)灰度值。

1.4.3 各組小鼠炎性因子表達(dá)? 取“1.3.4”項(xiàng)下血清標(biāo)本，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測TNF-α和IL-6表達(dá)。

1.4.4 各組小鼠氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)? 取“1.3.4”項(xiàng)下血清標(biāo)本，采用ELISA檢測MDA、SOD表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 8對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Tukey′s檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腦缺血再灌注損傷后梗死體積、神經(jīng)功能缺損評(píng)分及行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

與生理鹽水組比較，右美托咪定組的腦梗死體積顯著減小，神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。與生理鹽水組比較，右美托咪定組的活動(dòng)時(shí)間和活動(dòng)距離顯著延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見圖1。

2.2 各組小鼠腦缺血再灌注損傷后糖萼相關(guān)分子及炎癥相關(guān)分子表達(dá)水平比較

與生理鹽水組比較，右美托咪定組的HPSE/β-actin、TNF-α/β-actin、NF-κB/β-actin水平均顯著降低，SDC-1/β-actin、Tie-2/β-actin水平均顯著升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見圖2。

2.3 各組小鼠腦缺血再灌注損傷后TNF-α和IL-6水平比較

與生理鹽水組比較，右美托咪定組的TNF-α和IL-6水平均顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見圖3。

A：TNF-α水平;B：IL-6水平。TNF-α：腫瘤壞死因子-α;IL-6：白介素-6。**P < 0.01

2.4 各組小鼠腦缺血再灌注損傷后氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

與生理鹽水組比較，右美托咪定組的MDA水平顯著降低，SOD水平顯著升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見圖4。

3 討論

右美托咪定是在手術(shù)室和重癥監(jiān)護(hù)室中廣泛使用的一種新型、高效、高選擇性α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑[10-11]。右美托咪定幾乎不引起呼吸抑制，可安全用于機(jī)械通氣和自主呼吸患者[12]。右美托咪定的腦保護(hù)作用已經(jīng)過臨床驗(yàn)證，然而其機(jī)制尚不清楚。右美托咪定保護(hù)腦功能的機(jī)制是復(fù)雜的[13]。研究表明，右美托咪定可能通過抑制氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，減輕大鼠腦缺血再灌注損傷[14]。另有研究表明，右美托咪定可減少炎癥介質(zhì)和神經(jīng)內(nèi)分泌激素的釋放，維持顱內(nèi)勻漿平衡，減輕缺血性腦損傷，具有腦保護(hù)作用[15]。有文獻(xiàn)報(bào)道，右美托咪定能夠抑制神經(jīng)元自噬，保護(hù)鼠腦免于缺血再灌注損傷[16]。研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定通過抑制TLR4信號(hào)通路減輕新生兒大鼠腦缺血再灌注損傷[17]。

腦血管內(nèi)皮細(xì)胞被一層糖萼分子層所覆蓋，因含有硫酸化的糖胺聚糖側(cè)鏈而帶有負(fù)電荷，從而調(diào)節(jié)血管滲透性[18]。腦內(nèi)皮糖萼作為內(nèi)皮細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)，阻隔了血小板、白細(xì)胞與血管內(nèi)皮的的黏附分子接觸，通過結(jié)合糖胺聚糖可減少白細(xì)胞激活，減輕腦缺血再灌注損傷。HPSE抑制劑通過抑制內(nèi)皮糖萼的降解，可減少內(nèi)生HPSE、炎性壞死因子和促纖維化因子的表達(dá)，從而減輕腦缺血再灌注損傷。缺血再灌注損傷容易導(dǎo)致內(nèi)皮糖萼的脫落，而內(nèi)皮細(xì)胞的激活和內(nèi)皮糖萼的脫落大大增加了缺血再灌注損傷中免疫反應(yīng)、血栓形成和組織損傷的風(fēng)險(xiǎn)[19]。因此，腦血管內(nèi)皮糖萼在圍術(shù)期腦缺血再灌注損傷的預(yù)防、治療和改善預(yù)后均有重要意義。而右美托咪定在腦缺血再灌注損傷中是否對(duì)內(nèi)皮糖萼有保護(hù)作用尚不清楚。血管生成素-1（Ang-1）/Tie-2系統(tǒng)在血管完整性和穩(wěn)定性中起重要作用。研究報(bào)道顯示，鞘內(nèi)注射右美托咪定可以通過抑制缺血再灌注引起的金屬蛋白酶（可降解糖萼成分）釋放，增加Ang-1/Tie-2系統(tǒng)活性，從而保護(hù)血脊髓屏障不受缺血再灌注損傷[20]。

NF-κB及TNF-α作為重要的炎性蛋白，在腦卒中后的炎性反應(yīng)中起著非常重要的作用[21-22]。炎性因子在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要作用，腦缺血后神經(jīng)元可發(fā)生壞死，釋放炎性介質(zhì)，影響腦損傷的轉(zhuǎn)歸。其中TNF-α及IL-6作為重要的炎癥蛋白，在腦缺血再灌注的炎性反應(yīng)中起著非常重要的作用[21-22]。

MDA含量是反映機(jī)體抗氧化潛在能力的重要參數(shù)，可以反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化速率和強(qiáng)度，也能間接反映組織過氧化損傷程度。SOD是生物體內(nèi)存在的一種抗氧化金屬酶，它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用，與很多疾病的發(fā)生、發(fā)展密不可分。MDA和SOD作為重要的氧化應(yīng)激指標(biāo)在腦缺血再灌注損傷中有重要意義。

綜上所述，右美托咪定對(duì)腦缺血再灌注損傷糖萼具有良好的保護(hù)作用，且具有腦保護(hù)作用，減輕炎癥和應(yīng)激反應(yīng)。但本研究仍存在一些不足之處，觀察小鼠相對(duì)較少，未觀測糖萼脫落的其他相關(guān)指標(biāo)，觀察機(jī)制相對(duì)較少，因經(jīng)費(fèi)原因，未設(shè)置糖萼基因敲除對(duì)照組，還需在后續(xù)作多中心、多樣本深入研究，提供可靠的參考價(jià)值。

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（收稿日期：2020-01-10? 本文編輯：李亞聰）