豬鏈球菌2型分離株的生物學(xué)特性試驗

劉麗蓉 ，常 凱 ，吳 娟 ，單 虎

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 青島 266109；2.泉州出入境檢驗檢疫局，福建 泉州 362000）

豬鏈球菌2型感染可引起豬腦膜腦炎、心內(nèi)膜炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎等疾病，可感染人并致死，是一種重要的人獸共患病病原菌[1-2]，在全國范圍內(nèi)都是優(yōu)勢流行株。2005年6-7月發(fā)生在四川省資陽、內(nèi)江等地區(qū)的2型豬鏈球菌感染事件造成了極大的經(jīng)濟損失，引起社會廣泛關(guān)注[3]。此外，1型和9型是除2型外的流行株[4-5]，也可使豬發(fā)病。近幾年來，豬鏈球菌病的發(fā)病呈上升趨勢，該病往往發(fā)病急，死亡快，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了重大的經(jīng)濟損失。同時也給公共衛(wèi)生安全帶來的重大的隱患。雖然理論上有很多藥物能治療豬鏈球菌病，但隨著抗菌藥物的廣泛使用以及臨床中不合理用藥，使得病原菌的耐藥現(xiàn)象日趨嚴重[6-8]。本試驗對從發(fā)病豬肺、肝、脾和淋巴結(jié)中分離到的鏈球菌株進行生化試驗、藥敏試驗及致病性試驗等研究，確定為豬鏈球菌2型，為預(yù)防和控制該病的流行提供了重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 豬鏈球菌2型參考菌株（HA9801）由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提供；病原菌株由濟南某屠宰場和急性死亡病例豬豬場提供。

1.1.2 實驗動物 小鼠，購于青島市藥品檢驗所。

1.1.3 主要試劑 THB液體培養(yǎng)基為北京陸橋有限公司產(chǎn)品；微量生化發(fā)酵管為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片為北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品。

1.1.4 參照倪秀艷等[9]，針對CPS 2J基因片段設(shè)計合成引物對：

P1：5’-CAAACGCAAGGAATTACGGTATC-3’

P2：5’-GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG-3’

由北京賽百盛生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離

無菌條件下，采集病豬心血、肺、肝、脾和淋巴結(jié)、扁桃體劃線接種于綿羊血平板，37℃培養(yǎng)18～24 h，挑取α溶血、光滑圓形、針尖狀大小的可疑菌落接種到THB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。

1.2.2 培養(yǎng)特性鑒定及形態(tài)觀察

分離菌株分別接種于綿羊血平板及THB液體培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)16～18 h，觀察其培養(yǎng)特性。用接種環(huán)取血平板單菌落作革蘭氏染色，在油鏡下進行形態(tài)觀察。

1.2.3 生化特性

將分離得到病原菌接種于乳糖、蔗糖、蕈糖、葡萄糖、七葉苷、山梨糖、山梨醇、甘露醇、尿素、水楊苷、棉子糖、阿拉伯糖、甘油、VP、6.5%高鹽肉湯和pH 9.6肉湯中。放置于37℃恒溫箱培養(yǎng)中培養(yǎng)24 h后，觀察并記錄結(jié)果。重復(fù)全部試驗3次，列出重復(fù)性良好的菌株的生化特性。符合鏈球菌生化指標(biāo)的菌株判為鏈球菌。

1.2.4 PCR鑒定

1.2.4.1 模板的制備

按照煮沸法制備，吸取培養(yǎng)好的1 mL菌液于1.5 mL EP管里，10000 r/min離心2 min，棄去上清。加入250μL雙蒸水吹打均勻后煮沸 5 min，10000 r/min離心1 min，移上清液至另一EP管里，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 PCR擴增

PCR擴增反應(yīng)在PCR儀上進行，在0.5mLPCR反應(yīng)管中，采用20uL體系，反應(yīng)程序為：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃1min 35 個循環(huán)；72℃10min。

1.2.4.3 PCR產(chǎn)物測序

將得到的PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行PCR產(chǎn)物回收，克隆到pMD19-T載體上，送上海生工生物技術(shù)有限公司測序。用DNAstar軟件對測定的核苷酸序列進行分析，并與Genebank的序列進行同源性比較。

1.2.5 藥敏試驗

用常規(guī)的藥敏紙片擴散法進行該項試驗。用滅菌后的棉簽醮取病原菌密集涂布與綿羊血瓊脂平板表面。用經(jīng)滅菌的鑷子將藥敏紙片輕輕的放置在培養(yǎng)基的表面，紙片直接的距離為3 cm左右，距離培養(yǎng)皿邊緣的距離為1.5 cm左右，然后放置在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出觀察抑菌圈的大小。使用的藥敏紙片有：復(fù)方新諾明、氨芐西林、新霉素、卡那霉素、四環(huán)素、恩諾沙星、青霉素、強力霉素、丁胺卡那、慶大霉素、萬古霉素、阿莫西林、多黏菌素和鏈霉素。

1.2.6 動物致病性試驗

用分離的鏈球菌接種THB液體培養(yǎng)基純培養(yǎng)24 h，將菌液濃度調(diào)整為約1.5×109CFU/mL，分別按0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL劑量腹腔接種試驗組昆明小鼠，10只/組，對照組注射1.0 mL的THB液體培養(yǎng)基，所用實驗小鼠均為25 g左右。對注射鏈球菌菌液的小白鼠進行隔離飼養(yǎng)，隨時觀察并記錄其發(fā)病及死亡情況。對發(fā)病死亡的小鼠應(yīng)及時剖檢，無菌采集其肝臟、肺臟及脾臟，涂片，鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 細菌的分離

從發(fā)病豬場50份病料中分離到豬鏈球菌2型8株，檢出率分別為16.0%，分別命名JNB01、JNB02、JNB03、JNB04、JNB05、JNB06、JNB07 和 JNB08。從屠宰場198份生豬扁桃體樣品中分離到豬鏈球菌2型6株，檢出率為3.0%，分別命名JNT01、JNT02、JNT03、JNT04、JNT05 和 JNT06。

2.2 細菌形態(tài)及培養(yǎng)特性

分離菌在綿羊血平板上能長出灰白色、圓形、透明濕潤、中央隆起、表面光滑、邊緣整齊、針尖大小的露滴樣小菌落。挑取單個菌落涂片，革蘭染色鏡檢為近乎小桿狀的單個、成對或長短不一的鏈狀排列的革蘭陽性球菌。THB液體培養(yǎng)基中有白色絮狀沉淀，上清渾濁，涂片可見鏈狀排列的革蘭陽性球菌，鏈較固體培養(yǎng)基中的長。

2.3 生化試驗

該病原菌可發(fā)酵乳糖、蔗糖、蕈糖、葡萄糖和七葉苷，不發(fā)酵山梨糖、山梨醇、甘露醇、尿素、水楊苷、棉子糖、阿拉伯糖、甘油、VP、6.5%高鹽肉湯和pH9.6肉湯（表 1）。

表1 病原菌的生化特性

2.4 PCR鑒定

2.4.1 豬鏈球菌2型PCR擴增結(jié)果

通過PCR擴增cps2J基因，該菌株能擴增出大小為675 bp的條帶（圖1）。

2.4.2 PCR產(chǎn)物測序

將克隆產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司測序。經(jīng)BLAST分析表明，該菌株與Genebank中豬鏈球菌2型參考菌株的同源性達98%～100%。

2.5 藥敏試驗

藥敏紙片本身直徑，抑菌直徑是包括藥敏紙片在內(nèi)測量結(jié)果。藥敏試驗的判定依據(jù)是：抑菌圈的直徑≧15mm為高度敏感，抑菌圈直徑在10mm～15mm為中度敏感，抑菌圈≦10mm為不敏感。從表2可看出，該病原菌對復(fù)方新諾明、氨芐西林、恩諾沙星、青霉素、萬古霉素、阿莫西林高度敏感；對新霉素、卡那霉素、四環(huán)素、強力霉素、丁胺卡那、慶大霉素中度敏感；對多黏菌素有耐藥性。

表2 病原菌的藥敏試驗

2.6 動物致病性試驗

腹腔接種0.2 mL分離菌的10只小白鼠和對照組均未見異常；接種0.5 mL分離菌的10只小白鼠于感染后36 h出現(xiàn)精神沉郁、被毛松亂癥狀，但96 h后癥狀減輕并耐過；而接種1.0 mL分離菌的10只小白鼠于24～48 h全部死亡。剖解均見敗血癥，心臟、脾臟、肝臟等涂片，革蘭氏染色，鏡檢，均可分離到接種的細菌。

3 討論

鏈球菌在綿羊血平板上多呈單個、成對或短鏈狀排列，在液體培養(yǎng)基中多呈長鏈狀，鑒定鏈球菌難度不大，但要確定其為何種鏈球菌就比較困難。由于鏈球菌的生化特性差異較大，僅以形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化特征等難以將分離的菌株準(zhǔn)確的分型歸類，因此，常結(jié)合PCR進行準(zhǔn)確鑒定。PCR檢測方法已廣泛應(yīng)用于病原微生物的特異、敏感及快速的檢測，尤其適用于培養(yǎng)困難或血清學(xué)方法難以檢測的病原微生物。本試驗中參考倪秀艷針對cps2J基因合成的引物能擴增出相應(yīng)的目的片段，充分表明了PCR方法具有很高的特異性，完全適合于豬鏈球菌2型的診斷。

由于鏈球菌廣泛存在于正常豬的呼吸道、扁桃體等器官和組織中，豬群鏈球菌的帶菌率與豬群是否發(fā)生豬鏈球病并無直接關(guān)系。鏈球菌是革蘭氏陽性菌，理論上很多藥物對其有療效。但近年來由于抗生素的濫用，如在動物飼料中長期添加抗生素用于促進生長及預(yù)防和治療疾病，發(fā)生疾病后為經(jīng)獸醫(yī)診斷就盲目大量使用多種抗生素，不僅治療成本提高，而且產(chǎn)生了大量耐藥菌株，使疾病難以控制。

對該病原菌的藥敏試驗結(jié)果表明該分離菌株對復(fù)方新諾明、氨芐西林、恩諾沙星、青霉素、萬古霉素、阿莫西林高度敏感；對新霉素、卡那霉素、四環(huán)素、強力霉素、丁胺卡那、慶大霉素中度敏感；對多黏菌素有耐藥性。建議豬場在防治豬鏈球菌病時，對菌株進行藥敏試驗，根據(jù)試驗結(jié)果用2～3種敏感藥物按療程和適當(dāng)劑量交替使用。

動物試驗是目前區(qū)分豬鏈球菌2型毒力唯一有效的方法。本試驗小鼠均于48 h內(nèi)死亡，表明該分離株為強致病菌株。

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