麥角甾醇與吉非替尼聯(lián)合用藥協(xié)同抑制非小細胞肺癌A549和PC-9細胞增殖

米完完，黃 挺，張夢迪，黃繩武

（1.浙江中醫(yī)藥大學藥學院，浙江 杭州 311402；2.杭州紅十字會醫(yī)院普外科，浙江 杭州 310003）

由于癌癥發(fā)病率和死亡率的持續(xù)增高，目前仍然是世界上重要的公共衛(wèi)生問題。在2018年，我國共有430萬新發(fā)腫瘤病例和290萬癌癥死亡病例，肺癌發(fā)病率最高，且死亡率也排在各種不同腫瘤類型疾病之首[1]。其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占85%[2]，傳統(tǒng)的放、化療效果一直不理想，緩解率僅約30%，大多數(shù)患者就診時，往往已處于中晚期，錯過了手術治療的最佳時期。

吉非替尼（gefitinib，GEF）是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑，一線治療EGFR突變的晚期NSCLC[3-4]。其作用機制主要通過與ATP競爭和EGFR的結合，通過絲氨酸蘇氨酸激酶（serine-threonine kinase，Akt）信號通路等途徑阻斷EGFR信號傳導通路，抑制自身磷酸化以及活化，阻斷表達EGFR的腫瘤細胞生長，阻斷磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/Akt等下游信號通路，誘導腫瘤細胞凋亡，起到抗腫瘤作用[5-7]。然而，即使是GEF治療有效者，多數(shù)患者在治療后10～14個月后都會發(fā)生不同程度的耐藥現(xiàn)象，最終將導致藥物療效降低[8-10]。2018年底，國家對進口藥GEF實行零關稅，并被納入醫(yī)保行列，此舉使GEF在NSCLC患者中廣泛使用。但面臨的問題是GEF耐藥出現(xiàn)的頻率大幅度增加。因此，增加GEF對肺癌細胞的敏感性，減小GEF使用劑量，預防與克服GEF的耐藥性顯得尤為迫切。

本實驗室前期采用真菌牛樟芝開展體外抗腫瘤作用研究，篩選出其中的麥角甾醇（ergosterol，ERG）成分對肺腺癌A549細胞具有較好的細胞增殖抑制作用。同時實驗室發(fā)現(xiàn)ERG和順鉑聯(lián)用在A549細胞上具有較好的促進細胞凋亡的作用。在體外研究的基礎上，實驗室開發(fā)了ERG聯(lián)合順鉑主動靶向雙載藥脂質體遞藥系統(tǒng)[11-13]，體內外實驗證實了其具有較好的靶向抗肺癌作用。

本研究采用2種細胞系（分別對GEF敏感的PC-9細胞和耐藥的A549細胞）進行ERG對腫瘤細胞的抑制作用研究。探討ERG與GEF聯(lián)用是否具有協(xié)同抗肺癌的作用，能否針對敏感細胞株達到增效效果，能否增加耐藥細胞株的敏感性，以及初步探討其作用機制，為進一步研究體內抗腫瘤活性提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和主要儀器

人肺癌A549細胞（中國科學院生命科學研究院細胞庫），人肺癌細胞PC-9（上海名勁生物科技有限公司）。GEF原料藥（南京安格醫(yī)藥化工有限公司，批號：170301）；ERG原料藥（批號：BCBN4049V），二甲基亞砜（批號：WXBB8079V）（美國Sigma公司）；MTT（批號：B0016K012500），0.22 μm PVDF 膜（美國Biosharp公司）；0.25%胰蛋白酶（杭州諾森德生物技術有限公司，批號：ZL101818）；優(yōu)級胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（澳洲Gemini公司，批號：A37F00H）；RPMI 1640（美國Gibco公司，批號：8118009）；青-鏈霉素溶液（批號：170907-0503）、Hoechst 33258凋亡染色試劑盒、PMSF（100 mmol·L-1，批號：090117171114）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型，批號：071417171026）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（批號：051017170702）、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（批號：111517171113）（上海碧云天生物技術有限公司）；Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（批號：7235944）、PI/RNase染色液（批號：7166582）（美國BD公司）；0.22 μm PVDF膜（美國Biosharp公司）；β肌動蛋白、EGFR、Akt小鼠抗單克隆抗體，p-Akt、p-EGFR兔多克隆抗體（美國ImmunoWay Biotechnology公司）；山羊抗小鼠熒光二抗，山羊抗兔熒光二抗（美國LI-COR公司）1300 SERIES A2生物安全柜（美國賽默飛世爾公司）；ECLIPSE TS100/100-F倒置生物顯微鏡（日本尼康公司）；Invitrogen EVOS FL細胞成像工作站、Thermo 3111型CO2培養(yǎng)箱，Thermo 905超低溫冰箱（美國賽默飛世爾公司）；Eppendorf 5427R臺式高速冷凍離心機、Eppendorf 5702臺式離心機、微量移液槍（德國Eppendorf公司）；SX-500高壓滅菌鍋（日本TOMY公司）；Cryosystem 750液氮罐（美國MVE公司）；SynErgosteroly H1MFD多功能酶標儀（美國BioTek公司）；guava easyCyte 6HT-2L微流式細胞分析儀（美國默克公司）；Mini-PROTEAN Tetra小型垂直電泳槽（美國Bio-Rad公司）；Odyssey Clx雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國LI-COR公司）。

1.2 MTT法檢測細胞存活

調整對數(shù)生長期A549/PC-9細胞懸液濃度為5×107L-1。100×g離心5 min后，吹打混勻成單細胞懸液，每孔加100 μL于96孔培養(yǎng)板，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞融合80%后加藥處理。其中各個給藥組加100 μL不同濃度不含F(xiàn)BS的藥物溶液，正常對照組加100 μL不含F(xiàn)BS培養(yǎng)液。每濃度各設5復孔，分別于加藥后第24，48和72 h后進行MTT檢測。每孔加MTT 5 g·L-1溶液20 μL，37℃孵育4 h后，采用酶標儀于492 nm處測定各孔吸光度值（A492nm），在570 nm處驗證。計算各組各濃度下的抑制率（IR），采用q值判斷ERG和GEF聯(lián)用的性質。本實驗重復3次進行。IR（%）=（對照組A492nm-實驗組A492nm）/對照組A492nm×100%。q=EAB（/EA+EB-EA×EB）。

式中EA和EB為各藥單用IR，EAB為兩藥合用IR。q＞1.15為協(xié)同作用，0.85～1.15為相加作用，＜0.85為拮抗作用。

1.3 Hoechst 33258染色檢測細胞凋亡

取對數(shù)生長期A549非小細胞肺癌細胞，實驗分為 4 組：對照組、ERG 20 μmol·L-1、GEF 20 μmol·L-1和 ERG+GEF（20+20）μmol·L-1。調整對數(shù)生長期A549細胞懸液密度為1.5×108L-1。100×g離心5 min后，吹打混勻成單細胞懸液，每孔加2 mL含藥培養(yǎng)基于6孔培養(yǎng)板，每藥3復孔。于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞融合80%后加藥處理。48 h后PBS清洗3次，加4%多聚甲醛室溫固定20 min。吸出4%的多聚甲醛后用PBS小心清洗3次，加Hoechst 33258染液，37℃染色30 min。棄染色液后用PBS清洗3次，于熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)。本實驗重復3次進行。

取對數(shù)生長期PC-9非小細胞肺癌細胞，實驗分為4組：對照組、ERG 40 μmol·L-1、GEF 5 μmol·L-1和 ERG+GEF（40+5）μmol·L-1，細胞懸液密度為2×108L-1，其他操作同上。

1.4 流式細胞術測定細胞凋亡率

采用AnnexinⅤ-PI雙染流式細胞術檢測各組凋亡情況。將對數(shù)生長期的A549細胞調整密度為1.5×108L-1。100×g離心5 min后，吹打混勻成單細胞懸液，每孔加2 mL給藥培養(yǎng)基于6孔培養(yǎng)板，設置每個藥每濃度3復孔，ERG（10，20，40）μmol·L-1，GEF（10，20，40）μmol·L-1，ERG+GEF（10+10，20+20，40+40）μmol·L-1。于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞融合80%后加藥處理48 h后收集上清及細胞，PBS洗滌3次，100×g離心5 min，用100 μL 1×流式緩沖液重懸，每個給藥孔加 5 μL FITC與5 μL PI熒光染料，于室溫下黑暗處孵育15 min后，每孔繼續(xù)加400 μL 1×緩沖液，用渦旋混合器低轉速下混合均勻，過400目篩網(wǎng)后，1 h內采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

取對數(shù)生長期PC-9細胞，設每藥每濃度3復孔，ERG（20，40，80）μmol·L-1，GEF（2.5，5，10）μmol·L-1，ERG+GEF（20+2.5，40+5，80+10）μmol·L-1。其他操作同上。

1.5 流式細胞術測定細胞周期

將對數(shù)生長期的A549細胞調整為1.5×108L-1，接種于6孔培養(yǎng)板內，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞融合80%后加藥處理，設ERG 40 μmol·L-1組、GEF 40 μmol·L-1組和 ERG+GEF（40+40）μmol·L-1組。藥物作用48 h后，收集上清及細胞，100×g離心10 min，PBS洗滌1次后，用75%冰乙醇固定過夜，離心棄乙醇，用PBS洗滌2次。棄PBS，每個樣本加0.5 mL PI染色液室溫避光染色15 min，置流式細胞儀上測定各周期細胞比例。本實驗重復3次。

取對數(shù)生長期PC-9細胞，設ERG 40 μmol·L-1、GEF 5 μmol·L-1和ERG+GEF（40+5）μmol·L-1，每濃度3復孔。其他操作同上。

1.6 Western 印跡法檢測 Akt，p-Akt，EGFR 和p-EGFR蛋白表達

將對數(shù)生長期的A549/PC-9細胞密度調整為2×108L-1接種于6孔培養(yǎng)板內，A549細胞分別設GEF 20 μmol·L-1、ERG 20 μmol·L-1、ERG+GEF（20+20）μmol·L-1組和對照組，PC-9細胞分別設GEF 5 μmol·L-1、ERG 40 μmol·L-1、ERG+GEF（40+5）μmol·L-1組和對照組加藥處理48 h后提取細胞總蛋白，并用BCA試劑盒測定其濃度。調整各組總蛋白濃度相同后將蛋白質樣品與5×上樣緩沖液混合后于100℃中煮沸5 min，加相應濃度的SDS-PAGE膠中電泳至溴酚藍距離膠底部1 cm處即停止電泳，然后轉至0.22 μm PVDF膜上，Western封閉液封閉1 h，稍洗后分別加適量一抗Akt（1∶1000），p-Akt（1∶500），EGFR（1∶1000），p-EGFR（1∶500），β肌動蛋白（1∶4000）于4℃下孵育過夜，Western洗滌液漂洗3次，每次5 min，加對應來源的熒光二抗常溫孵育2 h，Western洗滌液洗膜3次，每次5 min，采用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃膜，采用Image J軟件對蛋白印跡條帶進行積分吸光度（integrated absorbance，IA）分析。待測蛋白相對表達水平用目標蛋白IA值和β肌動蛋白蛋白IA之比表示。本實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學分析

實驗結果數(shù)據(jù)均用±s表示，實驗重復3次。采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理，采用單因素方差分析法，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 麥角甾醇與吉非替尼聯(lián)合用藥對人肺癌A549和PC-9細胞的增殖抑制作用

人肺癌A549細胞增殖抑制實驗結果（圖1）顯示，在 24，48 和 72 h，GEF 5～160 μmol·L-1和ERG 5～160 μmol·L-1均能抑制A549細胞的生長，且呈濃度依賴性（ERG：r=0.898，r=0.924，r=0.935；GEF：r=0.988，r=0.884，r=0.793）。與ERG和GEF單藥各濃度組相比，兩藥聯(lián)用相應濃度組對A549細胞的增殖抑制率提高（P＜0.01）。作用24和48 h時，ERG+GEF聯(lián)用濃度分別為（5+5）μmol·L-1，（10+10）μmol·L-1，（20+20）μmol·L-1時，兩藥聯(lián)用具有協(xié)同作用；作用72 h時，兩藥聯(lián)用ERG+GEF（5+5）μmol·L-1具有協(xié)同作用。ERG+GEF（20+20）μmol·L-1是兩藥具有協(xié)同作用的最大濃度，濃度加大，兩藥僅僅只有相加作用（圖1D）。因此，后續(xù) A549 細胞實驗以 ERG 20 μmol·L-1和 GEF 20 μmol·L-1作為中間濃度進行。

人肺癌PC-9細胞增殖抑制實驗結果（圖2）顯示，在24，48和72 h時，GEF 0.625～20 μmol·L-1和ERG 5～160 μmol·L-1均能抑制PC-9 細胞的生長，該抑制作用呈濃度依賴性（ERG：r=0.925，r=0.978，r=0.869；GEF：r=0.872，r=0.859，r=1.0）。與各單用藥組相比，ERG+GEF聯(lián)用各組PC-9細胞的增殖抑制率均提高（P＜0.01）。作用24 h與48 h時，ERG和GEF聯(lián)用濃度分別為（5+0.625）μmol·L-1，（10+1.25）μmol·L-1，（20+2.5）μmol·L-1，（40+5）μmol·L-1時，兩藥聯(lián)用具有協(xié)同作用，ERG+GEF（40+5）μmol·L-1時具有協(xié)同作用的最大濃度，濃度加大，兩藥僅僅只有相加作用（圖2D）。因此，后續(xù)PC-9細胞實驗以ERG+GEF（40+5）μmol·L-1作為中間濃度進行。

Fig.1 Effect of ergosterol（ERG）combined with gefitinib（GEF）on proliferation of A549 cells and their synergy index.Human lung cancer cells A549 were treated with ERG 5-160 μmol·L-1（A），GEF 5-160 μmol·L-1（B）or ERG+GEF combination（C）for 24，48 or 72 h，respectively.D：synergy index of ERG+GEF combination at 24，48 or 72 h.±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with corresponding concentration of GEF group；##P＜0.01，compared with corresponding concentration of ERG group.

Fig.2 Effect of ERG combined with GEF on proliferation of PC-9 cells and their synergy index.PC-9 cells were treated with ERG 0.625-20 μmol·L-1（A），GEF 5-160 μmol·L-1（B）or ERG+GEF combination（C）for 24，48 or 72 h，respectively.D：synergy index of ERG+GEF combination at 24，48 or 72 h.±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with corresponding concentration of GEF group；##P＜0.01，compared with corresponding concentration of ERG group.

2.2 麥角甾醇與吉非替尼聯(lián)合用藥對人肺癌A549，PC-9細胞核形態(tài)的影響

Fig.3 Effect of ERG combined with GEF on A549 and PC-9 cells on nuclear morphology by Hoechst 33258 staining.Cells were treated with ERG and GEF according to groups for 48 h.Arrows show the changes of nuclear morphology.

Hoechst 33258染色結果（圖3）顯示，正常對照組的A549和PC-9細胞發(fā)出均勻的藍色熒光，細胞核形態(tài)呈圓形或橢圓形，大小均一，無明顯形態(tài)學改變；ERG組與GEF組細胞出現(xiàn)核分葉與核碎裂凋亡樣特征；兩藥聯(lián)用組細胞核具有明顯的核形態(tài)變化，核分葉與核碎裂，凋亡樣小體，細胞核大小不一等凋亡樣特征（圖中箭頭指向處）。

2.3 麥角甾醇與吉非替尼聯(lián)用對細胞凋亡和細胞周期的影響

2.3.1 麥角甾醇與吉非替尼聯(lián)用對細胞凋亡的影響

Fig.4 Effect of ERG combined with GEF on A549 cell apoptosis by flow cytometry.A549 cell were treated with ERG 10，20 and 40 μmol·L-1，GEF 10，20 and 40 μmol·L-1，and ERG+GEF（10+10），（20+20），（40+40）μmol·L-1respectively for 48 h.B was A549 cell apoptotic rate in A.±s，n=3，＊＊P＜0.01，compared with control group；##P＜0.01，compared with corresponding concentration of ERG group；△△P＜0.01，compared with corresponding concentration of GEF group.

A549細胞凋亡的流式結果見圖4。與對照組相比，ERG 20，40 μmol·L-1及GEF各濃度的凋亡率升高（P＜0.01）。與相應濃度GEF，ERG單藥組相比，ERG+GEF聯(lián)用（10+10）μmol·L-1和（40+40）μmol·L-1組細胞凋亡率升高（P＜0.01）。

PC-9細胞凋亡的流式結果（圖5）顯示。與對照組相比，ERG各濃度組及GEF各濃度組的凋亡率顯著升高（P＜0.01）。與GEF 5，10 μmol·L-1和ERG 40，80 μmol·L-1單藥組相比，ERG+GEF（40+5）μmol·L-1和（80+10）μmol·L-1組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）。

2.3.2 麥角甾醇與吉非替尼聯(lián)用對細胞周期的影響

A549細胞周期的流式結果見圖6。與對照組G0/G1期細胞比例（56.65±0.13）%相比，ERG 20 μmol·L-1組（58.97±0.94）%及GEF 20 μmol·L-1（72.60±0.81）%單藥組G0/G1期細胞比例均升高（P＜0.05，P＜0.01），表明對A549細胞產生了明顯的G0/G1期阻滯。與對照組G2/M期比例（29.63±2.15）%相比，ERG 20 μmol·L-1組（32.05±2.27）%細胞比例顯著升高（P＜0.01），表明ERG對A549細胞產生明顯的G2/M阻滯。與ERG組相比，兩藥聯(lián)用組G0/G1期細胞比例顯著升高（P＜0.01），G2/M期細胞比例無差異，S期細胞比例顯著降低（P＜0.05），與GEF組相比，兩藥聯(lián)用組G0/G1期細胞比例顯著降低（P＜0.01），G2/M期細胞比例顯著升高（P＜0.01），S期細胞比例顯著升高（P＜0.05）。表明兩藥聯(lián)用改變了A549細胞G0/G1，G2/M，S期的細胞比例，分別為（65.16±1.55）%，（8.74±0.92）%，（26.10±1.11）%。

PC-9細胞周期的流式結果（圖7）顯示，與對照組S期（19.13±1.20）%及G2/M期（9.64±1.25）%細胞比例相比，ERG 40 μmol·L-1組 S 期（26.93±2.02）%及 G2/M期比例為（13.58±1.80）%細胞比例均顯著升高（P＜0.01），說明ERG對PC-9細胞周期產生明顯的S期及G2/M期阻滯。而GEF 5 μmol·L-1組 G0/G1期細胞比例（78.35±1.58）%比對照組（71.23±0.44）%顯著升高（P＜0.01），說明 GEF 5 μmol·L-1可阻滯細胞于 G0/G1期。與 GEF 組相比，兩藥聯(lián)用時，PC-9細胞G0/G1期細胞比例（78.91±1.86）%，S期細胞比例為（13.18±3.16）%，G2/M期細胞比例（8.74±0.92）%無差異。表明兩藥聯(lián)用未使PC-9細胞周期發(fā)生改變。

Fig.5 Effect of ERG combined with GEF on PC-9 cell apoptosis by flow cytometry.PC-9 cell were treated with ERG 20，40 and 80 μmol·L-1，GEF 2.5，5 and 10 μmol·L-1and ERG+GEF（20+2.5），（40+5），（80+10）μmol·L-1respectively for 48 h.B was PC-9 cell apoptotic rate in A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with control group；##P＜0.01，compared with corresponding concentration of ERG group；△△P＜0.01，compared with corresponding concentration of GEF group.

Fig.6 Effect of ERG combined with GEF on A549 cell cycle by flow cytometry.See Fig.3 for the cell treatment.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the control group.##P＜0.01，compared with ERG group；△P＜0.05，△△P＜0.01，compared with GEF group.

Fig.7 Effect of ERG combined with GEF on PC-9 cell cycle distribution by flow cytometry.See Fig.3 for the cell treatment.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

2.4 麥角甾醇與吉非替尼聯(lián)用對Akt，p-Akt，EGFR和p-EGFR蛋白表達的影響

Western印跡結果（圖8）顯示，在A549細胞中，與對照組相比，GEF 20 μmol·L-1組的p-Akt/Akt和p-EGFR/EGFR蛋白表達水平降低（P＜0.01，P＜0.05）；ERG 20 μmol·L-1組的p-Akt/Akt和p-EGFR/EGFR蛋白表達水平無明顯變化；與GEF單藥相比，兩藥聯(lián)用組（20+20 μmol·L-1）的p-EGFR/EGFR蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）。表明ERG和GEF聯(lián)用能更好抑制EGFR相關信號通路相關蛋白的表達。

Fig.8 Effect of ERG combined with GEF on protein expression of p-Akt/Akt and p-EGFR/EGFR in A549 and PC-9 cells by Western blotting.See Fig.6 and 7 for the cell treatment.A2-D2 were semi-quantitative results of A1-D1，respectively.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with ERG group；△P＜0.05，△△P＜0.01，compared with GEF group.

在PC-9細胞中，與對照組相比，GEF 5 μmol·L-1組的p-Akt/Akt和p-EGFR/EGFR蛋白表達水平均降低（P＜0.01），ERG 40 μmol·L-1組的p-Akt/Akt與p-EGFR/EGFR蛋白表達水平無顯著差異；與GEF 5 μmol·L-1單藥組相比，兩藥聯(lián)用后 p-Akt/Akt和p-EGFR/EGFR蛋白表達顯著下調（P＜0.05，P＜0.01）。表明ERG和GEF聯(lián)用能更好抑制EGFR和Akt信號通路相關蛋白的表達。

3 討論

本研究結果表明，對于GEF耐藥細胞A549細胞，在GEF 5～160 μmol·L-1和ERG 5～160 μmol·L-1均能抑制A549細胞的生長，且呈濃度依賴性，在一定濃度下具有協(xié)同作用。對于GEF敏感細胞PC-9細胞，在 GEF 0.625～20 μmol·L-1和 ERG 5～160 μmol·L-1均能抑制PC-9細胞的生長，且呈濃度依賴性，在一定濃度下具有協(xié)同作用。Hoechst 33258染色結果顯示，兩藥聯(lián)用細胞凋亡樣特征明顯。采用流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，ERG與GEF聯(lián)用的凋亡率明顯高于ERG和GEF單用。且隨著藥物濃度的增加，細胞凋亡率呈現(xiàn)增加的趨勢，有個別組由于兩藥聯(lián)用組凋亡率標準差較大，未呈現(xiàn)顯著差異。在考察細胞周期時發(fā)現(xiàn)，對于A549細胞，兩藥聯(lián)用改變了G0/G1，G2/M和S期細胞比例，主要將細胞阻滯在G0/G1期。對于PC-9細胞，兩藥聯(lián)用未改變G0/G1，G2/M和S期細胞比例。表明在不同肺癌細胞系，ERG與GEF聯(lián)用抑制肺癌細胞凋亡的機制不同。在A549細胞中，ERG和GEF聯(lián)用能更好抑制EGFR相關信號通路的表達。在PC-9細胞中，ERG和GEF聯(lián)用能更好抑制EGFR，Akt相關信號通路的表達。

本研究的目的旨在探討ERG與GEF聯(lián)用能否針對敏感細胞株達到增效、增敏的效果，能否增加耐藥細胞株的敏感性，將藥物聯(lián)合使用，如何能夠發(fā)揮更大的抗肺腫瘤作用，從而為解決臨床GEF耐藥性提供思路。在針對其他課題的聯(lián)合用藥試驗中[11]，出于增效減毒的目的，將ERG濃度固定，增加化療藥的濃度進行細胞增殖抑制試驗，結果表明ERG與其他化療藥聯(lián)用，起到了增效減毒的作用。在進行本實驗時，考慮到是否可以采用藥物聯(lián)用的方式，達到最大的抗肺癌療效。因此，同時增加ERG與GEF的濃度來進行細胞增殖抑制試驗。而聯(lián)合治療可通過調節(jié)不同的信號轉導途徑來改善治療效果。同時，與單藥治療相比，這種策略可以減少藥物的不良反應，增加細胞對藥物的敏感性[14-15]。結果顯示，ERG，GEF組以及兩藥聯(lián)用組對A549、PC-9細胞的增殖均有一定的抑制作用，且呈現(xiàn)一定的濃度與時間依賴效應。在這一部分實驗中，A549細胞中ERG 10 μmol·L-1與GEF 10 μmol·L-1聯(lián)用，協(xié)同作用優(yōu)于ERG 20 μmol·L-1+GEF 20 μmol·L-1。根據(jù)MTT實驗結果，后續(xù)實驗采用了ERG 10 μmol·L-1+GEF 10 μmol·L-1進行，但凋亡實驗結果不盡人意。MTT實驗主要針對細胞抑制，凋亡實驗主要考察細胞的凋亡，實驗目的不同。出于該考慮，后續(xù)進行了 ERG 10 μmol·L-1+GEF 10 μmol·L-1和 ERG 20 μmol·L-1+GEF 20 μmol·L-12種濃度預實驗，在凋亡染色試驗和Western印跡實驗中，均發(fā)現(xiàn)ERG 20 μmol·L-1+GEF 20 μmol·L-1（濃度相對高），實驗結果有顯著性差異，因此最終選擇該濃度進行后續(xù)實驗。

采用流式細胞儀檢測細胞凋亡時發(fā)現(xiàn)，ERG和GEF聯(lián)用在PC-9細胞上的凋亡率要遠遠高于A549細胞中，可能是因為GEF對PC-9細胞敏感，對A549細胞不敏感，ERG導致細胞死亡的主要途徑可能不是通過凋亡途徑發(fā)生的，而是通過自噬等其他途徑發(fā)生的。細胞周期實驗中，ERG組相對于對照組，能引起S期細胞比例極顯著增加，ERG+GEF組能導致2種細胞的G0/G1期阻滯抑制其增殖，從而抑制腫瘤進一步的發(fā)展惡化。

EGFR家族成員在肺癌的發(fā)展過程起重要的作用，其在40%～80%的非小細胞肺癌中過度表達，與腫瘤的生長、增殖、運動、黏附、侵襲、凋亡和轉移等密切相關。EGFR是HER/ErbB家族中的一個跨膜蛋白，與胞外因子結合后能通過一系列的下游信號通 路 ，如 Ras/Raf/MAPK[16]，PI3K/Akt[17]和 Jak/STAT3[18]等，影響下游蛋白c-Fos，c-Jun，Bad，胱天蛋白酶9和叉頭轉錄因子等，從而達到促進細胞分裂、增加細胞增殖、轉化、轉移的作用。GEF的作用機制就是與ATP競爭EGFR上的結合位點，從而達到抑制磷酸化、阻斷信號通路的效果[19]。因此，在Western印跡實驗中，選擇了EGFR及下游相關信號通路Akt的表達。結果ERG+GEF組的p-Akt/Akt水平和p-EGFR/EGFR水平均極顯著降低，表明兩藥聯(lián)用能在一定程度上抑制EGFR信號通路的表達。而PI3K/Akt/mTOR信號通路是EGFR信號通路的下游信號通路，因此推測是否兩藥聯(lián)用能在一定程度上抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的表達，從而使腫瘤細胞產生凋亡。

本研究的不足之處在于ERG與GEF聯(lián)用，對GEF敏感的PC-9細胞能夠起到增效、增敏作用，對GEF耐藥的A549細胞能增加其一定的敏感性，但對于機制研究只進行了初步探討。近年來許多研究表明，PI3K/Akt/mTOR信號通路在腫瘤細胞中發(fā)揮重要的作用。因此，有關ERG與GEF聯(lián)用抗腫瘤更全面的分子機制有待進一步研究。