劍葉龍血樹內(nèi)生放線菌活性菌株的篩選和鑒定

田守征 黃之鐠 趙玉瑛 趙慶 張曉梅

摘 要：? 為篩選具有抗菌抗腫瘤活性的藥用植物內(nèi)生菌資源，該文對300余株分離自中國云南西雙版納及越南地區(qū)劍葉龍血樹的內(nèi)生放線菌采用瓊脂塊擴散法進行抗病原細(xì)菌活性篩選、平板對峙法進行抗真菌活性篩選、SRB法測定菌株的細(xì)胞毒活性及PCR擴增方法篩選非核糖體肽合成酶NRPS基因及聚酮合酶PKS-I、PKS-Ⅱ基因;對得到的優(yōu)勢菌株經(jīng)8種培養(yǎng)基進行發(fā)酵，采用10種病原細(xì)菌、3種病原真菌及2種人腫瘤細(xì)胞株測試其發(fā)酵粗提物的抗菌及抗腫瘤活性以確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基;用16S rRNA基因測序方法初步鑒定5株優(yōu)勢菌株的分類地位。結(jié)果表明：初篩得到5株抗菌活性、體外細(xì)胞毒活性及NRPS、PKS相關(guān)基因表達(dá)陽性的菌株S01-S05，其中4株（S01-S04）屬于鏈霉菌屬、1株（S05）屬于類諾卡氏菌屬;菌株經(jīng)不同培養(yǎng)基發(fā)酵后產(chǎn)物的抗菌和抗腫瘤活性不同，其中Streptomyces sp. S04在7種培養(yǎng)基中的發(fā)酵提取物對8種測試病原菌均有較強抑制作用，且該菌株用Medium C的發(fā)酵提取物對人肝癌 Hep G2 細(xì)胞株抑制率達(dá)到 100%，為劍葉龍血樹內(nèi)生菌活性成分挖掘及新型抗菌藥物篩選奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 劍葉龍血樹， 內(nèi)生放線菌， 抗菌活性， 抗腫瘤活性， 16S rRNA基因分析

中圖分類號：? Q939

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2020）05-0727-08

Bioactivity and identification of endophytic actinomycetes from Dracaena cochinchinensis

TIAN Shouzheng1， HUANG Zhipu2， ZHAO Yuying2，

ZHAO Qing2， ZHANG Xiaomei1*

（ 1. College of Basic Medicine， Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming 650500， China; 2. College of Traditional Chinese Medicine， Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming 650500， China）

Abstract：? In order to screen endophytic bacteria resources with antitumor activities from medicinal plant， 300 endophytic actinomycetes isolated from Dracaena cochinchinensis collected from Xishuangbanna， China and Vietnam were studied. SRB method was used to detect the activity of antitumor cells， agar diffusion and plate confrontation methods were used to test antimicrobial activities， Polymerase Chain Reaction was used to detect NRPS， PKS-I and PKS-Ⅱ genes， and the taxonomic studies of the five selected active strains were performed using 16S rRNA gene analysis. Eight media were designed to cultivate five selected active strains and the antimicrobial activities of their fermented extraction were detected by oxford-cup test against ten pathogenic bacteria and three pathogenic fungi， the antitumor activities were measured by MTT assay in two tumor cell lines. As a result， four of the five active strains were classified as Streptomyces spp. and the remaining one as Nocardioides sp. Different media resulted in different activities， most media of strain S04 showed strong activities against eight pathogens and the inhibition rate of the fermentation product of S04 in Medium C on Hep G2 cell line was up to 100%， which could be a novel resource for the mining of bioactive compounds for further studies.

Key words： Dracaena cochinchinensis， endophytic actinomycetes， antimicrobial activities， antitumor activities， 16S rRNA gene analysis

微生物來源的天然產(chǎn)物在人和動植物疾病中發(fā)揮著重要作用，廣泛用作抗細(xì)菌、抗真菌和抗腫瘤的臨床藥物，在醫(yī)藥行業(yè)和農(nóng)業(yè)方面做出了重要貢獻(xiàn)（Katz & Baltz，2016）。已發(fā)現(xiàn)3萬多種微生物來源的代謝產(chǎn)物中，約有30%由放線菌所產(chǎn)生，60%由真菌產(chǎn)生，10%由粘細(xì)菌產(chǎn)生（Bérdy，2012;Subramani & Aalbersberg，2012）。據(jù)保守估計，迄今為止從微生物中發(fā)現(xiàn)的次生代謝產(chǎn)物數(shù)量僅占其基因組所編碼總數(shù)的20%～30%（Ikeda et al.，2003），且自然界中至少90%以上的微生物資源未被人們認(rèn)識。現(xiàn)在普遍認(rèn)為，新生境可能蘊藏新物種，新物種可能擁有新基因，新的基因資源可能決定了代謝機制的多樣性和新穎性，從而能極大程度地避免化合物重復(fù)發(fā)現(xiàn)的問題（Tiwari & Gupta，2012）。近年來的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，從特殊生境微生物中分離到新的活性物質(zhì)的概率遠(yuǎn)高于普通土壤微生物，它們極有可能成為發(fā)現(xiàn)新活性先導(dǎo)化合物及新藥的重要來源（Bull et al.，2005）。因此，人們把研究目光轉(zhuǎn)向棲息于特殊生境的微生物，如海洋、動植物內(nèi)生環(huán)境、高溫?zé)崛?、鹽湖、洞穴等各種極端環(huán)境（Zhang et al.，2013;張道鋒，2013;張曉梅，2014）。

植物內(nèi)生菌（endophytes）是指那些生活史的部分或全部階段生活于健康植物組織內(nèi)部的真菌或細(xì)菌，宿主植物不表現(xiàn)出病癥，可通過組織學(xué)方法或從嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內(nèi)直接擴增出微生物DNA的方法來證明其內(nèi)生（朱文勇，2013）。內(nèi)生菌是一類非常重要的微生物資源，它們具有獨特的分化和發(fā)育過程，使其能夠適應(yīng)植物內(nèi)部這個特殊的環(huán)境，同時它們還能夠編碼產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品以及環(huán)保等領(lǐng)域。內(nèi)生菌和高等植物經(jīng)長時間的協(xié)同進化，為適應(yīng)宿主體內(nèi)微環(huán)境，允許自身與宿主植物之間進行基因信息的交流轉(zhuǎn)移，使得自身發(fā)生遺傳變化，使某些內(nèi)生菌產(chǎn)生抗生素、植物生長激素等生物活性物質(zhì)，尤其是一些內(nèi)生菌還獲得了產(chǎn)生和宿主植物相同或相似化合物的能力，提示我們從植物內(nèi)生菌尤其藥用植物內(nèi)生菌中挖掘具有宿主植物相似活性代謝產(chǎn)物的潛力極大。世界范圍內(nèi)對內(nèi)生菌研究的關(guān)注始于1993年，Stierle從短葉紫杉的內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)紫杉醇（Stierle et al.，1993），此后喜樹堿、鬼臼毒素和長春新堿等抗癌明星藥也陸續(xù)從其原產(chǎn)植物的內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)（Amna，2006）。內(nèi)生放線菌次生代謝產(chǎn)物的研究較內(nèi)生真菌少，典型代表是云南美登木內(nèi)生放線菌 Streptomyces spp.，從中分離得到一系列萘霉素類（naphthomycin K）、巴佛洛霉素類、Ⅲ型聚酮類、大環(huán)內(nèi)酯等類型的新化合物（Lu & Shen，2007;Li et al.，2008;Yang et al.，2012），大部分具有抗菌或抗腫瘤細(xì)胞等活性。目前已得到的具有多種生物活性的聚酮類化合物和非核糖體多肽類化合物大多由放線菌產(chǎn)生（Panchanathan et al.，2013）。此外植物內(nèi)生菌具有產(chǎn)生與宿主同樣或不同的活性次級代謝產(chǎn)物的能力，對于新藥產(chǎn)生途徑以及藥用植物的保護都具有重要意義。

劍葉龍血樹（Dracaena cochinchinensis）廣泛分布于我國（云南、海南、廣西）及其他東南亞國家，被列入我國國家重點保護野生藥材物種名錄，屬國家Ⅱ級保護植物，《中國植物紅皮書—稀有瀕危植物（第一冊）》（1992年）將其收錄為漸危種。龍血樹樹脂藥用，可提取中醫(yī)傳統(tǒng)外傷科用藥“龍血竭”，在治療心血管病、抗炎、抗腫瘤、治療子宮內(nèi)膜異位癥及止血活血等方面具有較好的療效。然而，劍葉龍血樹生長緩慢，血竭產(chǎn)量低，收獲血竭會嚴(yán)重破壞百年生長的植物。本文將研究劍葉龍血樹內(nèi)生放線菌的抗菌和抗腫瘤生物活性，篩選并鑒定活性顯著的菌株，并對其發(fā)酵條件進行考察，為下一步從中發(fā)掘新型抗菌抗腫瘤活性成分奠定基礎(chǔ)，并對瀕危名貴野生藥材劍葉龍血樹的保護有一定意義。

1 材料與方法

1.1 菌種

1.1.1 內(nèi)生放線菌 以中國云南西雙版納及越南地區(qū)劍葉龍血樹植物組織中分離得到的300余株內(nèi)生放線菌為材料，由云南大學(xué)云南省微生物研究所提供。

1.1.2 病原指示菌 金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus ATCC25923）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis ATCC6633）、白色葡萄球菌（Staphylococcus albus 1029）、大腸桿菌（Escherichia coli ATCC25922）、銅綠假單胞菌 （Pseudomonas aeruginosa PA01）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium χ 8956）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis ATCC29212）、曼胞不動桿菌（Acinetobacter baumanii ATCC19606）、克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia ATCC13883）、白色念珠菌（Canidia albicans SC 5314）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum） 、炭黑曲霉菌（Aspergillus carbonarius）、赭曲霉菌（Aspergillus westerdijkiae），以上菌株均為課題組前期保存。

1.2 腫瘤細(xì)胞株

人乳腺癌腫瘤細(xì)胞株MCF-7及人肝癌腫瘤細(xì)胞株Hep G2 購買自美國模式培養(yǎng)物保藏中心（ATCC， Boulevard， Manassas， VA 20110 USA）。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 病原細(xì)菌培養(yǎng)基 LB：tryptone 10 g，yeast extract 5 g，NaCl 10 g，agar 15 g，ddH2O 1L，pH 7.2～7.6。

1.3.2 病原真菌培養(yǎng)基 沙保氏培養(yǎng)基：glucose 40 g，peptone 10 g，agar 15 g，ddH2O 1L，pH 6.0。PDA：potato 200 g （ 煮沸 20 min 后過濾，取汁棄渣），glucose 20 g，agar 15 g，ddH2O 1 L，pH 6.0～7.0。

1.3.3 放線菌活化增殖培養(yǎng)基 YMG：yeast extract 4 g，glucose 4 g，malt extract 10 g，agar 15 g，ddH2O 1L，pH 7.2～7.6。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基 Medium A：mannitol 20 g，peptone 20 g;Medium B：oat 20 g，trace salt 1 mL;Medium C：potato 200 g （ 煮沸 20 min 后過濾，取汁棄渣），glucose 10 g;Medium D：yeast extract 4 g，glucose 4 g，malt extract 10 g;Medium E： peptone 2 g，beef extract 3 g，yeast extract 3 g，glycerol 10 g，K2HPO4 1 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 1 g;Medium F：soluble starch 10 g，glucose 2 g，yeast extract 2 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 1 g，（NH4）2SO4 1 g，CaCO3 2 g，NaCl 1 g，trace salt 1 mL;Medium G：soluble starch 2 g，glucose 20 g，yeast extract 2 g，peptone 2 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO3 2 g， NaCl 4 g;Medium H：soluble starch 20 g，KNO3 1 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4· 7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4· 7H2O 0.01 g。以上培養(yǎng)基均為1 L，pH7.2～7.6，agar 15 g。

1.3.5 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基 DMEM培養(yǎng)基。

1.4 主要試劑和儀器

蒸餾水，無水乙醇、甲醇、冰乙酸、乙酸乙酯、丙酮等均為分析純。N-1000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELA，日本），THI-300 恒溫培養(yǎng)搖床（上海一恒科技有限公司），BSA124S 分析天平（德國賽多利斯集團），SW-CJ-2FD 潔凈工作臺（中國蘇州安泰AIRTECH公司），ES-315高壓蒸汽滅菌鍋（TOMY，日本），DHG-9240A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司），LRH-250 生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司），SK5200H超聲儀（上?？茖?dǎo)）。

1.5 方法

1.5.1 內(nèi)生菌優(yōu)勢菌株的篩選 放線菌在YMG培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d，用含菌的瓊脂塊擴散法進行放線菌抗病原細(xì)菌活性篩選;用平板對峙法進行抗真菌活性篩選;用SRB法測定菌株的細(xì)胞毒性。分別用A3F/A7R（700～800 bp）、K1F/M6R（1 200～1 400 bp）、KsaF/KSaR （613 bp）引物進行PCR篩選非核糖體肽合成酶NRPS基因及聚酮合酶PKS-I、PKS-Ⅱ基因（Qin et al.，2009）。

1.5.2 優(yōu)勢菌株的分類分析 對篩選出的陽性菌株進行基因組提取， 利用細(xì)菌 16S rRNA 基因通用引物PA： 5′-CAG AGT TTG ATC CTG GCT-3′，PB：5′-AGG AGG TGA TCC AGC CGC A-3′進行PCR擴增。擴增條件：94? ℃預(yù)變性 5 min;30個循環(huán)（94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min） ，72 ℃延伸 3 min;72 ℃總延伸 6 min。得到的 PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖膠回收后送生工生物工程 （上海）股份有限公司測序，得到的序列經(jīng)EzBioCloud （http：//www. ezbiocloud.net/）中的EzTaxon在線比對服務(wù)進行相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)菌株的相似性搜索，確定菌株的分類學(xué)地位，并調(diào)出相關(guān)放線菌的16S rRNA基因序列，隨后用Clustal X進行序列比對，最終用MEGA 6軟件Neighbour-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5.3 優(yōu)勢菌株產(chǎn)活性代謝產(chǎn)物發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.5.3.1 菌株發(fā)酵及提取 內(nèi)生放線菌接種于YMG培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3～4 d做為菌種，挑取適量菌絲分別接于A-H 培養(yǎng)基 （25 mL·plate-1），每株菌每種培養(yǎng)基發(fā)酵 100 mL，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，14 d后將瓊脂切塊于三角燒瓶中，用乙酸乙酯∶甲醇∶冰乙酸 （80∶15∶5）浸泡過夜提取三遍，把瓊脂過濾后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮回收溶劑，用有機溶劑將粗提物轉(zhuǎn)至樣品瓶，等溶劑完全揮發(fā)后，稱重計算產(chǎn)量，樣品備用。

1.5.3.2 生物活性檢測 病原指示菌分別接種至液體LB培養(yǎng)基，白色念珠菌于28 ℃，其余病原細(xì)菌于37 ℃，220 r·min-1 震蕩培養(yǎng)18 h。用LB液體培養(yǎng)基分別對各指示菌菌液進行梯度稀釋，稀釋至濃度為 1× 106～1×107 個·mL-1。

采用牛津杯法測定各菌株不同發(fā)酵粗提物的體外抗菌活性，指示菌用涂布法或混菌法準(zhǔn)備。每個粗提物用 4 mL 丙酮溶解，分別取 50 μL 進行活性測定，取50 μL LB培養(yǎng)基做陰性對照，取50 μL 丙酮做空白對照，取等體積抗生素溶液做陽性對照（病原細(xì)菌以5 μg利福霉素為陽性對照;白色念珠菌用20 μg氟康唑為陽性對照）。白色念珠菌于28 ℃培養(yǎng)，其余病原細(xì)菌于37 ℃培養(yǎng)，24 h后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑大小。

劍葉龍血樹內(nèi)生放線菌具有較好的抑菌和抗腫瘤活性，發(fā)酵條件明確，菌株易培養(yǎng)且菌種穩(wěn)定，開發(fā)利用前景廣闊，部分菌株活性代謝產(chǎn)物的挖掘工作正在積極進行中。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）