玉米耐深播主效QTL qMES20-10 的精細(xì)定位及差異表達(dá)基因分析

任蒙蒙 張紅偉 王建華 王國(guó)英 鄭 軍,*

1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京100081; 2 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 北京100193

干旱脅迫嚴(yán)重影響玉米生長(zhǎng)發(fā)育, 是造成玉米減產(chǎn)的最重要非生物脅迫因素[1]。我國(guó)有大量玉米種植在干旱半干旱地區(qū), 通過(guò)改善栽培措施如增加播種深度, 能夠減輕干旱脅迫對(duì)玉米生長(zhǎng)發(fā)育的影響[2]。對(duì)于普通的玉米品種, 增加播種深度會(huì)導(dǎo)致出苗率下降, 造成苗期缺苗而影響產(chǎn)量[3]。具有耐深播特性的玉米材料相對(duì)于普通玉米材料, 在深播條件下具有更長(zhǎng)的中胚軸和更強(qiáng)的頂土能力, 能適應(yīng)較深的播種條件, 其根系能從更深層的土壤吸收水分,有助于玉米應(yīng)對(duì)干旱脅迫。因此, 研究玉米耐深播特性的遺傳機(jī)制對(duì)于改良普通雜交種的耐深播特性具有重要的指導(dǎo)意義[4]。

目前對(duì)作物耐深播的研究主要集中在大麥、小麥和水稻等作物[5-7]。在深播條件下, 不同的作物通過(guò)延伸不同的組織將胚芽頂出土層。水稻、燕麥等作物主要延伸中胚軸和第一節(jié)間[8], 大麥、小麥等作物延伸其胚芽鞘和第一節(jié)間[9-10], 而玉米和高粱則主要延伸其中胚軸[11-12]。在水稻直播技術(shù)的推廣中,需要培育耐深播的水稻品種以提高出苗率。Lu 等[13]用469 份水稻自交系進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析, 以中胚軸和根的長(zhǎng)度作為表型指標(biāo), 挖掘了23 個(gè)與耐深播相關(guān)的位點(diǎn)。Wu 等[14]分別在水培和5 cm 沙土中對(duì)270 份水稻自交系進(jìn)行了深播表型鑒定, 并用重測(cè)序得到的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析, 共挖掘出16 個(gè)與耐深播相關(guān)的位點(diǎn)。Zhao 等[15]對(duì)621 個(gè)水稻品種進(jìn)行深播表型分析, 發(fā)現(xiàn)中胚軸伸長(zhǎng)受深層土壤覆蓋誘導(dǎo), 對(duì)田間耐深播能力具有重要意義, 同時(shí)利用關(guān)聯(lián)分析的方法鑒定出了13 個(gè)耐深播相關(guān)的QTL, 并對(duì)其中兩個(gè)主效基因OsML1和OsML2進(jìn)行了驗(yàn)證。在玉米耐深播的研究中, 趙光武等[16]對(duì)12 個(gè)玉米自交系耐深播相關(guān)性狀的分析表明, 中胚軸伸長(zhǎng)是玉米種子頂土出苗的主要?jiǎng)恿? 深播條件下的出苗率與玉米的中胚軸長(zhǎng)度呈正相關(guān), 因此也可以用深播條件下的中胚軸長(zhǎng)度來(lái)評(píng)價(jià)玉米的耐深播能力。Liu 等[17]用玉米優(yōu)良自交系B73 和Mo17組配的280 份DH 系(IBM Syn10)進(jìn)行了深播發(fā)芽能力的QTL 定位, 共發(fā)現(xiàn)了32 個(gè)相關(guān)的QTL, 并在這些QTL 的定位區(qū)間內(nèi)鑒別出6 個(gè)與深播發(fā)芽能力相關(guān)的候選基因。上述研究表明, 作物耐深播能力是由多個(gè)位點(diǎn)控制的數(shù)量性狀, 需要通過(guò)QTL 定位的方法挖掘相關(guān)基因。

目前, 借助分子標(biāo)記輔助選擇, 利用高代回交群體構(gòu)建近等基因系, 是精細(xì)定位QTL 并最終獲得候選基因的常用方法[18]。近等基因系遺傳背景相似,只在包含QTL 區(qū)段的染色體片段上存在差異, 在控制環(huán)境的情況下, 可認(rèn)為表型的差異只是由于該染色體片段的不同引起, 從而能精確定位在該區(qū)段上的QTL。另外, 利用RNA-Seq 的方法, 分析近等基因系中基因差異表達(dá)的情況, 結(jié)合精細(xì)定位的結(jié)果,也是預(yù)測(cè)候選基因并對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行遺傳解析的有效方法[19]。

本研究所用材料為3681-4 和X178, 其中3681-4為本實(shí)驗(yàn)室鑒定的一個(gè)具有耐深播特性的玉米自交系[20], X178 為玉米優(yōu)良雜交種農(nóng)大108 的母本。實(shí)驗(yàn)室前期已通過(guò)構(gòu)建F2：3家系進(jìn)行了耐深播性狀的初定位, 在玉米10 號(hào)染色體長(zhǎng)臂上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)主效QTLqMES20-10, 并將其定位到了 SSR 標(biāo)記umc1506 與bnlg1028 之間大約5.24 Mb 的區(qū)間[21]。在此基礎(chǔ)上, 構(gòu)建了高代回交群體, 對(duì)qMES20-10進(jìn)一步精細(xì)定位, 并分析近等基因系中差異表達(dá)基因的情況, 為該位點(diǎn)候選基因的挖掘提供了材料和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

親本材料為玉米自交系3681-4 和X178 在20 cm播深下的中胚軸長(zhǎng)度(簡(jiǎn)稱為MES20)有極顯著差異(圖1-C)。實(shí)驗(yàn)室前期工作用X178 作為輪回親本, 通過(guò) umc1506 與 bnlg1028 兩個(gè)分子標(biāo)記篩選保留qMES20-10的雜合區(qū)段, 并對(duì)其他非目標(biāo)QTL 進(jìn)行背景控制, 構(gòu)建了170 份BC3F3：4家系。

在此基礎(chǔ)上利用分子標(biāo)記輔助選擇, 2015年冬季在海南三亞種植了目標(biāo)區(qū)段為雜合基因型的BC3F3群體2600 株, 通過(guò)初定位區(qū)間的兩端標(biāo)記umc1506 和bnlg1028, 篩選出243 個(gè)交換單株, 將這些交換單株與X178 回交獲得BC4F1群體。2016年夏季在北京順義和2016年冬季在海南將BC4F1群體自交獲得大約200 份BC4F2：3家系。

1.2 表型鑒定方法

采用20 cm 播種深度鑒定表型。首先在一個(gè)塑料盒(長(zhǎng)60 cm, 寬40 cm, 高16 cm)中裝上6 根PVC管(直徑20 cm, 高24 cm), 在PVC 管的底部平鋪4 cm 厚混勻的蛭石(蛭石與水的質(zhì)量比為1∶1), 均勻點(diǎn)上種子后, 用蛭石填滿PVC 管。然后將盒子密封, 黑暗處理。環(huán)境溫度25℃, 相對(duì)濕度60% (圖1-A)。播種14 d 后, 將幼苗取出, 用直尺測(cè)量幼苗的中胚軸長(zhǎng)度(圖1-B)。從BC3F3：4每個(gè)家系中隨機(jī)選擇30粒種子種到一個(gè)PVC 管中鑒定表型, 用表型的平均值代表該家系的表型值。對(duì)于從BC4F2：3家系中選取的用作后代測(cè)驗(yàn)的交換單株上的穗子, 每個(gè)單穗按照上述方法種植180 粒種子(6 個(gè)PVC 管)作為分離群體, 進(jìn)行基因型和表型鑒定。

圖1 表型鑒定方法和親本材料表型Fig. 1 Phenotyping method and phenotype of the two parents

1.3 基因型鑒定方法

取玉米苗期幼嫩葉片, 用CTAB 法提取基因組DNA[23], 用于基因型鑒定。BC3F3：4家系全基因組的基因型鑒定采用了北京康普森生物技術(shù)有限公司定制的Maize iSlect6K 芯片, 共5179 個(gè)SNP 標(biāo)記, 均勻覆蓋了玉米全基因組[22]。精細(xì)定位群體的基因型鑒定采用SSR 分子標(biāo)記或InDel 標(biāo)記, 所用的SSR分子標(biāo)記, 來(lái)源于MaizeGDB (http：//www.maizegdb.org/), InDel 標(biāo)記根據(jù)B73 和Mo17 基因組序列比對(duì)得到的InDel 位點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)[24]。引物由上海生工生物工程有限公司合成, 引物信息如表1。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 QTL 確證和精細(xì)定位

為了驗(yàn)證qMES20-10的真實(shí)性, 對(duì) 170 個(gè)BC3F3：4家系進(jìn)行了表型和基因型鑒定, 表型2 次重復(fù), 基因型用umc1506 和bnlg1028 兩對(duì)標(biāo)記檢測(cè),并用方差分析檢測(cè)不同基因型家系之間的表型是否有差異。利用覆蓋全基因組的芯片進(jìn)一步檢測(cè)了這些 BC3F3：4家 系 的 基 因 型, 用 QTL 定 位軟 件IciMapping v4.0[25]對(duì)這些家系進(jìn)行了全基因組的QTL 檢測(cè), 先用bin 模塊去除冗余標(biāo)記和偏分離標(biāo)記, 再采用完備區(qū)間作圖法(ICIM)進(jìn)行QTL 檢測(cè)。表型值為兩次測(cè)量結(jié)果的平均值。實(shí)驗(yàn)群體設(shè)置為F2, LOD 閾值設(shè)置為2.5。方差分析采用R 語(yǔ)言中的anova()函數(shù)。

精細(xì)定位QTL 采用兩種策略。一是AB-QTL[26]分析法, 從BC4F2：3群體中直接鑒定交換單株的表型,通過(guò)t測(cè)驗(yàn)比較交換單株與受體親本之間的表型是否有差異, 從而判斷QTL 的位置; 二是后代測(cè)驗(yàn)法[27],從BC4F2：3群體選取交換單株的穗子作為分離群體,單株鑒定基因型和表型, 比較分別帶有3681-4 和X178 純合基因型材料的表型是否有差異, 從而確定目標(biāo)QTL 是否位于雜合區(qū)段。t測(cè)驗(yàn)采用SAS9.2 中的Proc TTEST。

1.5 RNA-Seq 和差異表達(dá)分析

從BC3F3：4家系中挑選目標(biāo)QTL 區(qū)段分別為X178 純合(NILX178)和3681-4 純合(NIL3681-4)基因型的材料各3 份作為近等基因系, 再加上2 個(gè)親本材料X178 和3681-4 (各3 次重復(fù)), 共8 份材料進(jìn)行RNA-Seq 分析。每份材料按照上述表型鑒定的方法播種, 取幼苗中胚軸部分, 用 TRIol 法提取總RNA[28]。RNA-Seq 由北京貝瑞和康生物科技有限公司完成。

差異表達(dá)分析先用TopHat2[29]將測(cè)序得到的原始 Reads 錨定到 B73 參考基因組上, 再使用Cufflinks 軟件的Cuffdiff[30]組件, 通過(guò)Mapped Reads 在基因上的位置信息, 對(duì)轉(zhuǎn)錄本和基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量。采用FPKM (fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)[31]作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平的指標(biāo)。用DESeq2[32]進(jìn)行樣品組間的差異表達(dá)分析, 獲得兩個(gè)樣品之間的差異表達(dá)基因集。在差異表達(dá)基因檢測(cè)過(guò)程中, 將Fold Change≥2 且FDR ＜ 0.01 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。其中,差異倍數(shù)(fold change)表示兩樣品(組)間表達(dá)量的比值。錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)是通過(guò)對(duì)差異顯著性P值(P-value)校正得到的。基因富集分析使用在線分析軟件 AgriGo (http：//bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/)[33]。

2 結(jié)果與分析

2.1 用BC3F3:4 家系確證qMES20-10

在170 個(gè)BC3F3：4家系中,qMES20-10的區(qū)間內(nèi)X178 純合、雜合、3681-4 純合3 種基因型的家系分別有34、65、35 個(gè), 符合1∶2∶1 的分離比(χ2測(cè)驗(yàn)：P= 0.935)。剩余的36 個(gè)家系在umc1506 與bnlg1028兩個(gè)標(biāo)記之間發(fā)生交換, 重組率為21.2%。3 種基因型材料的中胚軸長(zhǎng)度平均值分別為7.62、8.52、9.87 cm。方差分析表明三者之間有極顯著差異(圖2-A)。

圖2 耐深播主效QTL qMES20-10 確證Fig. 2 Validation of the major QTL qMES20-10 for deep-seeding tolerance

為了排除背景對(duì)后續(xù)定位的干擾, 進(jìn)一步用玉米6 K 芯片鑒定了上述170 份BC3F3：4家系的基因型。從6K 芯片的5179 個(gè)SNP 標(biāo)記中, 共篩選出1485個(gè)多態(tài)性SNP 位點(diǎn), 覆蓋了玉米的全基因組。用2次表型的平均值進(jìn)行全基因組的QTL 檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)只有10 號(hào)染色體上有一個(gè)主效QTL (圖2-B), 位于SNP 標(biāo)記PZE-110074955 和chr10.S_132532921 之間。2 個(gè)標(biāo)記在B73 參考基因組(V2)的物理位置與該QTL 的初定位區(qū)間基本一致。在BC3F3：4家系中,該QTL 的LOD 值為11.36, 可解釋的表型變異為38.66%。該位點(diǎn)的加性效應(yīng)為0.82 cm, 顯性效應(yīng)為0.03 cm, 為典型的加性基因。通過(guò)以上兩個(gè)實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步確證了qMES20-10的真實(shí)性。

2.2 qMES20-10 的精細(xì)定位

利用組配的200 份BC4F2：3家系對(duì)qMES20-10進(jìn)行精細(xì)定位, 通過(guò)初定位區(qū)間內(nèi)的4 個(gè)分子標(biāo)記DST_InD7、DST_InD105、DST_InD13、DST_InD25將這些BC4F2：3家系分成9 種重組類型, 分別對(duì)不同重組類型的家系進(jìn)行表型鑒定, 檢驗(yàn)每種重組類型的表型與受體親本X178 是否有顯著差異。如圖3所示, 在DST_InD7 和DST_InD105 兩個(gè)標(biāo)記區(qū)段內(nèi)含有3681-4 染色體片段的重組類型(R1-R4), 中胚軸長(zhǎng)度顯著高于受體親本, 而含有X178 片段的重組類型(R5-R9)與受體親本無(wú)顯著差異。由此可將目標(biāo)QTL 定位于DST_InD7 和DST_InD105 兩個(gè)標(biāo)記之間。這2 個(gè)標(biāo)記在B73 參考基因組(V2)中的物理位置為10 號(hào)染色體133.3～136.0 Mb。

在上述BC4F2：3家系中, 結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇,選取在不同位置發(fā)生交換的交換單株, 利用其穗子作為分離群體進(jìn)行后代測(cè)驗(yàn)。如圖3 所示, 發(fā)現(xiàn)當(dāng)DST_InD7 和DST_InD105兩個(gè)標(biāo)記之間的染色體片段為雜合狀態(tài)時(shí)(R1, R5-R7), 3681-4 等位基因型植株的中胚軸長(zhǎng)度顯著大于X178 基因型的植株, 而當(dāng)染色體其他位置的片段為雜合狀態(tài)時(shí)(R2-R4),二者無(wú)顯著差異。由此同樣將目標(biāo) QTL 定位于DST_InD7 和DST_InD105 之間, 進(jìn)一步驗(yàn)證了上述精細(xì)定位的結(jié)果(圖4)。

圖3 耐深播主效位點(diǎn)qMES20-10 的精細(xì)定位Fig. 3 Fine mapping of the major QTL qMES20-10 for deep-seeding tolerance

2.3 近等基因系中差異表達(dá)基因分析

為了從轉(zhuǎn)錄組水平上解釋兩親本之間以及近等基因系材料之間中胚軸長(zhǎng)度的差異, 進(jìn)而挖掘候選基因, 對(duì)近等基因系和親本材料進(jìn)行了RNA-Seq 測(cè)序。各樣品的Reads 與參考基因組的比對(duì)效率從75.28%到80.45%不等, 大部分的Reads 都能比對(duì)到參考基因組上的唯一位置, 這部分Reads 所占比例從66.71%到76.59%不等。在兩親本X178 和3681-4之間共檢測(cè)到8800 個(gè)差異表達(dá)基因, 接近玉米基因總量的1/4, 且這些基因在10 條染色體上大體分布均勻, 說(shuō)明兩個(gè)親本在基因表達(dá)水平上的差異很大。而在BC3F3：4家系構(gòu)建的近等基因系中只檢測(cè)到115 個(gè)差異表達(dá)基因, 這些基因絕大部分分布在10號(hào)染色體, 表明經(jīng)過(guò)連續(xù)的回交和自交后, 兩個(gè)近等基因系之間基因表達(dá)的差異大大減少, 可能只在少數(shù)的染色體片段上有所差別。兩組RNA-Seq 數(shù)據(jù)共同檢測(cè)到的差異基因共73 個(gè)(圖5)。

圖4 后代測(cè)驗(yàn)驗(yàn)證定位區(qū)間Fig. 4 Validation of the mapping region using progeny test

圖5 差異基因統(tǒng)計(jì)和分布圖Fig. 5 Statistics and distribution of differentially expressed genes

用AgriGo 對(duì)近等基因系中的差異表達(dá)基因作基因富集分析, 發(fā)現(xiàn)這些基因主要參與了對(duì)化學(xué)刺激的應(yīng)激反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)和對(duì)氧化脅迫的應(yīng)激反應(yīng)等(圖6-A)。這表明深播條件對(duì)于玉米來(lái)說(shuō)是一種逆境, 誘導(dǎo)了逆境相關(guān)基因的表達(dá)變化。根據(jù)KEGG 網(wǎng)站的注釋, 這些差異表達(dá)基因中有兩個(gè)與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān), 分別參與了細(xì)胞分裂素和脫落酸的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo); 一個(gè)基因參與了類胡蘿卜素的合成, 在葉黃素循環(huán)中負(fù)責(zé)低光條件下的催化作用; 還有一個(gè)基因參與了卟啉和葉綠素的代謝途徑, 負(fù)責(zé)將鎂離子螯合到卟啉環(huán)上(圖6-B)。表明候選基因可能是通過(guò)這些途徑調(diào)控中胚軸伸長(zhǎng), 進(jìn)而導(dǎo)致近等基因系的表型差異。

圖6 近等基因系中差異基因GO 分析Fig. 6 GO analysis of differentially expressed genes in near-isogenic lines

3 討論

目前玉米中已報(bào)道的耐深播相關(guān)的QTL 相對(duì)較少。Troyer[9]曾經(jīng)定位到3 個(gè)深播條件下與中胚軸長(zhǎng)度相關(guān)的QTL, 分別位于3 號(hào)、6 號(hào)、9 號(hào)染色體上,Liu 等[17]檢測(cè)到32 個(gè)與深播發(fā)芽能力相關(guān)的QTL,在玉米10 條染色體上均有分布。盡管本實(shí)驗(yàn)中的耐深播QTLqMES20-10與他們報(bào)道的QTL 并沒(méi)有重合, 但我們首先利用170 份BC3F3：4家系的基因型和表型, 對(duì)QTL 區(qū)段不同基因型家系的表型做了方差分析, 初步確證了qMES20-10的真實(shí)性(圖2-A); 并利用覆蓋玉米全基因組的芯片對(duì)該群體進(jìn)行了全基因組的QTL 檢測(cè), 進(jìn)一步確證了qMES20-10的真實(shí)性, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果中僅 10 號(hào)染色體上存在一個(gè)主效QTL (LOD＞2.5) (圖2-B), 說(shuō)明經(jīng)過(guò)多代自交和回交后, 基本排除了其他位點(diǎn)的干擾, 所以本研究中構(gòu)建的群體是對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)精細(xì)定位的理想材料。在精細(xì)定位的研究中, 利用BC4F2：3家系以兩種策略都將qMES20-10定位到10 號(hào)染色體133.3～136.0 Mb 的區(qū)間(圖3 和圖4), 為該位點(diǎn)的進(jìn)一步圖位克隆打下基礎(chǔ)。

對(duì)近等基因系進(jìn)行差異表達(dá)分析, 進(jìn)而挖掘候選基因, 是QTL 定位中尋找候選基因的常用方法[34]。同時(shí)差異表達(dá)分析還能預(yù)測(cè)候選基因通過(guò)怎樣的代謝通路影響表型[35]。本研究的RNA-Seq 結(jié)果有助于本研究和其他后續(xù)研究確定與耐深播相關(guān)的候選基因。根據(jù)近等基因系中差異表達(dá)基因的GO 分析結(jié)果, 二者之間的差異表達(dá)基因主要影響了對(duì)化學(xué)刺激的應(yīng)激反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)和對(duì)氧化脅迫的應(yīng)激反應(yīng)等(圖6-A)。深播條件下, 作物處于缺氧狀態(tài),細(xì)胞內(nèi)可能會(huì)通過(guò)氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生較多的氧來(lái)維持平衡, 進(jìn)而造成氧化脅迫, 誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)。因此, 這些差異表達(dá)基因很好地解釋了近等基因系中胚軸長(zhǎng)度的差異。

趙光武等[16]研究表明, 深播條件下玉米中胚軸部位GA3和IAA 含量均顯著提高, 且外源的GA3和IAA 均能促進(jìn)中胚軸伸長(zhǎng), 這說(shuō)明深播條件下對(duì)兩種激素有響應(yīng)的基因被誘導(dǎo)表達(dá), 從而促進(jìn)中胚軸伸長(zhǎng)。而根據(jù)擬南芥中的報(bào)道, 細(xì)胞分裂素和脫落酸等植物激素也會(huì)影響下胚軸伸長(zhǎng)[36-37], 說(shuō)明植物激素在中胚軸伸長(zhǎng)中有重要的調(diào)控作用。本研究根據(jù)KEGG 網(wǎng)站的注釋信息, 差異表達(dá)基因影響了細(xì)胞分裂素和脫落酸的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo), 說(shuō)明候選基因可能通過(guò)參與這些植物激素的調(diào)控影響中胚軸伸長(zhǎng)。另外, 光信號(hào)通路也會(huì)影響擬南芥的下胚軸伸長(zhǎng)[38],本研究中的差異表達(dá)基因還參與了葉綠素合成和類胡蘿卜素合成, 表明候選基因也可能通過(guò)光信號(hào)通路調(diào)控中胚軸伸長(zhǎng)(圖6-B)?？傊? 這些差異表達(dá)基因?yàn)檫M(jìn)一步克隆qMES20-10位點(diǎn)和解釋基因功能奠定了良好的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

構(gòu)建了X178 作為受體親本的高代回交群體,將耐深播主效QTLqMES20-10進(jìn)一步精細(xì)定位到10 號(hào)染色體上133.3～136.0 Mb 的區(qū)間, 并分析了近等基因系中基因差異表達(dá)情況。研究結(jié)果為該QTL的克隆奠定了基礎(chǔ)。