高原地區(qū)MS與基因測(cè)序?qū)χZ卡菌鑒定評(píng)價(jià)

巢世蘭 阿祥仁 張倩

【摘要】目的：以基因測(cè)序（16s rDNA、rpoB）為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）對(duì)高原地區(qū)諾卡菌臨床分離株的準(zhǔn)確性研究及病例分析。方法：回顧性調(diào)查我院2015.1-2019.12月，5年臨床標(biāo)本中分離的16株諾卡菌，對(duì)比MS與測(cè)序的鑒定結(jié)果，將質(zhì)譜法鑒定與基因測(cè)序法結(jié)果不一致的菌株維護(hù)進(jìn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù);剔除病例缺如者，共收集13例。結(jié)論：高原地區(qū)分離的13株諾卡菌中，肺部依然是主要感染部位。

【關(guān)鍵詞】高原地區(qū);MS;基因測(cè)序;諾卡菌

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本研究納入該院2015.1-2019.12診斷為諾卡菌感染患者病例13例（其中1株MS僅能鑒定到屬，與測(cè)序法結(jié)果不一致;維護(hù)MS菌庫(kù)后，將膿液諾卡菌通過(guò)自建庫(kù)功能添加至原菌庫(kù)）。并對(duì)兩種方法結(jié)果一致的13株菌進(jìn)行臨床特點(diǎn)分析。

1.2 方法

1.2.1 菌種鑒定

篩選出目標(biāo)菌株，轉(zhuǎn)種哥倫比亞血平板，在35℃條件下孵育培養(yǎng)72h。

1.2.2 諾卡菌常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查方法：革蘭染色

弱抗酸染色為陽(yáng)性、抗酸染色、鏡下菌體為長(zhǎng)絲狀，菌絲常與菌體呈十字交叉。在培養(yǎng)基上36h后肉眼可見(jiàn)菌落，干燥白色或橙色菌落。

1.2.3 基因測(cè)序

使用TIANGEN TIAamp Bacteria DNA Kit細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）制備細(xì)菌DNA。本研究采用的16s rDNA和rpoB擴(kuò)增和測(cè)序方法是依照Carrasc研究中的引物和方法進(jìn)行，16s rDNA擴(kuò)增的正向引物和反向引物分別是5′-GCTTAACACATGCAAGTCG-3′和5′-GAATTCCAGTCTCCCCTG-3′，rpo B擴(kuò)增的引物分別是5′-CGACCACTTCGGCAACCG-3′和5′-TCGATCGGGCACATCCGG-3′。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括：2×Taq Master Mix（Dye Plus）12.5μL，上、下游引物共1μL，模板DNA 2μL，去離子水9.5μL。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析及測(cè)通測(cè)序;測(cè)定序列在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中運(yùn)用BLAST程序進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.4 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MS）

使用全自動(dòng)快速生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)IVD MALDI Biotyper，通過(guò)甲酸擴(kuò)散法對(duì)所選13株菌株進(jìn)行檢測(cè)并記錄數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法（MS）

應(yīng)用MS鑒定諾卡菌的屬準(zhǔn)確度為100%（13/13），種準(zhǔn)確度為92.3%（12/13），其中1株僅能鑒定到屬與金標(biāo)準(zhǔn)不一致，詳見(jiàn)表1。

2.2 基因測(cè)序

瓊脂糖凝膠電泳顯示16s rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1400bp，rpoB基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為400bp，與目標(biāo)片段大小一致。將測(cè)定序列在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中運(yùn)用BLAST程序進(jìn)行比對(duì)分析，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論

本研究對(duì) MS鑒定諾卡菌菌種的準(zhǔn)確度與16s rDNA和rpoB基因測(cè)序金標(biāo)準(zhǔn)比較并進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果為應(yīng)用MS鑒定諾卡菌的屬準(zhǔn)確度為100%（13/13），種準(zhǔn)確度為92.3%（12/13），其中1例菌種鑒定結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)不一致，且質(zhì)譜評(píng)分較低1.436，說(shuō)明鑒定結(jié)果可信度不高。將質(zhì)譜法與基因測(cè)序法鑒定結(jié)果不同或無(wú)法鑒定到種的菌株維護(hù)進(jìn)質(zhì)譜菌種庫(kù)后，再次以甲酸擴(kuò)散法鑒定不一致的菌株，可鑒定到種，且質(zhì)譜評(píng)分較高1.906，說(shuō)明鑒定可信度高[1]。因此，MS用于諾卡菌鑒定最主要的局限性是現(xiàn)有商品化數(shù)據(jù)庫(kù)中缺乏相應(yīng)的圖譜，所以實(shí)驗(yàn)室依據(jù)MS自建庫(kù)功能，完善相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定準(zhǔn)確度可提高[2]。

基金項(xiàng)目：青海省創(chuàng)新平臺(tái)建設(shè)專項(xiàng) （2018-SF-L3），青海省人民醫(yī)院院內(nèi)課題

本研究納入的13例久居高原的患者，均患有可能導(dǎo)致免疫力低下的基礎(chǔ)疾病，最多見(jiàn)為肺部感染;其他可能導(dǎo)致免疫力低下的基礎(chǔ)疾病還包括2型糖尿病、慢性乙型病毒性肝炎、AIDS、腎病綜合癥感染等。

綜上，對(duì)于疑似諾卡菌感染的患者臨床醫(yī)師應(yīng)及時(shí)多次送檢，以便提高陽(yáng)性率，實(shí)驗(yàn)室則應(yīng)加強(qiáng)對(duì)諾卡菌種的鑒定能力，以指導(dǎo)臨床準(zhǔn)確診治規(guī)范用藥。

參考文獻(xiàn)：

[1] 黃慧，陸志偉，徐作軍.諾卡菌感染26例臨床特點(diǎn)分析[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2010，33（9）：651-655. DOI：10.3760/cma.j.issn.1001-0939.2010.09.005.

[2] 黃磊，張藝.諾卡菌分子鑒定方法的研究進(jìn)展[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2018，15（18）：2814-2817.