牛支原體武威分離株丙酮酸激酶基因的原核表達及其表達產(chǎn)物的功能檢測

包世俊，馮 娜，邢小勇，溫峰琴，武小椿

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

牛支原體（Mycoplasma bovis，Mb）是引起牛的重要病原體之一，其可引起牛的肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎、角膜結(jié)膜炎等病癥[1]。該病原于1961年首次在美國從乳房炎患牛中分離鑒定[2]，但直到1976 年才依據(jù)其16S rRNA 序列將其命名為Mb。近年來，隨著養(yǎng)牛業(yè)的不斷發(fā)展和牛群的大范圍轉(zhuǎn)移，Mb感染也迅速擴散和蔓延[3]，并已呈世界性分布。2008 年，我國首次出現(xiàn)Mb 感染所導(dǎo)致的犢牛壞死性肺炎疫情，其發(fā)病率高達50%～100%，病死率達10%～50%[4-5]，給我國養(yǎng)牛業(yè)，尤其肉牛養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失，并嚴(yán)重威脅我國養(yǎng)牛業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）又稱腺嘌呤核苷三磷酸-丙酮酸-2-O-磷酸轉(zhuǎn)移酶，是糖酵解和機體碳代謝途徑中的一個關(guān)鍵酶。目前已分離鑒定的不同生物體的PK 基本均是以四聚體的形式發(fā)揮作用[6]。研究報道顯示，雞毒支原體PK 是其細胞膜表面的一種免疫原性蛋白，且其參與雞毒支原體對宿主細胞的黏附[7]。但截至目前，對于Mb PK 相關(guān)的研究尚無報道，因此，本研究利用PCR 技術(shù)擴增了Mb 武威分離株的pyk 基因，對PK 在Mb 中的分布進行了檢測，并對其多克隆抗體介導(dǎo)的殺滅Mb 作用和多抗抑制Mb 對宿主細胞的粘附作用進行了分析，為深入探究Mb的致病機理和免疫機制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 Mb 武威分離株為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)傳染病實驗室分離保存；胎牛肺細胞（EBL）購自上海撫生生物科技有限公司；pGEM19-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α和Rosseta（DE3）感受態(tài)細胞均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；表達載體pET-28a（+）購自Novagen 公司。

1.2 主要試劑 Mb 兔抗血清為本實驗室自制并保存；羊抗兔HRP-IgG 購自北京凱瑞力楓科貿(mào)有限公司；限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ、2×Primer STAR Max DNA 聚合酶及T4 DNA 連接酶均購自寶生物工程（大連）有限公司；DL5000 DNA Marker 購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自Thermo 公司；BCA 蛋白定量分析試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒及DAB 顯色試劑盒均購自TIANGEN 公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigma 公司；Ni-NAT His Bind Purification Kit 購自Merck 公司；凍干補體（豚鼠源）購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；牛血纖維蛋白溶酶原（Native bovine plasminogen，Na?tive bovine PLG）購自O(shè)xford 公司；支原體培養(yǎng)基基礎(chǔ)購自青島海博生物技術(shù)有限公司；馬血清購自蘭州民海生物工程有限公司。新西蘭白兔購自蘭州獸醫(yī)研究所。

1.3 Mb 武威株的培養(yǎng)及基因組提取 凍存的Mb 武威株解凍后轉(zhuǎn)接種于5 mL 支原體液體培養(yǎng)基（支原體培養(yǎng)基基礎(chǔ)3.3 g，去離子水定容至100 mL，121 ℃高壓滅菌冷卻后加入馬血清10 mL，丙酮酸鈉0.2 g，青霉素80 000 IU）中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)3 d后取1.5 mL 培養(yǎng)物，12 000 r/min 離心10 min 后，棄 上清， PBS 洗滌3 次，參照細菌基因組DNA 提取試劑盒說明提取Mb 基因組DNA，凍存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 pyk 基因的擴增與原核表達載體的構(gòu)建 參照GenBank中Mb PG45株P(guān)K基因（pyk）序列（CP002188.1）設(shè)計2 對引物（表1），并在pyk-F 和pyk-R 分別引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點。采用over-lap PCR 擴增pyk 基因：以Mb 基因組DNA 為模板，以引物pyk-F/pyk-Rn 擴增A 片段，引物pyk-Fn/pyk-R 擴增B 片段，再以A+B 為模板，用引物pyk-F/pyk-R 擴增得到pyk基因全長；反應(yīng)程序為：98 ℃5 min；98 ℃45 s，54 ℃30 s，72 ℃45 s，30個循環(huán)；72 ℃10 min，PCR產(chǎn)物回收后克隆至pGEM19-T 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-pyk 并經(jīng)酶切鑒定，陽性克隆由金唯智公司測序鑒定。

將上述測序正確的質(zhì)粒用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后克隆至經(jīng)同樣酶切的原核表達質(zhì)粒pET-28a，構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pET-pyk，并由金唯智公司測序鑒定。

表1 pyk 基因PCR 擴增用到的引物Table 1 PCR primer used for amplifying pyk gene

1.5 重組蛋白的表達及純化 將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒pET-pyk 轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosseta（DE3）感受態(tài)細胞，37 ℃培養(yǎng)至OD600nm值為0.4～0.6，加入終濃度為1.0 mmol/L 的IPTG，20 ℃誘導(dǎo)10 h 后，離心洗滌菌體并以1×Binding buffer 懸浮菌體后超聲裂解，離心后，上清用0.45 μm 濾膜過濾，濾液中加入適量的Ni-NAT His Bind Resin，4 ℃振蕩孵育60 min 后將樣品移入純化柱體中，待液相的Binding buffer 全部流出柱體，用2×4 mL 的1×Wash buffer 洗除雜蛋白，最后用2 mL 1×Elution buffer 洗脫目的蛋白，分段收集樣品并用SDS-PAGE 分析。純化的原核表達產(chǎn)物His-PK 經(jīng)BCA 定量后分裝備用。

1.6 重組蛋白His-PK 兔抗血清的制備及其效價測定 將純化后的重組蛋白His-PK 與等體積弗氏完全佐劑混勻并充分乳化，按800 μg/只的劑量皮下多點注射免疫新西蘭大白兔，首免兩周后第二次免疫，劑量減半（400 μg/只），并與等體積弗氏不完全佐劑混勻并乳化，經(jīng)皮下多點注射免疫，此后，每間隔一周加強免疫一次，乳化方式和劑量同二免，四免后第5 d 采血分離血清，并經(jīng)間接ELISA 法[8]檢測重組蛋白His-PK兔抗血清的抗體效價，分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 PK 在Mb 細胞內(nèi)分布的檢測 取100 mL 培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期的Mb 液體培養(yǎng)物，12 000 r/min離心10 min，菌體沉淀用PBS 洗滌3 次后按150 倍濃縮量重懸，移取50 μL 常規(guī)裂解后作為下述試驗的Mb菌體蛋白對照，剩余菌懸液參考高翔等所述方法[8]提取Mb 膜蛋白。最后經(jīng)丙酮沉淀的膜蛋白與胞漿蛋白重懸于等體積的PBS 中。將等體積的膜蛋白和胞漿蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離后，以His-PK 兔抗血清（1∶5 000）為一抗，羊抗兔IgG-HRP（1∶8 000）為二抗，經(jīng)western blot 檢測PK 在Mb 胞膜和胞漿內(nèi)的分布。同時以純化的His-PK和Mb菌體蛋白為對照。

1.8 His-PK 多抗介導(dǎo)的補體殺Mb 試驗 參考高翔等方法[8]并略作調(diào)整，評估His-PK 多抗激活補體的殺Mb 作用。具體操作如下：取適量生長至對數(shù)生長后期的Mb 武威分離株菌液，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，無菌PBS 洗滌3 次，用適量的無菌PBS 重懸（6×109cfu/mL）。將180 μL Mb 菌懸液與60 μL 滅活的His-PK 兔多抗血清加入1.5mL 離心管、輕輕混勻并于37 ℃孵育30 min 后，加入60 μL 補體，混勻后37 ℃孵育1 h，用無菌PBS 做103、104、105稀釋后，分別取100 μL 涂布60 mm 培養(yǎng)皿，每個稀釋度平行做3 個重復(fù)。培養(yǎng)皿37 ℃，5%CO2培養(yǎng)5 d～7 d，計數(shù)菌落，計算殺菌率（%）[（His-PK 兔抗血清組CFU-免疫前兔血清組CFU）/補體對照組cfu×100%]。實驗設(shè)Mb 兔抗血清對照組、His-PK 免疫前血清對照組和補體對照組。試驗重復(fù)3 次，實驗數(shù)據(jù)利用SPSS22.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析His-PK 多抗介導(dǎo)的補體殺Mb 的作用。

1.9 His-PK 抗血清抑制Mb 粘附EBL 細胞的試驗為驗證Mb 對EBL 細胞的粘附功能，將6孔細胞培養(yǎng)板長至單層的EBL細胞，用無抗生素DMEM培養(yǎng)基洗滌3 次后加入終濃度為2.5 U/mL Native bovine PLG，37 ℃5%CO2條件下孵育2 h后經(jīng)無抗生素DMEM 培養(yǎng)基洗滌備用。將培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期的Mb 菌液12 000 r/min 離心10 min，無菌PBS 洗滌3 次后用無抗生素DMEM 重懸，并按MOI 200 的量感染Native bovine PLG 處理過的EBL 細胞，37 ℃5%CO2條件下孵育2 h，無菌PBS 充分洗滌后，加入少量預(yù)冷PBS刮取并收集細胞懸液，5 000 r/min 離心5 min，細胞沉淀中加入1 mL 0.25%的胰酶靜置裂解10 min 后，取50 μL 細胞裂解產(chǎn)物加到450 μL 預(yù)熱的支原體液體培養(yǎng)基中混勻后，10 倍倍比稀釋（10～105），選擇103～105稀釋度的Mb 各取100 μL 涂布支原體固體培養(yǎng)基（支原體培養(yǎng)基基礎(chǔ)3.3g，瓊脂粉1.2 g，定容至100 mL，121 ℃高壓滅菌，冷卻至55 ℃后加入馬血清10 mL，丙酮酸鈉0.2 g，青霉素80 000 IU，混勻后傾制培養(yǎng)皿），每個稀釋度分別設(shè)3 個重復(fù)。培養(yǎng)皿在37 ℃5%CO2培養(yǎng)5 d～7 d，計數(shù)菌落。分析Mb對EBL 細胞的粘附作用。

Mb 粘附EBL 細胞的抑制試驗，按MOI 200 的量取樣的Mb 菌懸液中加入His-PK 兔抗血清（1∶50），在37 ℃孵育1 h 后離心，Mb 沉淀重懸后移入Native bovine PLG 處理過的EBL 中，按上述步驟完成Mb 的粘附抑制試驗。設(shè)免疫前兔血清對照組和Mb 兔抗血清對照組。計算粘附抑制率（%）[（His-PK 兔抗血清組CFU-免疫前兔血清組CFU）/空白對照組CFU×100%]。試驗重復(fù)3 次，實驗數(shù)據(jù)利用SPSS22.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析His-PK 兔抗血清對Mb 粘附EBL 細胞的抑制作用。

2 結(jié) 果

2.1 pyk 基因的擴增與原核表達載體的鑒定結(jié)果以Mb 武威株的基因組DNA 為模板，分別PCR 擴增其pyk 基因的A 片段和B 片段，再以A+B 為模板經(jīng)over-lap PCR擴增得到pyk全基因。結(jié)果顯示，擴增的3 個片段大小分別約為1 290 bp、147 bp、1 437 bp，均與預(yù)期一致（圖1）。利用BamHⅠ和XhoⅠ對構(gòu)建的原核表達載體pET-pyk 進行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物條帶分別為1 437 bp 和5 400 bp，與預(yù)期大小一致（圖1），測序結(jié)果顯示插入的pyk 基因序列正確。表明原核表達載體pET-pyk 構(gòu)建正確。

圖1 Mb pyk 基因的over-lapPCR 擴增及重組表達載體pET-pyk 的雙酶切鑒定Fig.1 Over-lap PCR amplification of Mb pyk gene and Identification of recombinant expression vector pET-pyk by double endonucleases digestion

2.2 重組蛋白的表達及純化 重組質(zhì)粒pET-pyk 轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosseta（DE3）感受態(tài)細胞后，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后，利用SDS-PAGE 檢測重組蛋白His-PK 的表達。結(jié)果顯示，目的蛋白分子量57 ku，與預(yù)期相符（圖2），表明pyk 基因在大腸桿菌中獲得了表達，且表達產(chǎn)物主要存在于細胞裂解后的上清液中。

2.3 重組蛋白His-PK 兔抗血清的制備及其效價測定結(jié)果 利用純化后的重組蛋白His-PK 經(jīng)皮下多點注射免疫新西蘭白兔，四免后采血分離血清，經(jīng)間接ELISA 法檢測，兔抗血清中多克隆抗體的效價高達1∶40 000，表明重組蛋白具有良好的免疫原性，且獲得了高效價的His-PK 兔抗血清。

圖2 重組蛋白表達的SDS-PAGE 檢測結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE analysis of the recombinant protein

2.4 PK 在Mb 細胞內(nèi)分布的檢測結(jié)果 將等體積的膜蛋白和胞漿蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離后，利用western blot 檢測PK 在Mb 細胞內(nèi)的分布情況。結(jié)果顯示，重組蛋白His-PK 兔抗血清既可與Mb 菌體蛋白、膜蛋白和胞漿蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，出現(xiàn)的目的條帶大小為54 ku，也可與純化的重組蛋白His-PK 結(jié)合，出現(xiàn)的目的條帶大小57 ku（圖3）。表明PK 在Mb 的細胞膜和細胞質(zhì)中均有分布，且在膜中的分布量稍多于在細胞漿中的分布量。

圖3 重組蛋白His-PK 在Mb 中分布的檢測結(jié)果Fig.3 Determination of the distribution of His-PK in Mb

2.5 His-PK 多抗介導(dǎo)的補體殺Mb 試驗結(jié)果 利用抗體介導(dǎo)的補體殺支原體試驗分析His-PK 兔抗血清激活補體的殺Mb 作用，以Mb 兔抗血清為陽性對照，His-PK 免疫前兔血清為陰性對照，通過菌落計數(shù)，計算可得His-PK 兔抗血清介導(dǎo)的補體殺Mb 的殺菌率為43.70%，Mb 兔抗血清殺菌率為85.30%（表2），與免疫前兔血清殺菌結(jié)果均差異極顯著（p＜0.01）。表明His-PK 兔多抗具有明顯的介導(dǎo)補體殺Mb 作用，但Mb 兔抗血清因含有抗Mb 表面多種抗原的抗體成分，因而殺菌效果明顯優(yōu)于His-PK 兔抗血清。

2.6 His-PK 抗血清對Mb 粘附EBL 細胞的抑制試驗結(jié)果 利用Mb 和經(jīng)不同血清處理后的Mb 分別感染EBL 細胞，分析His-PK 兔抗血清對Mb 粘附EBL細胞的抑制作用。結(jié)果顯示，His-PK 兔抗血清對Mb 黏附EBL 細胞的抑制率為48.48%，Mb 兔抗血清對Mb 黏附EBL 細胞的抑制率為94.69%（表3），與免疫前兔血清殺菌結(jié)果均差異極顯著（p＜0.01）。表明重組蛋白His-PK 兔抗血清能夠抑制Mb 對宿主細胞的粘附，提示Mb PK 可能是一種感染相關(guān)蛋白，參與Mb 對宿主的感染，但Mb 兔抗血清的高抑制率也提示有PK 之外的其他Mb 膜表面分子參與Mb 對EBL 細胞的粘附。

表2 His-PK 兔抗血清介導(dǎo)的補體殺Mb 試驗結(jié)果Table 2 Sterilization rate of rabbit anti-His-PK serue

表3 His-PK 兔抗血清對Mb 粘附EBL 細胞的抑制試驗結(jié)果Table 3 Inhibition coefficient of His-PK rabbit antiserum on Mb adhesion to EBL cells

3 討 論

Mb 是牛的一種重要的致病性病原，其感染引起的牛支原體肺炎給我國乃至世界養(yǎng)牛業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失。研究表明，支原體的大多數(shù)酶為外向酶，其分布于細胞膜表面，在支原體的感染及免疫中發(fā)揮重要作用，如甘油醛-3-磷酸脫氫酶樣蛋白1（Mycoplsmasuis GAPDH-like protein 1，MSG1）位于豬嗜血支原體膜表面且參與其黏附紅細胞[9]；a-烯醇化酶在雞毒支原體、豬嗜血支原體和發(fā)酵支原體中均分布于膜表面且通過結(jié)合血纖溶酶原、纖連蛋白發(fā)揮其黏附作用[10-12]。何隨彬等的研究表明雞毒支原體的PK 具有良好的免疫原性，是一種潛在的保護性抗原，且該蛋白與雞毒支原體對細胞的黏附有關(guān)[8]。為研究Mb PK 相關(guān)的生物學(xué)功能，本研究利用PCR 擴增獲得Mb pyk 基因，并采用over-lap 技術(shù)將其色氨酸密碼子TGA 點突變?yōu)門GG，從而使其可有效在大腸桿菌中表達，且重組蛋白分子量為57 ku?；诖耍兓撝亟M蛋白免疫新西蘭兔制備多抗血清，并對PK 在Mb 中的分布及抗體介導(dǎo)的補體殺Mb 活性和抗體對Mb 粘附EBL 細胞的抑制活性進行了檢測，為該蛋白生物學(xué)功能的研究提供了實驗依據(jù)。

有研究顯示，雞毒支原體、滑液支原體和Mb的多種酶均在其細胞膜中有分布[8，13-17]，本研究利用His-PK 制備高效價兔抗血清，表明重組蛋白具有良好的免疫原性，是一種潛在的保護性抗原。進而采用western blot 對Mb PK 在其細胞內(nèi)的分布進行了檢測，結(jié)果表明Mb PK 在其細胞膜及細胞質(zhì)內(nèi)均有分布，且在二者的分布量相當(dāng)，提示該蛋白可能與雞毒支原體的PK 一樣，是一種與Mb 免疫和感染相關(guān)的蛋白，參與其對宿主的感染過程及宿主細胞對該病原的免疫應(yīng)答。因而，本研究采用抗體依賴的補體殺菌試驗及粘附和粘附抑制試驗來檢測Mb PK 的免疫及與感染相關(guān)的生物學(xué)功能。結(jié)果表明，His-PK 兔多克隆抗體具有明顯的介導(dǎo)補體殺Mb 的作用，其體外殺Mb 的效率可達43.70%，表明Mb PK 抗原抗體復(fù)合物可有效激活補體的殺支原體作用，從而參與宿主細胞對Mb 的免疫應(yīng)答。粘附和粘附抑制試驗結(jié)果顯示，His-PK 兔抗血清可抑制Mb 對宿主細胞的粘附，且粘附抑制率為48.48%，表明Mb PK 參與其對宿主細胞的感染，是該病原的一種感染相關(guān)因子。

綜上，本研究利用PCR 技術(shù)擴增獲得Mb pyk 基因，并在完成其原核表達的基礎(chǔ)上制備兔多抗血清，進而利用western blot 技術(shù)及抗體依賴的補體殺支原體試驗和粘附抑制試驗，證實PK在Mb細胞膜及細胞質(zhì)中均有分布，且His-PK 的多抗具有明顯的介導(dǎo)補體殺Mb作用和抑制Mb對宿主細胞的粘附作用。研究結(jié)果為深入探究Mb PK生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。