表達(dá)豬瘟病毒E0-E2 蛋白的重組腺病毒疫苗免疫效力研究

梁易曉，張 會(huì)，王志鵬，楊玉艾，范根成，孫永科*，張 恒,*

（1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650210；2. 青島易邦生物工程有限公司動(dòng)物基因工程疫苗國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266114；3. 青島韋力國(guó)際集團(tuán)，山東 青島 266000）

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由CSF 病毒（CSFV）引起的一種急性、熱性和高度接觸傳染的病毒性傳染病[1]，其主要特征表現(xiàn)為發(fā)病急、高熱稽留和細(xì)小血管變性，引發(fā)全身泛發(fā)型小點(diǎn)出血，脾梗死，給中國(guó)及世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前，疫苗接種仍然是預(yù)防豬瘟的有效途徑之一，但豬瘟感染的癥狀逐漸趨向于慢性、隱性等非典型性流行形式，因此研制安全、有效的疫苗以控制豬瘟的流行勢(shì)在必行。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒及痘苗病毒等已成為現(xiàn)如今研制活載體疫苗較為成熟的病毒載體。其中，腺病毒載體以其安全、高效、宿主范圍廣、轉(zhuǎn)移和表達(dá)外源基因能力強(qiáng)的特點(diǎn)，成為繼逆轉(zhuǎn)錄病毒載體后在基因治療、基因免疫等方面應(yīng)用開(kāi)發(fā)得較早的一種病毒載體[3]。特別是復(fù)制缺陷型腺病毒載體已經(jīng)發(fā)展到了第三代，由于缺失了病毒非必要基因區(qū)（E1/E3），使得能夠攜帶大片段的外源基因，并且只能夠在特定的細(xì)胞系中繁殖。另外， 該載體系統(tǒng)還引入了CMV 啟動(dòng)子，使得外源基因可以高水平的表達(dá)[4]。

目前已經(jīng)確定的CSFV 結(jié)構(gòu)蛋白有5 種，即Npro、C、E0（Erns）、E1 和E2。其中E0 和E2 是病毒誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的兩個(gè)主要保護(hù)性抗原，同時(shí)也是病毒吸附、進(jìn)入敏感細(xì)胞的必需蛋白[5]。CSFV 的宿主嗜性與E0 有關(guān)，用E0 中和單克隆抗體可有效阻斷CSFV 對(duì)易感動(dòng)物細(xì)胞的感染[6]。在體外E2 可誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒的中和抗體，體內(nèi)可誘導(dǎo)抗CSFV的保護(hù)免疫，保護(hù)豬抵抗致死量CSFV 的攻擊[7]。另外，E0 和E2 嵌合抗原能明顯提高血清學(xué)診斷的敏感性，并且比單獨(dú)使用E2 抗原提前7 日檢測(cè)到豬瘟病毒的感染[8]。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)E0，E2 基因的重組腺病毒活載體疫苗具有良好的免疫保護(hù)效果[9-10]。本研究對(duì)前期構(gòu)建的活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）[11]的免疫效力進(jìn)行研究，以確定其最小免疫劑量及免疫期，為該疫苗后續(xù)的應(yīng)用研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 表達(dá)豬瘟病毒E0-E2蛋白的重組腺病毒疫苗（rAd-E0-E2 株），簡(jiǎn)稱(chēng)“活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）”，每頭份病毒含量為1.58×107.0IFU[12]，由青島易邦生物工程有限公司研發(fā)中心凍干保存；豬瘟活疫苗（脾淋源，C 株），簡(jiǎn)稱(chēng)“C 株”，由青島易邦生物工程有限公司凍干苗車(chē)間生產(chǎn)；攻毒用豬瘟病毒石門(mén)系（CVCC AV1411）血毒（F115 代），≥105.0MLD，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物保藏中心（CVCC），由青島易邦生物工程有限公司復(fù)壯、鑒定、保存和提供；豬瘟病毒ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自IDEXX 公司。

45～55 日齡健康易感仔豬（豬瘟病毒ELISA 抗體均陰性，豬瘟病毒、PCV2、豬繁殖與呼吸綜合征病毒均陰性）40 頭，由青島易邦生物工程有限公司自繁自養(yǎng)備用。

1.2 試驗(yàn)分組及設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，攻毒方式為頸部肌肉注射豬瘟病毒石門(mén)系血毒1.0 mL（病毒含量不低于105.0MLD）。

1.3 豬瘟病毒抗體檢測(cè) 1～5 組試驗(yàn)豬于免疫后7 d、14 d前腔靜脈采血，分離血清；6～8組試驗(yàn)豬于免疫后7 d、14 d、21 d，30 d、60 d、90 d、120 d、150 d、180 d、210 d前腔靜脈采血，收集血清。利用豬瘟病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組豬瘟病毒抗體。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design

1.4 攻毒后體溫監(jiān)測(cè) 所有試驗(yàn)動(dòng)物于攻毒前2 日至攻毒后16 日，每日定時(shí)測(cè)溫1 次，記錄并統(tǒng)計(jì)溫度變化。

1.5 臨床癥狀及剖檢 所有試驗(yàn)動(dòng)物于攻毒前2 d至攻毒后16 d，每日定時(shí)觀察豬的精神、采食、飲水、糞便和發(fā)病情況；攻毒后16 d 剖檢所有存活試驗(yàn)豬，觀察組織病變，記錄并統(tǒng)計(jì)攻毒保護(hù)率。

2 結(jié) 果

2.1 CSFV 抗體檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 最小免疫劑量抗體檢測(cè)結(jié)果 1～4 組分別免疫不同劑量活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）后7 d、14 d收集血清，檢測(cè)豬瘟病毒ELISA 抗體，結(jié)果顯示，1 組豬免疫后14 d 的抗體平均阻斷率為15.5%，0/5抗體為陽(yáng)性；2 組豬免疫后14 d 的抗體平均阻斷率為35.3%，1/5 抗體為陽(yáng)性；3 組豬免疫后14 d 的抗體平均阻斷率為45.8%，5/5 抗體為陽(yáng)性；4 組豬免疫后14 d 的抗體平均阻斷率為51.0%，5/5 抗體為陽(yáng)性；5 組陰性對(duì)照組豬免疫后14 d 的抗體阻斷率均≤16.4%，0/5 抗體為陽(yáng)性。1/10 頭份的活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）免疫豬后14 d 抗體水平就接近陽(yáng)性，1/2 頭份以上的活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）免疫豬后14 d 豬瘟抗體水平全部轉(zhuǎn)為陽(yáng)性（圖1）。表明該疫苗免疫效果較好，最小免疫劑量為1/10 頭份。

2.1.2 免疫期抗體檢測(cè)結(jié)果 6組實(shí)驗(yàn)豬使用1頭份活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）免疫后不同時(shí)間點(diǎn)采血，分離血清，ELISA 測(cè)定血清中豬瘟病毒抗體。結(jié)果顯示，免疫后14 d抗體全部轉(zhuǎn)陽(yáng)，抗體至少持續(xù)至免疫后7個(gè)月；7組豬接種1頭份C株，免疫后14 d有4/5抗體出現(xiàn)為陽(yáng)性，隨后抗體稍下降為可疑水平，之后抗體逐漸全部轉(zhuǎn)為陽(yáng)性；陰性對(duì)照組抗體阻斷率至試驗(yàn)結(jié)束一直為陰性（圖2）。表明，1 頭份活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）免疫豬，抗體水平能持續(xù)至少為7 個(gè)月，且抗體水平高于同期1頭份C株免疫的抗體水平。

圖1 不同劑量的活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）免疫豬后抗體平均阻斷率變化規(guī)律Fig.1 Blocking rate of antibodies from pig immunized with different doses of live carrier vaccine(rAd-E0-E2 strain)

圖2 活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）免疫豬后抗體水平變化Fig.2 Dynamic changes of antibody levels in piglets after immunization with live vector vaccine(rAd-E0-E2 strain)

2.2 最小免疫劑量組攻毒后體溫變化、臨床癥狀及其保護(hù)結(jié)果

2.2.1 最小免疫劑量組攻毒后體溫變化 1 組4/5 于攻毒后2 d 體溫升高超過(guò)40 ℃，1/5 至攻毒后16 d 沒(méi)有出現(xiàn)高熱稽留；2 組、3 組、4 組攻毒后體溫正常，無(wú)發(fā)熱現(xiàn)象；5 組對(duì)照組于攻毒后2 d～3 d 均體溫升高，出現(xiàn)高熱稽留。即用1/10 頭份及以上的活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）免疫14 d 后攻毒，沒(méi)有出現(xiàn)豬瘟的典型發(fā)熱現(xiàn)象（圖3）。表明，免疫1/10 頭份的活載體疫苗（rAd-E0-E2株）就對(duì)豬具有保護(hù)作用。

圖3 不同劑量的活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）免疫豬后攻毒體溫變化Fig.3 Dynamic changes of body temperature in challenged piglets immunized with different doses of live vector vaccine(rAd-E0-E2 strain)

2.2.2 最小免疫劑量組攻毒后臨床癥狀與剖檢結(jié)果

1 組攻毒后4/5 出現(xiàn)高熱稽留，眼結(jié)膜發(fā)炎，精神沉郁，食欲下降并且出現(xiàn)便秘或腹瀉，解剖可見(jiàn)這4頭豬出現(xiàn)脾臟腫大，邊緣有梗死；腎臟有大小不一彌散性出血點(diǎn)；心臟出現(xiàn)針尖狀出血點(diǎn)；喉頭有出血點(diǎn)和淤血；膀胱內(nèi)壁有出血點(diǎn)等組織器官病變；2組、3組、4組攻毒后無(wú)臨床癥狀，剖檢組織無(wú)病變；5組陰性對(duì)照組攻毒后5/5出現(xiàn)典型的CSF癥狀，剖檢后發(fā)現(xiàn)典型病變（圖4）。表明，用1/10 頭份及以上的活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）免疫豬14 d 后，能保護(hù)豬不因豬瘟強(qiáng)毒的攻擊而出現(xiàn)豬瘟臨床癥狀及其組織器官病變。

2.2.3 最小免疫劑量組攻毒后疫苗保護(hù)結(jié)果 1 組于攻毒后僅1/5 保護(hù)，有4 頭在攻毒后11 d～12 d 死亡，表現(xiàn)典型豬瘟癥狀和組織病變；2 組、3 組、4組在攻毒后均5/5 保護(hù)，沒(méi)有出現(xiàn)CSF 臨床癥狀，剖檢無(wú)病變；5 組對(duì)照組在攻毒后9 d～10 d 全部死亡，期間體溫高熱稽留，表現(xiàn)典型的CSF 癥狀，剖檢組織病變嚴(yán)重（圖5、表2）。表明，用1/10 頭份及以上的活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）免疫豬14 d 后，能完全保護(hù)豬不因?yàn)樨i瘟強(qiáng)毒的攻擊而死亡。

圖4 組織病變圖Fig.4 Pathological changes of tissues

圖5 不同劑量的活載體疫苗（rAd-E0-E2株）免疫豬后攻毒生存曲線Fig.5 Survival curve of challenged piglets with different doses of live vector vaccine(rAd-E0-E2 strain)

表2 不同劑量的活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）免疫豬后攻毒保護(hù)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 Statistical result of the challenge protection efficacy of challenged pigs with different doses of live vector vaccine(rAd-E0-E2 strain)

2.3 免疫期組攻毒后體溫變化、臨床癥狀及其保護(hù)結(jié)果

2.3.1 免疫期組攻毒后體溫變化 6 組、7 組攻毒后體溫正常，均無(wú)發(fā)熱現(xiàn)象；8 組陰性對(duì)照組于攻毒后2 d～3 d 開(kāi)始發(fā)熱，體溫升高超過(guò)40 ℃，出現(xiàn)高熱稽留（圖6）。表明，活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）、C株均能保護(hù)免疫豬至少7 個(gè)月不受豬瘟石門(mén)系野毒株的感染。

2.3.2 免疫期組攻毒后臨床剖檢結(jié)果 6 組、7 組免疫后7 個(gè)月攻毒，觀察無(wú)豬瘟典型臨床癥狀出現(xiàn)，16 d 后剖檢組織無(wú)病變；8 組陰性對(duì)照組攻毒后5/5出現(xiàn)CSF 癥狀，剖檢后組織器官均有典型的豬瘟病變（表3）。表明，活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）、C 株均能保護(hù)免疫豬至少7 個(gè)月不受豬瘟石門(mén)系野毒株的感染。

2.3.3 免疫期組攻毒后疫苗保護(hù)率 6 組、7 組攻毒后均5/5 保護(hù)，無(wú)CSF 臨床癥狀，剖檢無(wú)病變；8 組陰性對(duì)照組在攻毒后14 d 內(nèi)全部死亡，期間體溫高熱稽留，表現(xiàn)典型的CSF 癥狀，剖檢組織發(fā)現(xiàn)病變（表3）。表明，活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）、C 株均能保護(hù)免疫豬至少7 個(gè)月免受豬瘟強(qiáng)毒的侵害。

圖6 免疫期組攻毒后體溫變化Fig.6 Dynamic changes of body temperature in pigs after challenge in the immune duration group

表3 免疫期組攻毒保護(hù)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 3 Statistical results of the protection rates of challenged pig in the immune duration group

3 討 論

豬瘟活載體重組疫苗是將豬瘟病毒的抗原基因重組到能表達(dá)外源性病毒蛋白的活載體中制得的一種疫苗，該疫苗直接免疫動(dòng)物后可引起機(jī)體產(chǎn)生特異性的免疫反應(yīng)，具有能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，不散毒及便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，是近年來(lái)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。Sun 等基于重組腺病毒5 型構(gòu)建了CSFV E2 基因的活載體疫苗rAdV-E2，使家兔和豬免疫后體內(nèi)產(chǎn)生高水平的CSFV 特異性中和抗體，具有很好的保護(hù)作用[13-15]。本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)構(gòu)建了活載體疫苗（rAd-E0-E2 株），并對(duì)其進(jìn)行了安全性檢驗(yàn)，即在小鼠體內(nèi)的存留時(shí)間分析證明活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）在小鼠體內(nèi)的最長(zhǎng)存留時(shí)間為72 h，驗(yàn)證了活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）對(duì)小鼠的安全性[16]。根據(jù)中華人民共和國(guó)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)行的豬瘟疫苗免疫效力檢驗(yàn)主要依靠家兔或豬進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)。前期本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)在兔體上對(duì)活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）的免疫原性進(jìn)行了分析[17]，確定了活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）在兔體上的保護(hù)效力。本研究以豬為靶動(dòng)物對(duì)活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）進(jìn)行免疫效力分析，并確定其最小免疫劑量和免疫期，為后期的生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

本研究使用實(shí)驗(yàn)室試制活載體疫苗rAd-E0-E2株，以豬為靶動(dòng)物，通過(guò)檢測(cè)抗體水平、豬瘟石門(mén)系血毒攻毒、體溫監(jiān)測(cè)、臨床癥狀觀察及剖檢病變等幾種方法共同評(píng)價(jià)活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）的免疫效力。通過(guò)以上方法分析發(fā)現(xiàn)，1/10 頭份活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）免疫豬后7 d 和14 d 抗體平均阻斷率均未達(dá)到陽(yáng)性，但是免疫14 d 攻毒后卻能完全保護(hù)豬， 表明雖然1/10 頭份活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）免疫豬后通過(guò)體液免疫產(chǎn)生的抗體水平并不高，但可能通過(guò)激活細(xì)胞免疫或黏膜免疫共同抵御豬瘟強(qiáng)毒的致死量攻擊。所以使用活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）能在短時(shí)間內(nèi)通過(guò)細(xì)胞免疫或粘膜免疫等途徑來(lái)共同保護(hù)豬，減少了豬在免疫空窗內(nèi)感染豬瘟病毒從而發(fā)病的機(jī)率；使用1 頭份活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）免疫豬，免疫后7 d 抗體阻斷率全部轉(zhuǎn)為可疑水平，免疫后14 d 抗體阻斷率全部轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，高水平抗體持續(xù)至免后7 個(gè)月，并且高于同期1 頭份C 株免疫豬產(chǎn)生的抗體水平，即表明活載體疫苗（rAd-E0-E2 株）的免疫效力高于C株；并且免疫7 個(gè)月攻毒后豬完全被保護(hù)，說(shuō)明使用本品疫苗免疫一次就可達(dá)到至少7 個(gè)月的保護(hù)，為大規(guī)模的養(yǎng)殖提供了便利，更降低了時(shí)間成本和養(yǎng)殖成本。

綜上所述，疫苗的最小免疫劑量為1/10 頭份（1.58×106.0IFU），考慮到臨床實(shí)際應(yīng)用影響因素較多，為確保免疫效果，將疫苗的使用劑量定為最小免疫劑量的10 倍，即1 頭份?；钶d體疫苗（rAd-E0-E2株）免疫豬1頭份后免疫期至少為7 個(gè)月。