血清miR-711、miR-203對阿爾茨海默病的診斷效能評估

于 明 錢勝男 徐宇浩 孟 潔

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是老年人發(fā)生癡呆的首要病因，給家庭和社會帶來了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)[1]。輕度認(rèn)知障礙(mild cognitive impairment，MCI)是未發(fā)展到癡呆的過渡階段[2]。其中，以記憶損害為主要表現(xiàn)的遺忘型輕度認(rèn)知功能障礙(amnestic mild cognitive impairment，aMCI)是結(jié)局易發(fā)展為AD源性癡呆或AD癡呆(AD-dementia，ADD)的高風(fēng)險(xiǎn)MCI類型，可認(rèn)為是AD病程發(fā)展的早期階段[3]。因此對aMCI和AD患者進(jìn)行早期識別和干預(yù)至關(guān)重要。然而，AD和aMCI作為以認(rèn)知功能障礙為主要表現(xiàn)的疾病，其診斷過程中過度依賴量表評分，主觀性較強(qiáng)，現(xiàn)仍缺乏高效便捷的客觀指標(biāo)應(yīng)用于診斷。目前血清miRNA以簡單、無創(chuàng)、迅速等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于多種疾病的診斷和監(jiān)測。已有諸多研究顯示miRNAs在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和高級腦功能的生理中起著重要作用，并參與了神經(jīng)變性疾病的病理機(jī)制[4～6]。miR-711和miR-203作為參與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的兩個關(guān)鍵分子，已有研究應(yīng)用于腦損傷的診療，然而在AD患者中的應(yīng)用尚未見報(bào)道[7,8]。本研究通過檢測aMCI及ADD患者血清中miR-711和miR-203的表達(dá)，評價(jià)兩者對aMCI、ADD診斷價(jià)值。

資料與方法

1.一般資料收集：采用病例對照研究，收集18例健康志愿者作為正常對照組(NC)，并選取2018年11月～2019年5月在江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的18例aMCI、18例ADD患者作為研究對象。所有研究對象均由專業(yè)的神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)生進(jìn)行臨床診斷及認(rèn)知功能評估，并行血液學(xué)檢查排除肝臟、腎功能障礙、甲狀腺、血清梅毒和HIV抗體及腫瘤標(biāo)志物陽性的受試者。所有受試者均簽署知情同意書。本研究經(jīng)江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審查批準(zhǔn)。

2.納入標(biāo)準(zhǔn)：aMCI組納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)國際工作組在2003年提出的MCI診斷及分類標(biāo)準(zhǔn)[9]和Petersen提出的aMCI診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]：可通過患者的病史資料、知情人講述或臨床醫(yī)生觀察發(fā)現(xiàn)的以記憶力減退為主訴的認(rèn)知功能障礙，其他認(rèn)知領(lǐng)域保持相對完整；記憶損害超出了患者年齡和教育背景的正常功能范圍，但不足以診斷為癡呆；日常生活能力不受影響；②臨床癡呆評定量表(CDR)評分0.5分；③頭顱CT/MR除外腦血管病、占位及其他異常信號。ADD組納入標(biāo)準(zhǔn)：①2011年美國神經(jīng)病學(xué)、語言障礙和卒中研究所-AD及相關(guān)疾病協(xié)會(NINCDS-ADRDA) 提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)中的“很可能的AD癡呆”[11]；②排除帕金森、路易體癡呆等其他原因所致的癡呆；③CDR評分≥1分；④頭顱CT/MR有雙側(cè)顳葉內(nèi)側(cè)萎縮的證據(jù)，支持AD的診斷，且除外腦血管病、占位及其他異常信號。NC組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡和性別與病例組完全匹配；②日常生活功能良好；③CDR評分0分，認(rèn)知功能正常；④直系親屬中無癡呆患者；⑤頭顱CT/MR及神經(jīng)系統(tǒng)檢查無異常。

3.排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重精神疾病、腫瘤、風(fēng)濕免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重的肝臟、腎功能不全、其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腦器質(zhì)性疾病和顱腦外傷等。

4.血清樣本收集：所有研究對象均在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下使用促凝管采集4～5ml靜脈血，置于4℃冰箱保存2h后，于4℃離心機(jī)以3000r/min離心10min，收集上清液進(jìn)行miR-711和miR-203表達(dá)水平測定。

5.引物設(shè)計(jì)及合成：采用莖環(huán)法進(jìn)行引物合成，所有引物均由上海生物工程技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。熒光定量PCR引物序列如下：miR-711：上游引物5′-CGGGGACCCAGGAGA-3′；下游引物5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。miR-203b-5p：上游引物5′-GCGCGTAGTGGTCCTAAACAT-3′；下游引物5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。

6.RNA提取及定量檢測：首先參照miRNA提取試劑盒的指示，提取血清中總miRNA，并使用分光光度儀檢測RNA濃度和純度；然后用HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit(by stem-loop)對RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；繼之進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)：按照UltraSYBR Mixture(Low ROX)試劑盒說明配置50μl的反應(yīng)體系，以U6作為內(nèi)參基因，按照三步法反應(yīng)程序進(jìn)行PCR反應(yīng)，預(yù)變性(95℃ 10min)、變性(95℃ 10s)、退火(58℃ 30s)、延伸(72℃ 32s)，共35個循環(huán)；最后用溶解曲線(95℃ 15s、60℃ 1min、95℃ 15s、 60℃ 15s)檢測特異性。按照2-ΔΔCt算法計(jì)算相對定量表達(dá)分析。

7.神經(jīng)心理學(xué)測試：由神經(jīng)科醫(yī)生采用MoCA和CDR量表對所有受試者在安靜環(huán)境中進(jìn)行認(rèn)知功能評估。

結(jié) 果

1.3組受試者臨床資料比較：3組在年齡、性別、受教育年限方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)，具有可比性；3組危險(xiǎn)因素比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組CDR和MoCA評分兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與NC組比較，aMCI組和AD組的MoCA評分均降低，而CDR評分均升高。

表1 3組受檢者的一般資料

2.3組血清miR-711和miR-203相對表達(dá)量的比較：3組間miR-711和miR-203相對表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.28，P=0.000；F=12.20，P=0.000)。事后分析發(fā)現(xiàn),與NC組比較，aMCI和ADD組血清miR-711表達(dá)均增加(P<0.01、P=0.000)，且在ADD組中表達(dá)增加更明顯；aMCI和ADD組血清miR-711表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1)。與NC組比較，ADD組血清miR-203表達(dá)增加(P=0.000)、aMCI組血清miR-203表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；ADD組血清miR-203表達(dá)較aMCI組增加更加明顯(P<0.01，圖2)。

圖1 血清中miR-711在3組中的相對表達(dá)水平*P<0.01，**P=0.000

圖2 血清中miR-203在3組中的相對表達(dá)水平*P<0.01,**P=0.000

3.血清miR-711和miR-203相對表達(dá)量與認(rèn)知功能的關(guān)系：Spearman相關(guān)性分析表明，血清miR-711和miR-203相對表達(dá)量與MoCA評分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.52，P=0.000；r=-0.49，P=0.000，圖3)。

圖3 miR-711、miR-203與MoCA評分的相關(guān)性

4.血清miR-711和miR-203對aMCI診斷價(jià)值的ROC分析：應(yīng)用ROC曲線評價(jià)血清 miR-711用于診斷aMCI時，曲線下面積(AUC)為0.812(95%CI：0.669～0.954，P<0.01，圖4)，具有一定的診斷價(jià)值；其診斷臨界值為 1.626 時，特異性為72.2%，敏感度為88.9%。血清 miR-203用于鑒別aMCI及ADD時，AUC為0.718(95%CI：0.551～0.884，P<0.05，圖5)，具有一定的鑒別診斷價(jià)值；其診斷臨界值為1.965時，特異性為72.2%，敏感度為61.1%。

圖4 miR-711對診斷遺忘型輕度認(rèn)知障礙的ROC曲線

圖5 miR-203對鑒別遺忘型輕度認(rèn)知障礙和ADD的ROC曲線

5.血清miR-711和miR-203對ADD診斷價(jià)值的ROC分析：單獨(dú)檢測血清中miR-711和miR-203表達(dá)水平對ADD患者的診斷有很高的價(jià)值，且兩者聯(lián)合診斷價(jià)值更高(P=0.000，圖6)。檢測血清 miR-711水平用于診斷ADD時，AUC為0.875(95%CI：0.763～0.987，P<0.01)，具有一定診斷價(jià)值；其診斷臨界值為 0.536 時，特異性為 88.9%，敏感度為77.8%。檢測血清miR-203水平用于診斷 ADD時，AUC為0.889(95%CI：0.776～1.000，P<0.01)，診斷價(jià)值較高；其診斷臨界值為0.715時，特異性為100%，敏感度為66.7%。運(yùn)用Logistic回歸模型構(gòu)建血清miR-711和miR-203聯(lián)合診斷的ROC曲線分析顯示，AUC為 0.948(95%CI：0.871～1.000，P=0.000)；當(dāng)診斷臨界值為0.46時，特異性為94.4%，敏感度為94.4%。

圖6 血清miR-711、miR-203對ADD單獨(dú)及聯(lián)合診斷的ROC曲線

討 論

AD是隱匿起病、進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病，因高發(fā)生率和巨大的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)成為亟待解決的問題。近10余年來對AD的發(fā)展過程已有了深入了解，目前國際公認(rèn)的AD的3個階段包括無癥狀持續(xù)發(fā)展的臨床前階段、AD源性的MCI階段以及終末的AD癡呆階段。aMCI作為廣義的MCI中常見的類型，較其他MCI更易向ADD轉(zhuǎn)化，認(rèn)為是ADD的臨床高危階段[12]。目前認(rèn)知障礙性疾病的診斷和鑒別以臨床癥狀、神經(jīng)心理學(xué)量表、神經(jīng)影像學(xué)為主，NIA-AA也提出了腦脊液Aβ42和tau蛋白等生物學(xué)標(biāo)志物，但都有一定的局限性[10]。作為可早期識別和診斷認(rèn)知障礙性疾病的非侵入性、廉價(jià)、高效的生物學(xué)標(biāo)志物，血清miRNA成為目前癡呆領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[13]。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a-5p和 miR-545-3p在AD患者血清中表達(dá)水平明顯高于MCI和NC組，可作為早期診斷AD的標(biāo)志物[14]。Hill等[15]研究發(fā)現(xiàn)AD患者外周血中miR-29、miR-107、miR-181及miR-146存在著差異性表達(dá)，可能參與了AD的發(fā)病機(jī)制，但目前尚無達(dá)成一致的高特異性的血清診斷標(biāo)志物。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)認(rèn)知障礙疾病的發(fā)病機(jī)制與多種因素相關(guān)，包括神經(jīng)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、線粒體及突觸損傷等，miR-711和miR-203曾證明可作為創(chuàng)傷性腦損傷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，但在認(rèn)知障礙疾病中尚無研究，檢測兩者在血清中的表達(dá)水平可能為aMCI和ADD的診斷提供一定的應(yīng)用價(jià)值[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，aMCI和ADD組中血清miR-711表達(dá)均較NC組增加，以ADD組增加更明顯；但aMCI和ADD組的血清miR-711表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析表明，miR-711表達(dá)水平與MoCA評分呈負(fù)相關(guān)，可見miR-711可作為評估認(rèn)知功能障礙程度的指標(biāo)。另外，ROC曲線分析顯示，miR-711對ADD及aMCI的診斷具有一定的應(yīng)用價(jià)值。在AD的臨床前階段，雖然患者未出現(xiàn)明顯的認(rèn)知功能改變或僅有輕微受損，但是體內(nèi)的病理學(xué)改變已經(jīng)出現(xiàn)[17]。隨著認(rèn)知功能受損的加重，病理標(biāo)志物的變化可能更加顯著，更易被檢出。本研究表明，雖然aMCI患者認(rèn)知功能減退不明顯，但miR-711在體內(nèi)的表達(dá)量已發(fā)生改變，故可將miR-711作為aMCI初篩標(biāo)志物。已有研究發(fā)現(xiàn)，在控制性腦皮質(zhì)撞擊模型中，小鼠腦損傷后3h就可檢測到海馬中miR-711表達(dá)水平上調(diào)；而海馬與認(rèn)知功能密切相關(guān)，推測本研究中血清miR-711的早期改變可能與海馬早期受損機(jī)制相關(guān)。另外，通過KEGG等通路分析以及靶向因子等實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-711可靶向抑制AKT誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，同時也參與氧化應(yīng)激通路，這可能與認(rèn)知障礙性疾病的機(jī)制相關(guān)[7]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，ADD組血清miR-203表達(dá)較NC組及aMCI組均增高，但aMCI組血清miR-203表達(dá)與NC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，miR-203雖然不能發(fā)現(xiàn)早期的認(rèn)知功能障礙，但監(jiān)測血清miR-203的表達(dá)水平可能能夠反映認(rèn)知障礙的損害程度。實(shí)驗(yàn)證明，在原代培養(yǎng)的小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中，過表達(dá)miR-203導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，同時神經(jīng)變性相關(guān)突觸表達(dá)也下調(diào)[18]。因此，miR-203可能通過參與突觸的丟失機(jī)制導(dǎo)致認(rèn)知功能減退。另外，ROC曲線分析表明miR-203對AD有一定的診斷價(jià)值，且miR-711和miR-203二者聯(lián)合檢測時AUC最大，AD的診斷效能也得到了進(jìn)一步提升。

綜上所述，本研究檢測了miR-711和miR-203在認(rèn)知障礙性疾病患者血清中的表達(dá)，提示兩者有望成為疾病診斷的血清學(xué)標(biāo)志物，具有一定的推廣及應(yīng)用潛力。但是，本研究中血清樣本量少，也未對aMCI患者進(jìn)行隨訪觀察其轉(zhuǎn)歸情況，因此后期需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行多中心的臨床實(shí)驗(yàn)及完善隨訪研究。此外，本實(shí)驗(yàn)組后期還將通過構(gòu)造細(xì)胞及動物模型進(jìn)一步探索miR-711和miR-203參與認(rèn)知障礙性疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，旨在對疾病的篩查、預(yù)防及治療提供新靶點(diǎn)。