人參皂苷Rb3糖基水解酶的純化及其反應(yīng)特性

張睿哲 徐龍權(quán) 宋建國 魚紅閃

摘 要：? 人參皂苷Rb3是三七莖葉皂苷的主要成分。為了充分利用廉價(jià)的三七莖葉皂苷，該研究以微生物Aspergillus sp. P90r菌為對(duì)象，綜合運(yùn)用生物轉(zhuǎn)化的方法，經(jīng)過提取、分離純化和酶活力測(cè)定等步驟，最終以確定酶反應(yīng)途徑的方式得到了所產(chǎn)的特異性人參皂苷Rb3糖基水解酶的相關(guān)性質(zhì)和動(dòng)力學(xué)等反應(yīng)特性。結(jié)果表明：該酶比Absidia sp. GRB3-X8r菌產(chǎn)酶活力高15%～25%，SDS-PAGE電泳結(jié)果測(cè)得分子量約為65.6 ku，純化后酶蛋白的含量為0.237 mg·mL-1，蛋白比活力可達(dá)到169 U·mg-1，純化倍數(shù)為13.70，回收率為9.39%。人參皂苷Rb3糖基水解酶在pH=5.0的偏酸性環(huán)境下酶活力很高，最適反應(yīng)條件：pH=3.0～5.0，溫度45 ℃，其中在pH=4.0～6.0范圍內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。該酶在20 min時(shí)進(jìn)入混合級(jí)反應(yīng)，酶反應(yīng)米氏常數(shù)Km值為8.77 mmol·L-1，Vmax為57.44 mmol·L-1·h-1，在60 min時(shí)反應(yīng)速度達(dá)到最大，Vmax趨于穩(wěn)定，為66.63 mmol·L-1·h-1。通過對(duì)酶的催化特性研究表明，該酶先水解Rb3的20-O-木糖基，其次水解3-O-葡萄糖基，最終催化反應(yīng)產(chǎn)物中有F2和C-K生成。綜上結(jié)果，微生物Aspergillus sp. P90r菌酶具有能水解人參皂苷Rb3木糖基和葡萄糖基的特異性。

關(guān)鍵詞： 人參皂苷Rb3， 人參皂苷Rb3糖基水解酶， 酶學(xué)性質(zhì)， 酶分離純化， 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

中圖分類號(hào)：? Q814.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A

文章編號(hào)：? 1000-3142（2020）05-0706-09

Purification and reaction characteristics of hydrolyzed ginsenoside Rb3-glycosylase

ZHANG Ruizhe， XU Longquan， SONG Jianguo， YU Hongshan*

（ College of Biology Engineering， Dalian Polytechnic University， Dalian 116034， Liaoning， China ）

Abstract：? Hydrolyzed ginsenoside Rb3 is the main component of Panax notoginseng stem and leaf saponins. In order to make full use of cheap P. notoginseng stem and leaf saponins，? the microorganism Aspergillus sp. P90r was studied， and we used the biotransformation methods comprehensively. Related properties， kinetics and other reaction characteristics of the specific ginsenoside Rb3-glycosylase were produced by determining the way of enzymatic reaction through extraction， separation， purification， enzyme activity determination and other steps. The results were as follows： This enzyme activity was 15%-25% higher than the enzyme by Absidia sp. GRB3-X8r. The result of the molecular weight of enzyme protein was 65.6 ku by SDS-PAGE electrophoresis. The content of enzyme protein was 0.237 mg·mL-1 after purification， the specific activity of the protein was attainable as 169 U·mg-1， the purification factor was 13.70 and the recovery rate was 9.39%. And the enzyme activity of ginsenoside Rb3-glycosylase was higher in the pH 5.0 of acidic environment. The enzyme was suitable condition in the range of pH 3.0-5.0， in the temperature of 45 ℃， and it was relative stable in the range of pH 4.0-6.0. The enzyme entered the mixed-order reaction at 20 min， and the results of the enzyme reaction kinetics showed that the Km value was 8.77 mmol·L-1 and Vmax was 57.44 mmol·L-1·h-1. The reaction rate reached the maximum at 60 min， and the speed tended to be stable， and Vmax was 66.63 mmol·L-1·h-1. The results on catalytic properties of enzymes showed that the enzyme firstly hydrolyzes 20-O-xylose of ginsenoside Rb3， secondly hydrolyzes 3-O-glucosyl， eventually which the catalytic reaction products include the formed substance of F2 and C-K. In summary， the microbial Aspergillus sp. P90r enzyme has the specificity to hydrolyzed ginsenoside Rb3-xylose and Rb3-glucose.

Key words： hydrolyzed ginsenoside Rb3， hydrolyzed ginsenoside Rb3-glycosylase， enzyme properties， isolation and purification， enzyme kinetics

我國高產(chǎn)量的人參屬植物是人參（Panax ginseng）、三七（P. notoginseng）、西洋參（P. quinguefolus）等，其人參屬植物中化學(xué)成分比較復(fù)雜，主要的有效活性物質(zhì)是人參皂苷（宋亞會(huì)和姜曉軍，2009）。其主要活性成分為人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1等（金鳳燮，2009）。目前，已分離鑒定出182種人參皂苷（Kim et al.， 2017）?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，某些稀有人參皂苷具有很好的藥理和臨床方面的療效。因此，利用生物轉(zhuǎn)化法，用含量較高的人參皂苷為底物，獲得產(chǎn)量大、純度高的稀有人參皂苷，具有非常重要的科研意義和社會(huì)價(jià)值（張怡軒等，2008;吳紅金和劉宇娜，2008;Jia，2009;Jin et al.， 2012;居乃香和孫靜，2014;韓淑嫻和游云，2016;毛柳珺，2017）。

三七莖葉皂苷以Rb3為主，Rb3分子帶有20-O-Xyl-Glc-糖鏈和3-O-Glc-Glc-糖鏈，活性低、難吸收，因此三七莖葉利用率低（金鳳燮，2009）。為了提高三七莖葉皂苷的利用價(jià)值，將Rb3轉(zhuǎn)化為高活性、低糖基的F2、C-K皂苷，是提高三七莖葉皂苷利用度的可行途徑。為此，本實(shí)驗(yàn)室研究了Rb3的生物轉(zhuǎn)化，Asperginllus niger g.48菌產(chǎn)人參皂苷酶I型（分子量為74 kD），同時(shí)水解Rb3的20-O-木糖基和3-O-葡萄糖基，通過Rb3→C-Mx1→C-Mx→C-K途徑和Rb3→Rd→F2→C-K的兩個(gè)途徑水解Rb3（Liu et al.， 2014）;還有A. niger g.848菌所產(chǎn)的人參皂苷酶I型（分子量為75kD），水解Rb3的糖基，生成Rd、F2、C-K等皂苷（Liu et al.， 2015）;但上述兩種A. niger所產(chǎn)的人參皂苷酶水解的三七莖葉皂苷主要生成人參皂苷C-Mx和C-K，并有越南參皂苷R7和三七參皂苷Fc殘留，說明A. niger菌產(chǎn)酶與三七莖葉復(fù)合皂苷反應(yīng)時(shí)，很難水解C-Mx或Rb3皂苷的20-O-末端木糖基，對(duì)R7和Fc皂苷的3-O-末端木糖基無水解作用，影響了高活性皂苷C-K的產(chǎn)率。為了解決酶很難水解三七莖葉皂苷的木糖基問題，趙信平等（2018）研究了Absidia sp. GRB3-X8r菌產(chǎn)特異性人參皂苷Rb3木糖苷酶（分子量66.7 kDa），但是該酶僅能水解Rb3的20-O-木糖基，欠缺進(jìn)一步水解3-O-葡萄糖基生成F2的酶活力。因此，本文利用生物轉(zhuǎn)化法研究另一種微生物Aspergillus sp. P90r菌所產(chǎn)的人參皂苷Rb3糖基水解酶，以期獲得純酶的相關(guān)性質(zhì)和動(dòng)力學(xué)等反應(yīng)特性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

Aspergillus sp. P90r菌，本實(shí)驗(yàn)室從大曲中篩選分離得到。人參皂苷Rb3、Rd、F2、C-K，由天樂集團(tuán)提供。標(biāo)準(zhǔn)蛋白（齊崴等，2005），購于大連寶生物公司。檸檬酸、過硫酸銨為天津市大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品;丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺為北京化工廠產(chǎn)品;甘氨酸、溴酚藍(lán)、考馬斯亮蘭G250、四甲基乙二胺（TEMED）購置于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;十二烷基硫酸鈉為北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心產(chǎn)品;以上試劑均為分析純?cè)噭?/p>

薄層層析板Silica gel 60-F254，德國Merck公司產(chǎn)品;DEAE-Cellulose DE-52，英國Whatman公司產(chǎn)品;CS930雙波長(zhǎng)薄層掃描儀購置于日本津島公司;BSZ-160自動(dòng)部分收集器由上海金生達(dá)生化儀器有限公司提供;蛋白質(zhì)電泳儀購置于Bio-Rad 公司;Waters 2695高效液相色譜儀;Waters 2996 PDA光電二極管陣列檢測(cè)器;Knauer C18色譜柱（5 μm，3 mm × 250 mm）。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的制備 Aspergillus sp. P90r菌接種于含5%的麥汁、1%的三七莖葉浸出液，pH=6.6的察氏培養(yǎng)基中，在30 ℃搖床培養(yǎng)5～6 d;離心除菌體，上清液中緩慢加入已研磨好的硫酸銨粉末至80 %飽和度，搖勻，于4 ℃下靜置6 h;離心收集蛋白質(zhì)沉淀。將沉淀溶于少量的0.01 mol·L-1 pH=3.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，透析，每2 h更換一次緩沖液，透析20 h;離心除雜，沉淀溶于0.02 mol·L-1 pH3.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，即為粗酶液。

1.2.2 酶活力的測(cè)定 取0.1 mL的0.2%的人參皂苷Rb3（0.02 mol·L-1，pH3.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液）與0.1 mL粗酶液混合，在45 ℃條件下反應(yīng)24 h，加入0.2 mL水飽和正丁醇終止酶反應(yīng)，取上層有機(jī)相作TLC薄層層析或HPLC檢測(cè)。酶活力單位，定義為每小時(shí)降解1 mmol Rb3酶量為一個(gè)酶活力單位。

1.2.3 薄層層析（TLC） 酶水解人參皂苷Rb3生成產(chǎn)物用TLC方法測(cè)定。展開劑為V（氯仿）∶V（甲醇）∶V（水）的比例為7∶3∶0.5，展開后用10% H2SO4水溶液，于105 ℃加熱顯色。TLC檢測(cè)圖中的各組分的百分含量，利用Bandscan分析軟件分析（Liu et al.， 2015）。

1.2.4 高效液相色譜（HPLC） 色譜條件：色譜儀，Waters 2695高效液相色譜分析儀，Waters 2996 PDA光電二極管陣列檢測(cè)器及Empower色譜工作站進(jìn)行檢測(cè)。色譜柱：Knauer C18柱;流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B）;0～20 min，20%A等度;20～31 min，20%A～32%A線性梯度;31～40 min，32%A～43%A線性梯度;40～70 min，43%A～100%A線性梯度;進(jìn)樣量：10 μL;柱溫：35 ℃;體積流速：0.6 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm。

1.2.5 酶的分離純化 先向DEAE-cellulose DE52陰離子交換柱中緩慢上樣6 mL粗酶液，進(jìn)行分離提純。再配制由20 mmol·L-1 pH3.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖體系溶液溶解的濃度為40、50、60、70、80、90、100 mmol·L-1的KCl溶液，對(duì)上樣后的粗酶液進(jìn)行梯度洗脫，每一梯度洗100 mL，控制流速為1 mL·min-1，用自動(dòng)部分收集器，大約每3 mL收集1試管洗脫液;收集酶液與0.1% Rb3反應(yīng)，TLC檢測(cè)，篩選出含有Rb3糖基水解酶活力的洗脫液。

1.2.6 蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定 將含有酶活力的洗脫液，做SDS-PAGE電泳，確定產(chǎn)生單一條帶的試管，同時(shí)計(jì)算人參皂苷Rb3糖基水解酶的分子量（李建武，1997）。SDS聚丙烯酰胺凝膠的濃縮膠和分離膠分別為5%和12%，電壓分別為60 V和120 V。

1.2.7 人參皂苷Rb3糖基水解酶最佳反應(yīng)條件 測(cè)定最佳pH：分別配制pH值為1.3、2.2、3、4、5、6、7、8、9、10的緩沖溶液，將0.1%的人參皂苷Rb3溶于不同pH值的緩沖溶液中，每個(gè)pH值底物溶液與同pH值的酶液等體積均勻混合，在適宜的條件下做酶促反應(yīng)，用TLC法檢測(cè)人參皂苷Rb3的水解情況。確定pH穩(wěn)定性：取純化酶液與不同pH值的緩沖液等量混合，室溫下放置30 min，加入人參皂苷Rb3底物溶液，于酶的最適pH值反應(yīng)體系中檢測(cè)酶活力，以未經(jīng)處理過的酶活力作為100%計(jì)算相對(duì)酶活力。確定最佳反應(yīng)溫度：在上述反應(yīng)條件下，采用35、40、45、50、55℃ 條件下進(jìn)行酶催化反應(yīng)。確定最佳反應(yīng)時(shí)間：在最佳反應(yīng)溫度下，將酶液與底物溶液分別反應(yīng)1/6、1/3、1/2、1、2、4、8、12、24 h，用TLC法檢測(cè)人參皂苷Rb3的水解情況。

1.2.8 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 配制濃度分別為14.3、16.7、20.0、25.0、33.0、50.0 mmol·L-1的Rb3底物溶液與等體積純酶液混合，最終濃度分別為7.15、8.35、10.0、12.5、16.5、25.0 mmol·L-1的Rb3底物溶液;于45 ℃反應(yīng)5、10、20、40、60、90、120、180 min后，對(duì)Rb3反應(yīng)產(chǎn)物做TLC檢測(cè)，利用分析TLC版皂苷斑點(diǎn)中Rb3的降解量，確定Rb3各底物濃度在5、10、20、40、60 min時(shí)的Rb3酶反應(yīng)初速度（平均值）。根據(jù)酶反應(yīng)初速度，作Lineweaver-Burk曲線（齊崴等，2001;張華新等，2006;陳嬌嬌等，2011;史劉輝等，2012）：

通過所得到的直線方程可以得到橫軸的截距-1/Km，縱軸的截距1/Vmax，即可計(jì)算出Km和Vmax值，將結(jié)果代入得Michaelis-Menten方程。這為酶反應(yīng)工程設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

1.2.9 以pNP為底物的酶活性測(cè)定 以對(duì)硝基苯酚單糖苷（pNP-α-D-Gal、pNP-β-L-Ara、pNP-α-L-Rha、pNP-β-D-Xyl、pNP-β-D-Glu）為底物，含有400 μL的0.08 mmol·L-1的pNP底物溶液，與酶樣品100 μL混合，45 ℃反應(yīng)30 min后加入5 mL 1 mol·L-1 Na2CO3終止反應(yīng)，測(cè)定405 nm下的吸光值。酶活力定義為單位時(shí)間內(nèi)釋放1 μmol硝基苯酚的酶量為一個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗酶液的制備

由Aspergillus sp.P90r菌接種得到的粗酶液，在Rb3濃度0.01%～0.5%范圍內(nèi)，均能轉(zhuǎn)化為Rd、F2和C-K。最佳反應(yīng)溫度為45 ℃，最佳反應(yīng)時(shí)間2 h，pH值在1.3至6.0的狀態(tài)下反應(yīng)效果較好，酶反應(yīng)最佳pH為 3.0～5.0，而在pH4.0～6.0范圍內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，其中在pH5.0的偏酸性環(huán)境下穩(wěn)定性最高，如圖1和圖2所示。

經(jīng)三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Aspergillus sp. P90r菌產(chǎn)酶活力，在相同條件下比文獻(xiàn)中的Absidia sp. GRB3-X8r菌產(chǎn)酶活力，提高了15%～25%。

2.2 酶的分離純化

將上述粗酶液經(jīng)DEAE-Cellulose DE52離子交換柱洗脫，收集的第 81、93、94、95試管，具有將人參皂苷Rb3水解生成人參皂苷Rd、F2和C-K的高酶活力。因此對(duì)第81、93、94、95管的酶液進(jìn)行PAGE電泳， 結(jié)果第93、94管酶基本為電泳單帶;將上述電泳單帶的酶蛋白切膠回收， 進(jìn)一步采用

SDS-PAGE電泳法檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。

經(jīng)硫酸銨沉淀以及DEAE-Cellulose DE52分離純化的結(jié)果見表1。從表1可以看出，純化后酶蛋白的含量為0.237 mg·mL-1，蛋白比活力為169 U·mg-1，純化倍數(shù)為13.70，回收率為9.39%。

由圖3可知，提純分離的Aspergillus sp. P90r菌的第93、94管洗脫液，產(chǎn)生了電泳單一條帶，證明是純酶蛋白。根據(jù)SDS-PAGE中各標(biāo)準(zhǔn)蛋白條帶的相對(duì)遷移率，得到蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線和相對(duì)遷移率的回歸方程：y=5.090 9-0.956 6x（R2=0.993 9）。經(jīng)計(jì)算得到人參皂苷Rb3糖基水解酶的分子量約為65.6 ku。

利用其提純的糖基水解酶與0.1%的人參皂苷Rb3反應(yīng)，其反應(yīng)產(chǎn)物用HPLC測(cè)定結(jié)果，如圖4所示。圖4結(jié)果表明，人參皂苷Rb3在人參皂苷Rb3糖基水解酶的催化作用下，產(chǎn)物主要是Rd、F2和C-K，其中Rd含量最多，其次是F2，C-K相對(duì)較少。

2.3 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

將不同濃度的Rb3底物溶液與等體積純酶液混合，最終濃度分別為7.15、8.35、10.0、12.5、16.5、25.0 mmol·L-1的Rb3底物溶液，于45 ℃反應(yīng)5、10、20、40、60、90、120、180 min后，對(duì)其Rb3 6種濃度、8種不同反應(yīng)時(shí)間段的Rb3反應(yīng)產(chǎn)物，作TLC檢測(cè)，如圖5所示。

由圖5可知，人參皂苷Rb3糖基水解酶的催化反應(yīng)隨時(shí)間的延長(zhǎng)，Rb3的降解量在不斷提高，在5～10 min Rb3的降解量較低，20 min后Rb3的降解量明顯提高。利用軟件分析圖4中Rb3皂苷斑點(diǎn)的降解量，取催化反應(yīng)5、10、20、60、90 min時(shí)Rb3降解量，計(jì)算Vmax。在5 min時(shí)計(jì)算得到Km=2.94 mmol·L-1，Vmax =20.21 mmol·L-1·h-1;在10 min時(shí)計(jì)算得到Km =5.32 mmol·L-1，Vmax =28.73 mmol·L-1·h-1;在20 min時(shí)計(jì)算得到Km =8.77 mmol·L-1，Vmax =57.44 mmol·L-1·h-1; 在60 min時(shí)計(jì)算得到Km =8.93 mmol·L-1，Vmax =66.63 mmol·

L-1·h-1;在90 min時(shí)計(jì)算得到Km=9.89 mmol·L-1，Vmax =65.98 mmol·L-1·h-1。其中60 min的情況如表2所示。

從表2可得Km =8.93 mmol·L-1，Vmax =66.63 mmol·L-1·h-1，即Michaelis-Menten方程：

從上述數(shù)據(jù)可以得出，人參皂苷Rb3糖基水解酶的酶反應(yīng)速度遵循米氏方程的規(guī)律，底物濃度較低時(shí)，先遵循一級(jí)反應(yīng)，反應(yīng)速度隨底物濃度上升而上升，然后在20 min時(shí)進(jìn)入混合級(jí)反應(yīng)，最后在60 min時(shí)反應(yīng)速度達(dá)到最大，反應(yīng)速度不再隨濃度上升而上升，進(jìn)入零級(jí)反應(yīng)，此時(shí)Vmax趨于穩(wěn)定。

從圖4和圖5可以看到，Aspergillus sp. P90r菌所產(chǎn)的人參皂苷Rb3糖基水解酶，水解人參皂苷Rb3的產(chǎn)物主要有Rd、F2和C-K。該酶先水解人參皂苷Rb3的20-O-木糖基變?yōu)镽d，進(jìn)一步水解人參皂苷Rd的3-O-葡萄糖基變?yōu)镕2，再進(jìn)一步水解人參皂苷F2的3-O-葡萄糖基變?yōu)樽罱K產(chǎn)物C-K。也就是說，Aspergillus sp. P90r菌所產(chǎn)的人參皂苷Rb3糖基水解酶具有水解木糖基和葡萄糖基的特異性。其酶反應(yīng)途徑如圖6所示。

2.4 以pNP單糖苷為底物酶催化特性

用純化后的第93、94管酶液，采用1.2.9方法，進(jìn)行酶活力測(cè)定，結(jié)果如表3所示。表中數(shù)據(jù)表明，該酶不僅能水解β-D-木糖苷，還能水解β-D-葡萄糖苷，對(duì)α-D-半乳糖苷、α-L-鼠李糖苷、β-L-阿拉伯糖苷無水解能力，表現(xiàn)出獨(dú)特的水解特性。

3 討論與結(jié)論

本文的Aspergillus sp. P90r菌產(chǎn)人參皂苷Rb3糖基水解酶活力，在相同條件下比文獻(xiàn)中的Absidia sp. GRB3-X8r菌產(chǎn)酶活力高15%～25%;本文Aspergillus sp. P90r菌所產(chǎn)酶蛋白的比活力為169 U·mg-1，對(duì)人參皂苷Rb3的糖基具有較好的水解活力;SDS-PAGE電泳測(cè)得分子量約為65.6 ku，接近于Absidia sp. GRB3-X8r菌酶分子量66.7 ku。該酶在pH5.0的偏酸性環(huán)境下酶活力很高，在接近中性環(huán)境以及堿性環(huán)境下酶活力迅速下降，在pH值8.0及以上完全沒有酶活性。最適反應(yīng)條件是pH=3.0～5.0、45 ℃，在pH=4.0～6.0范圍內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。該酶在20 min時(shí)進(jìn)入混合級(jí)反應(yīng)，反應(yīng)米氏常數(shù)Km值為8.77 mmol·L-1，Vmax為57.44 mmol·L-1·h-1;在60 min時(shí)反應(yīng)速度達(dá)到最大，Vmax趨于穩(wěn)定，為66.63 mmol·L-1·h-1。上述研究成果，為酶轉(zhuǎn)化三七莖葉皂苷制備稀有人參皂苷提供了理論基礎(chǔ)。

該酶先水解人參皂苷Rb3的20-O-木糖基變?yōu)槿藚⒃碥誖d，進(jìn)一步水解人參皂苷Rd的3-O-葡萄糖基變?yōu)槿藚⒃碥誇2，再進(jìn)一步水解人參皂苷F2的3-O-葡萄糖基變?yōu)樽罱K產(chǎn)物C-K。對(duì)于葡萄糖苷酶對(duì)多種糖基具有水解作用的研究，Larsbrink et al.（2014）在研究Bacteroides ovatus中木葡聚糖分解代謝相關(guān)的酶基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，其中BoGH31A在切除α（1→6）-木糖基后允許水解β-葡萄糖基和β-半乳糖基;Opassiri et al.（2004）從水稻（Oryza sativa）中克隆得到bglu1基因，其表達(dá)產(chǎn)物β-葡萄糖苷酶不僅能水解一些天然的葡萄糖苷，也能水解對(duì)硝基苯基β-巖藻糖苷、β-半乳糖苷和β-木糖苷，另外他們也克隆得到os4bglu12基因，其表達(dá)產(chǎn)物同樣也具有水解多種糖基的特性，對(duì)β-葡萄糖苷、β-半乳糖苷、β-甘露糖苷、β-木糖苷和a-阿拉伯糖苷都有水解作用（Opassiri et al.， 2006）;Tsukada et al.（2006）從Phanerochaete chrysosporium中克隆了糖基水解酶家族1中的兩個(gè)β-葡萄糖苷酶BGL1A和BGL1B，其中BGL1B對(duì)β-葡萄糖苷和β-半乳糖苷都有降解作用。上述研究中發(fā)現(xiàn)的β-葡萄糖酶都?xì)w屬為酶學(xué)數(shù)據(jù)庫內(nèi)EC.3.2.1.21酶類，都屬于GH1家族，且該家族中能水解多種糖基的糖苷酶種類也較多。本文中Aspergillus sp. P90r菌所產(chǎn)人參皂苷糖基水解酶也具有水解人參皂苷Rb3木糖基和葡萄糖基的特性，認(rèn)為此糖苷酶應(yīng)歸屬于GH1家族。

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（責(zé)任編輯 何永艷）