金納米電極對多巴胺和5-羥色胺的電化學(xué)富集和拉曼光譜檢測

楊丹 周晶 李語靜 趙銳 馮文南 何勁 王哲 楊國程

摘?要?對小分子神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺（Dopamine，DA）和5-羥色胺（5-Hydroxytryptamine，5-HT）的同時分析和檢測是生命科學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點。單一的電化學(xué)檢測手段難以有效地識別分析物，因此，多模量的同時分析尤為重要。本研究在碳納米電極（Carbon-nanoelectrode nanopipette，CNE-NP）的基礎(chǔ)上，通過電化學(xué)反應(yīng)在其尖端沉積金，構(gòu)建了一種具有電化學(xué)特性和拉曼活性的雙功能金納米電極（Gold-nanoelectrode nanopipette，GNE-NP） 。經(jīng)過交流介電泳（Dielectrophoresis，DEP）富集后，可用于對低濃度的DA和5-HT的檢測分析。研究結(jié)果表明，此電極實現(xiàn)了兩者的電化學(xué)響應(yīng)的增強和區(qū)分。此外，引入的銀納米顆粒（AgNPs）作為拉曼增強因子和捕獲分析物的納米顆粒，同樣地經(jīng)過DEP富集方法，使分析物的拉曼信號增強了2個數(shù)量級，且能對共混物進行特征峰的區(qū)分。將此電極應(yīng)用于血漿樣品分析，可得到富集增強的電化學(xué)響應(yīng)，但電化學(xué)響應(yīng)會受到富集次數(shù)的限制。

關(guān)鍵詞?基于納米孔道的金納米電極;多巴胺;5-羥色胺;介電泳富集;表面增強拉曼光譜

1?引 言

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，多巴胺（DA）和5-羥色胺 （5-HT）是兩種重要的神經(jīng)遞質(zhì)[1]。其中，DA作為重要的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)分子，參與人體腦部工作和體液循環(huán)，是一種興奮神經(jīng)的神經(jīng)遞質(zhì)[2];而5-HT多為抑制興奮的神經(jīng)遞質(zhì)[3]。由于DA和5-HT在生命體系統(tǒng)中是同時存在的，因此，二者的同時檢測并區(qū)分顯得尤其重要。目前，關(guān)于提高DA[4，5]和5-HT[6]檢測的選擇性和靈敏度的研究方法較多，其中，電化學(xué)技術(shù)由于具有簡單操作、高選擇性和高靈敏度等特點而得到廣泛的關(guān)注。

基于納米孔道（Nanopipette，NP）的納米電極在電分析檢測中具有獨特的優(yōu)勢，近年來備受關(guān)注[7～9]。NP可用于制造成內(nèi)壁/外壁金屬的[10，11]、內(nèi)壁碳填充的[12]或者其它導(dǎo)電材料修飾的[13]等具有不同的功能和構(gòu)造的納米電極，還可以通過電化學(xué)、光化學(xué)或者界面反應(yīng)等進一步修飾[14～16]。盡管NP在環(huán)境檢測和掃描電化學(xué)顯微鏡等[8，17]領(lǐng)域的應(yīng)用都取得了很大的進展，但對準確識別生物小分子，尤其是在人體樣品分析方面仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)。近年來，已有許多關(guān)于生物小分子的電化學(xué)檢測的報道[18～20]，然而在體內(nèi)和體外傳感中對各種神經(jīng)遞質(zhì)（如DA、5-HT、抗壞血酸、去甲腎上腺素等）的檢測，多集中在提高電化學(xué)信號的靈敏度以及特異性檢測的研究。這是由于神經(jīng)遞質(zhì)的釋放速度快，且在細胞外環(huán)境中的濃度低[1]，導(dǎo)致檢測到的電化學(xué)信號弱。雖然有多種方法可以提高這些具有電化學(xué)活性的小分子神經(jīng)遞質(zhì)在納米電極上的電化學(xué)響應(yīng)[21，22]，但在同時測定這些神經(jīng)遞質(zhì)分子時，由于性質(zhì)相近，電化學(xué)信號互相之間存在干擾[4]，通常需要對電極表面進一步修飾，才可以達到高靈敏度和特異性檢測的要求。同時，考慮到僅依靠單一的電化學(xué)信號無法獲取多種有用信息，而表面增強拉曼光譜（Surface-enhanced Raman scattering，SERS）作為一種精確的、無損傷的光譜技術(shù)，可以更好地輔助檢測和區(qū)分，實現(xiàn)無損檢測和分子官能團的確認。

本研究制備了一種基于NP的金納米電極（Gold nanoelectrode-nanopipette，GNE-NP），通過在納米電極尖端上電化學(xué)沉積金，使得納米電極同時具有電化學(xué)特性和拉曼活性。在本研究組之前的報道中[23，24]已經(jīng)證明了基于NP的碳納米電極可以通過交流介電泳（Dielectrophoresis，DEP）富集方法，在電極尖端附近快速富集帶電荷的分子或納米顆粒，為增強DA和5-HT分子電化學(xué)信號和拉曼信號提供了有效的檢測手段。本研究結(jié)果將有助于更深入研究DA和 5-HT二者之間的電化學(xué)行為，并提供了有效增強電化學(xué)和拉曼光譜檢測信號的方法。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

CHI 852D電化學(xué)工作站（上海辰華公司）;SRS DS345函數(shù)發(fā)生器（美國斯坦福公司）;P-2000 CO2激光拉制儀、QF-100-7.5石英玻璃管（美國Sutter公司）;JEOL JSM-7610F掃描電鏡（日本電子公司）;LabRAM HR Evolution激光拉曼光譜儀（法國Horiba公司）;磁力加熱攪拌器（上海精密科學(xué)儀器有限公司）;燒制碳電極設(shè)備（自建）;500 mL丁烷氣瓶（純度99.9%），Φ 0.25 mm Ag/AgCl絲和Φ 0.5 mm的鉑絲（北京國藥試劑公司）。

四水合氯金酸（HAuCl4·4H2O，上海麥克林公司）;三氯化六氨合釕（Ru（NH3）6Cl3）、鹽酸多巴胺（DA）、鹽酸5-羥色胺（5-HT）（Sigma Aldrich公司）;AgNO3、三水合檸檬酸三鈉（北京國藥試劑公司）;HCl、H2SO4（98%）、無水乙醇、H2O2（37%）、1×PBS溶液（pH=7.43）等試劑均為分析純;實驗用水均為Milli-Q超純水（18.2 MΩ·cm）。實驗所用血清由當?shù)蒯t(yī)院提供。

2.2?實驗方法

2.2.1?金納米電極的制備與表征?（1）拉制納米孔道電極?石英管（長度7.5 cm，內(nèi)徑0.5 mm，外徑1.0 mm）分別用Piranha洗液（H2SO4-H2O2，3∶1，V/V）、水、乙醇清洗，再用氮氣吹干，保持干燥。將石英管置于P2000拉制儀上拉制出兩根對稱的孔徑約100 nm的納米孔道電極，拉制參數(shù)如下：Heat=670;FIL=5;VEL=60;DEL=145;PUL=100。（2）燒制碳電極?參考文獻[23]的方法。在納米管內(nèi)通入～30 kPa的丁烷氣體，并對準尖端進行高溫?zé)?，丁烷氣體通過高溫?zé)峤鈺谑⒐芸椎纼?nèi)壁沉積碳，從而制備得到碳納米電極（Carbon nanoelectrode-nanopipette，CNE-NP）。最后，在碳納米電極的尖端利用電化學(xué)沉積金。Ag/AgCl絲為參比電極，鉑絲為對電極，鍍金溶液為1 mmol/L HAuCl4的PBS溶液，電沉積電位為70 mV，并控制沉積電流達到40 nA時停止電沉積。制備好的GNE-NP用水沖洗干凈，氮氣吹干。NP、CNE-NP及GNE-NP分別采用掃描電鏡進行形貌表征。（3）電化學(xué)檢測?采用循環(huán)伏安法（Cyclic voltammetry，CV）對GNE-NP電極鍍金前后的電化學(xué)性能進行對比。Ag/AgCl為參比電極，鉑絲電極為對電極，1 mmol/L Ru（NH3）6Cl3作為電化學(xué)探針。循環(huán)伏安和差分脈沖伏安（Differential pulse voltammetry，DPV）檢測均在CHI 852D電化學(xué)工作站上進行，電流精度0.01 pA。