灌漿溫度和氮肥及其互作效應對稻米貯藏蛋白組分的影響

韓展譽 管弦悅 趙 倩 吳春艷 黃福燈 潘 剛 程方民,*

1 浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院, 浙江杭州 310058; 2 浙江省農(nóng)業(yè)科學院, 浙江杭州310021

稻米品質(zhì)是品種基因型與環(huán)境生態(tài)因素共同作用的結(jié)果, 灌漿結(jié)實期溫度與氮肥施用量是影響稻米品質(zhì)的兩個重要生態(tài)因子[1-2]。現(xiàn)已基本明確, 灌漿結(jié)實期高溫會引起稻米整精米率下降、堊白度增加和稻米蒸煮食味品質(zhì)變劣[2-4], 水稻生育后期氮素營養(yǎng)不足或氮肥施用過量均不利于稻米品質(zhì)改良[5-9]。其中, 氮素營養(yǎng)不足會引起水稻生育后期功能葉片的提早衰老和光合同化物生產(chǎn)能力迅速下降[10], 導致籽粒灌漿充實不良、稻米堊白度增加、整精米率下降, 但氮素穗肥施用過大, 則會引起稻米蛋白含量偏高、米飯色澤和透明度變差、食味口感下降[11-12]。

貯藏蛋白是稻米的第二大類化學組分, 它不僅是評價稻米營養(yǎng)品質(zhì)的一個重要指標, 而且與稻米外觀、蒸煮食味品質(zhì)也存在密切聯(lián)系[13]。一般認為,蛋白質(zhì)含量過高會引起稻米食味品質(zhì)變差[1,7-9,11],但陳能等[14]認為, 兩者的負相關(guān)性并不顯著。據(jù)Champagne 等[5]和姚姝等[12]報道, 盡管蛋白質(zhì)含量對食味有一定程度的影響, 但品種類型不同, 其影響程度各異。稻米蛋白質(zhì)對其蒸煮食味品質(zhì)的負面效應, 只有在蛋白質(zhì)含量超過一定的上限指標(6%～7%)后才會體現(xiàn)[14-15]。此外, 稻米蛋白含量對米飯色澤和食味口感的影響, 也與其貯藏蛋白組分差異及其亞基構(gòu)成等因素有關(guān)。據(jù)Hamaker 等[16-17]報道, 稻米蛋白質(zhì)中的谷蛋白和球蛋白是由一些優(yōu)良氨基酸組成, 屬營養(yǎng)豐富且不影響米飯食味的蛋白質(zhì), 只有阻礙淀粉網(wǎng)眼狀結(jié)構(gòu)發(fā)展的醇溶蛋白才是導致米飯食味降低的貯藏蛋白組分。但Lin 等[18]認為, 稻米谷蛋白對淀粉的糊化和膨脹具有抑制作用, 其含量高低與稻米糊化溫度、膠稠度等品質(zhì)指標呈顯著負相關(guān), 占稻米貯藏蛋白含量80%左右的谷蛋白含量增加會降低稻米蒸煮食味品質(zhì)。近年來的水稻優(yōu)質(zhì)栽培實踐表明, 灌漿結(jié)實期高溫和氮肥施用過量均會引起稻米蛋白質(zhì)含量增加和米飯食味下降[6-12],但對于不同生態(tài)條件下稻米蛋白質(zhì)含量與其蒸煮食味品質(zhì)間的相互關(guān)系, 尤其是灌漿結(jié)實期高溫對稻米貯藏蛋白組分的影響及其有別于氮肥效應的理化生態(tài)特點, 迄今尚缺乏較明確認識。為此, 本研究以多個水稻主栽品種為材料, 通過人工控溫試驗、大田氮肥試驗、溫氮兩因素互作試驗, 比較分析水稻貯藏蛋白含量及其組分的差異變化, 旨在揭示灌漿結(jié)實期高溫與氮肥施用量對稻米貯藏蛋白組分的影響及其交互效應, 為稻米營養(yǎng)品質(zhì)改良以及通過品種選育和栽培調(diào)控等措施來協(xié)調(diào)稻米營養(yǎng)品質(zhì)與蒸煮食味品質(zhì)間的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 溫度處理試驗

溫度處理試驗于2017年在浙江大學紫金港校區(qū)農(nóng)業(yè)試驗站進行。供試水稻品種為浙恢7954、黃華占、秀水134、秀水09、9311 和甬優(yōu)2640。其中,浙恢7954、黃華占、9311 為秈稻品種, 秀水134 和秀水09 為粳稻品種, 甬優(yōu)2640 是秈粳亞種間雜交稻品種。5月20日播種, 采用濕潤育秧, 6月15日移栽, 各品種在田間隨機排列, 每個品種在田間種植2 個小區(qū), 每小區(qū)面積9 m2, 栽插密度為18 cm ×20 cm, 單本栽插, 待各品種分別在田間生長至孕穗后期, 選取發(fā)育進程與長勢基本一致的稻株10 株,帶泥移入盆缽培育7～10 d 至抽穗開花期, 選同日開花且發(fā)育良好的單穗掛牌, 并在花后第4 天將稻株移入人工氣候箱進行灌漿結(jié)實期的不同溫度處理(每個品種在每個氣候箱中各放3～4 盆), 直至水稻成熟收獲。

使用2 臺CONVIRON 人工氣候箱, 設(shè)常溫(日均溫度23 ℃)和高溫度(日均溫度32 ℃) 2 個處理, 由程序自動控溫, 模擬自然氣候日變化, 24 h 連續(xù)運轉(zhuǎn)。每日14：00 為最高溫、5：00 為最低溫, 期間溫度以1℃為間隔呈線性增加。其中, 常溫處理的最高溫度和最低溫度分別為26℃和20 ℃, 高溫處理時的最高溫度和最低溫度分別為36℃和28 ℃, 2 臺氣候箱中的其他氣候因子均保持完全一致。其中, 光照時間為6：00—19：00, 光照強度為120～150 J m-2s-1, 相對濕度為75%～80%, 風速0.5 m s-1。

1.2 氮素(肥)處理試驗

試驗于2018年在浙江省農(nóng)業(yè)科學院海寧試驗基地進行。供試水稻品種為浙恢7954、黃華占、秀水134、秀水09。設(shè)不施氮肥(N0)、180 kg hm-2(MN)和300 kg hm-2(HN) 3 個氮處理水平, 氮肥為主區(qū),品種為裂區(qū), 小區(qū)面積為6.0 m × 4.0 m, 設(shè)3 次重復,共12 個小區(qū)。氮肥依據(jù)含氮率折合成尿素按基肥﹕分蘗肥 ﹕穗肥為4∶3∶3 施用, 并依此比例來確定各處理不同生育時期的氮素施用量。試驗地前茬為油菜, 土壤含有機質(zhì)2.41%、全氮0.15%、堿解氮104.55 mg kg-1、全磷0.14%、速效磷107.18 mg kg-1、全鉀1.38%、速效鉀110.26 mg kg-1。5月25日播種,6月20日移栽, 栽插密度為20 cm × 20 cm, 每穴2苗, 移栽前施過磷酸鈣(含P2O513.5%) 250 kg hm-2和氯化鉀(含K2O 52%) 200 kg hm-2, 不同氮處理的磷肥與鉀肥施用量相等。大田常規(guī)水作栽培管理,不同施氮處理間做埂隔開, 用塑料薄膜覆蓋埂體,保證各處理單獨排灌, 成熟后收獲籽粒用于稻米品質(zhì)指標測定。

1.3 溫度與氮肥(素)兩因素處理試驗

試驗于2018年在浙江大學紫金港校區(qū)農(nóng)業(yè)試驗站進行, 供水稻材料為浙恢7954。5月15日播種,大田濕潤育秧, 6月12日移栽至盆缽, 盆缽直徑25 cm、高30 cm, 內(nèi)裝過篩土約15 kg。盆缽土壤2017年取自浙江省農(nóng)業(yè)科學院海寧試驗基地, 土壤含有機質(zhì)2.34%、全氮0.13%、速效氮96.35 mg kg-1、全磷0.17%、速效磷120.41 mg kg-1、全鉀1.45%、速效鉀110.26 mg kg-1。土壤經(jīng)自然風干、充分浸泡和充分混勻后, 分別裝入不同盆缽(共48 盆)。移栽前每盆施2 g 尿素和0.5 g KH2PO4做基肥, 移栽后7 d 每盆施0.5 g 尿素。在水稻生長至穗分化期(葉齡余數(shù)為1.5～1.2 時)實施氮肥處理。其中, 低氮處理水平(LN)每盆施0.5 g 尿素, 高氮處理水平(HN)每盆施2.0 g 尿素。每個氮處理水平24 盆, 盆缽水稻放置于大型智能溫室(28℃白天/22℃夜間)生長, 溫室內(nèi)自然光照, 每3 d 左右澆1 次水, 及時防控病蟲。待盆缽水稻在大型智能溫室生長發(fā)育至齊穗期, 選同日開花且發(fā)育良好的單穗掛牌, 并將每個氮肥處理的盆缽進一步分成3 組(每組8 盆), 在掛牌標記稻穗開花后的第4 天, 分別將其盆缽移入3 臺CONVIRON人工氣候箱實施不同溫度處理, 待水稻在氣候箱中生長至成熟時, 收獲掛牌標記的稻穗。3 臺CONVIR ON 人工氣候箱的溫度處理設(shè)計為常溫(日均溫度23 ℃ ,日最高溫度和最低溫度分別為26℃和20 ℃)、高溫I (日均溫度30 ℃ ,日最高溫度和最低溫度分別為34℃和26 ℃)、高溫II (日均溫度34 ℃, 日最高溫度和最低溫度分別為38℃和30 ℃)。溫度日變化模擬自然氣候特征,每日14：00 為最高溫、5：00 為最低溫, 期間溫度以1℃為間隔呈線性增加。3 臺氣候箱中的其他氣候因子均保持完全一致。其中, 光照時間為6：00—19：00, 光照強度為120～150 J m-2s-1, 相對濕度為75%～80%, 風速0.5 m s-1。

1.4 籽粒總蛋白含量測定

將成熟稻谷放在通風處2 個月后, 去殼、磨粉和過篩(0.25 mm)。參照Luthe 等[18]報道的方法略作修改, 采用凱氏定氮法測定籽粒糙米米粉總蛋白含量。稱取糙米粉 200 mg, 倒入硝煮管, 加3 g 硫酸鉀∶硫酸銅粉末(10∶1, w/w), 再加8 mL 濃硫酸,在硝煮儀(Tecator Digestor Auto, Foss)上 360℃煮150 min, 將冷卻后樣品注入凱氏定氮儀, 蒸餾和滴定過程自動運行, 記錄下空白和樣品消耗鹽酸的體積, 利用公式計算出總氮含量, 總蛋白含量等于總氮含量×5.95。

1.5 4種蛋白組分的提取與測定

參照Luthe 等[19]和Liu 等[20]方法對0.5 g 糙米米粉中的4 種蛋白組分進行分步提取。1)去離子水提取清蛋白; 2) 2%氯化鈉提取球蛋白; 3) 55% (v/v)正丙醇提取醇溶蛋白; 4) 0.24%五水合硫酸銅、1.68%KOH、0.5%酒石酸鉀鈉和50% (v/v)異丙醇混合溶液提取谷蛋白。每次提取液用量為25 mL, 室溫下2 h,期間不斷振蕩, 其后4000×g離心10 min, 重復提取3 次。采用Bradford 法[19]測定清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白含量, 以牛血清蛋白為對照; 采用雙縮脲法測定谷蛋白含量[20], 仍以牛血清蛋白為對照, 并用凱式法加以標定。

1.6 蛋白亞基組成的SDS-PAGE 分析

參照 Yamagata 等[21]方法進行稻米蛋白的SDS-PAGE 分析。準確稱取30 mg 糙米粉于2 mL 離心管中, 加入1 mL 的SDS-urea 提取液(4%SDS、5%硫基乙醇、20%甘油和8 mol L-1尿素, pH 6.8), 室溫下過夜, 將混合液在20 ℃ 15,000×g離心20 min, 上清液用于點樣。

取10 μL 總蛋白提取液上樣進行SDS-PAGE 電泳。采用分離膠濃度為12%, 濃縮膠濃度均為5%。電極緩沖液為Tris-HCl 體系, 含0.1% SDS。室溫下恒流20～30 mA (起始15～20 mA)電泳2～3 h 至溴酚藍泳動到膠板下緣停止, 取出凝膠板進行沖洗、固定、染色、脫色等。最后將凝膠在Bio-Rad GS-800掃描儀掃描, 以ImageJ 對染色凝膠中谷蛋白及其前驅(qū)物的相對光密度進行估算。

2 結(jié)果與分析

2.1 灌漿溫度對水稻籽粒蛋白含量和組分的影響

由表1 可見, 高溫處理會引起水稻籽粒總蛋白含量(%)的顯著上升, 在4 種蛋白組分中, 清蛋白、球蛋白和谷蛋白組分含量(%)在高溫處理下呈上升趨勢, 而多數(shù)品種的醇溶蛋白組分含量(%)在高溫處理下呈下降趨勢。其中, 9311 在高溫處理下的醇溶蛋白含量(%)雖略有上升, 但與其常溫處理間的差異未達統(tǒng)計顯著水平。從單位籽粒蛋白絕對含量(mg grain-1)來看, 浙恢7954 和秀水134 在高溫處理下有所上升(mg grain-1), 但黃華占、秀水09、9311 和甬優(yōu)2640 在不同溫度處理下的含量(mg grain-1)變化不明顯, 甚至略有降低。此外, 供試6 個品種的谷蛋白/醇溶蛋白比值在高溫處理下均呈不同程度的上升趨勢(表1)。上述現(xiàn)象說明, 高溫處理雖然會引起水稻籽粒總蛋白和谷蛋白組分的相對含量(%)有所提高, 并顯著提高水稻籽粒中的谷蛋白與醇溶蛋白比值, 但單位籽粒中的谷蛋白積累量(mg grain-1)并不一定會出現(xiàn)顯著增加, 且醇溶蛋白占籽粒的百分相對含量(%)和單位籽粒的醇溶蛋白絕對量(mg grain-1)均有所下降。

利用SDS-PAGE 對不同溫度處理下籽粒貯藏蛋白亞基差異的檢測表明(圖1), 水稻籽粒貯藏蛋白主要由57 kD、37～39 kD、22～23 kD 和醇溶蛋白亞基(prolamin)組成。其中, 57 kD、37 kD 和22 kD 是3個谷蛋白亞基, 分別對應其pro-glutelin、α-glutelin和 β-glutelin。同一品種的不同溫度處理間相比,57 kD 谷蛋白前體亞基(pro-glutelin)在高溫處理下的條帶亮度相對較高, 而醇溶蛋白亞基在高溫處理下的條帶亮度明顯變暗。光密度掃描結(jié)果表明, 浙恢7954 在高溫處理下的 57 kD 谷蛋白前體亞基(pro-glutelin)、37 kD 谷蛋白酸性亞基(α-glutelin)和22 kD 谷蛋白堿性亞基(β-glutelin)含量均高于其常溫對照, 而黃華占和秀水 134 在不同溫度處理下的α-glutelin 亞基含量差異不明顯。上述現(xiàn)象說明, 高溫處理在引起水稻籽粒醇溶蛋白積累量降低的同時, 會引起谷蛋白前體亞基(pro-glutelin)量的較明顯增加。

2.2 氮肥處理對水稻籽粒蛋白含量和組分的影響

表1 不同溫度處理下水稻籽粒蛋白含量及其組分差異Table 1 Differences in total protein and its component contents in rice kernels between two temperature treatments

表2 顯示, 增施氮肥引起水稻籽?？偟鞍准捌?種蛋白組分含量(%)的顯著上升, 且高氮處理(HN)下籽?？偟鞍?、清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白含量(%)通常高于中氮處理(MN), 但部分品種的總蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白在高氮處理(HN)與中氮處理(MN)間差異未到達統(tǒng)計顯著水平。氮素穗肥處理對水稻單位籽粒蛋白絕對含量(mg grain-1)的影響與其百分相對含量(%)相似, 總體趨勢表現(xiàn)為HN ＞MN ＞LN, 但HN 與MN 兩個處理之間的差異幅度相對較小。其中, 部分品種在HN 和MN 兩個處理間的單位籽粒醇溶蛋白和谷蛋白含量(mg grain-1)差異未達統(tǒng)計顯著水平(表2)。此外, 與不施氮對照(LN)相比, 增施氮肥(HN 和MN)引起稻米醇溶蛋白含量(包括百分相對含量與單位籽粒絕對含量)的顯著提高, 這與醇溶蛋白含量受高溫處理影響所表現(xiàn)出的下降趨勢有明顯差別。與高溫處理相似, 增施氮肥引起水稻籽粒中的谷蛋白/醇溶蛋白比值上升(表2)。但從變化幅度看, 同一品種的谷蛋白/醇溶蛋白比值在不同氮素處理下的差異范圍大致在0.46～0.95之間(表2), 遠低于其在不同溫度處理(HT 與NT)間的差異幅度(表1)。這說明氮素穗肥對水稻籽粒谷蛋白/醇溶蛋白比值的影響程度相對小于高溫處理。

圖1 不同溫度處理下水稻籽粒貯藏蛋白SDS-PAGE 及其主要蛋白條帶的相對光密度差異Fig. 1 Differences in SDS-PAGE and relative optical density of storage protein between two temperature treatments

表2 不同施氮水平下水稻籽粒蛋白含量及其組分差異Table 2 Differences in total protein and its component contents in rice kernels among different N treatment

利用SDS-PAGE 對不同氮處理水平下籽粒貯藏蛋白亞基組成的檢測表明(圖2), 低氮處理下幾個主要蛋白亞基條帶(包括 pro-glutelin、α-glutelin、β-glutelin 和prolamin)的相對亮度均弱于其同一品種的高氮(HN)和中氮(MN)處理(圖2-A)。光密度掃描結(jié)果表明, 施氮處理(HT 和MN)對谷蛋白亞基組成的影響不明顯, 谷蛋白的 57 kD 前體亞基(proglutelin)、37 kD 酸性亞基(α-glutelin)和22 kD 堿性亞基(β-glutelin)在高氮(HN)和中氮(MN)的含量均顯著高于其低氮處理(LN)。與此同時, 醇溶蛋白亞基含量在高氮處理(HN)下也呈上升趨勢。說明高氮處理雖然會引起水稻籽粒谷蛋白和醇溶蛋白含量的上升, 但對谷蛋白亞基的積累形態(tài)影響并不明顯。

2.3 溫氮兩因素處理對水稻籽粒蛋白含量和組分的影響

對不同溫氮處理下水稻籽粒4 種蛋白組分和總蛋白含量的比較可知(表3), 高氮(HN)+高溫(HT2)處理組合下的籽粒谷蛋白和總蛋白含量(%)明顯高于高氮(HN)+常溫(NT)和低氮(LN)+高溫(HT2)等處理組合, 但高溫(HT2)+高氮(HN)處理組合下的單位籽粒谷蛋白的絕對含量(mg grain-1)卻低于高氮(HN)+常溫(NT)處理組合, 這說明高氮+高溫處理(HN+HT2)并不會引起谷蛋白絕對含量(mg grain-1)的進一步提升。此外, 在低氮(LN)和高氮(HN)水平下, 高溫處理均會引起水稻籽粒醇溶蛋白含量(相對百分含量和單位籽粒絕對含量)的較明顯下降和谷蛋白/醇溶蛋白的比值上升, 且其絕對含量(mg grain-1)在HT2 處理下的下降或上升幅度大于HT1處理。同一溫度處理下的不同氮水平相比, 籽粒總蛋白、清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白在高氮水平(HN)下的相對含量(%)和絕對含量(mg grain-1)均顯著高于其相應的低氮(LN)處理(表3)。

圖2 不同施氮水平下水稻籽粒貯藏蛋白SDS-PAGE 及其主要蛋白條帶的相對光密度差異Fig. 2 Differences in SDS-PAGE and relative optical density of storage protein among three N treatments

對不同氮(素)×溫(度)處理下籽粒貯藏蛋白亞基組成的SDS-PAGE 檢測結(jié)果(圖3)表明, 在低氮水平下, 高溫處理(HT1 和 HT2)會引起籽粒谷蛋白的57 kD 前體亞基(pro-glutelin)、37 kD 酸性亞基(αglutelin)和22 kD 堿性亞基(β-glutelin)含量顯著升高,但在高氮水平下, 高溫處理(HT1 和HT2)的37 kD 酸性亞基(α-glutelin)和22 kD 堿性亞基(β-glutelin)含量卻低于常溫處理(NT)。這說明灌漿溫度對籽粒谷蛋白含量的影響可能與氮營養(yǎng)供應狀況有關(guān), 溫度與氮肥對稻米谷蛋白及其亞基組分的影響存在一定程度的互作效應。對醇溶蛋白而言, 在低氮水平(LN)和高氮水平(HN)下, 高溫處理均會引起其含量的明顯降低(圖3-B)。

表3 溫氮處理下水稻籽粒蛋白及其組分的含量差異Table 3 Differences of grain protein components and contents in rice under different temperature and different N levels

3 討論

關(guān)于灌漿結(jié)實期溫度對稻米蛋白質(zhì)含量影響,現(xiàn)已不乏報道, 但研究結(jié)論不一[15,18,24-25]。多數(shù)研究報道認為, 灌漿結(jié)實高溫或夜間增溫會引起稻米粗蛋白含量提高[15,22-24], 但周廣洽等[26]認為, 灌漿結(jié)實期溫度過高或過低都會引起稻米蛋白質(zhì)含量下降。據(jù)Krishman 等[15]報道, 灌漿溫度對稻米蛋白質(zhì)含量的影響因品種而異, 大多數(shù)品種蛋白質(zhì)含量與結(jié)實期溫度正相關(guān), 但也有部分品種的蛋白質(zhì)含量與灌漿溫度相關(guān)不顯著或呈負相關(guān)。Lin 等[18]認為,稻米蛋白質(zhì)含量在高溫脅迫下增加的原因主要是籽粒粗蛋白占籽?？偢芍氐南鄬Ρ戎翟黾? 且高溫脅迫會導致籽粒灌漿后期貯藏蛋白積累量減少[27]。本研究中, 稻米谷蛋白和總蛋白的相對含量(%)在高溫處理下呈顯著上升趨勢, 這與前人的大多數(shù)研究結(jié)果基本一致。但從單位籽粒中積累的蛋白絕對量看, 除浙恢7954 和秀水134 之外, 其余4 個品種單位籽粒中所積累的谷蛋白的絕對含量在高溫處理下并沒有表現(xiàn)出十分明顯的上升趨勢(表1)。據(jù)前人研究報道, 水稻籽粒淀粉合成積累量在高溫脅迫下顯著降低、糊粉層占淀粉層的相對比例明顯提高[15,22],高溫脅迫對灌漿籽粒中糖轉(zhuǎn)運和淀粉合成代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達水平的影響幅度比貯藏蛋白合成代謝相關(guān)基因明顯[28]。Yamakawa 等[29]研究表明, 水稻胚乳中的谷蛋白、醇溶蛋白和球蛋白類基因在高溫處理下多呈下調(diào)表達特征。由此筆者推測, 灌漿結(jié)實期高溫引起稻米蛋白含量(%)上升的原因, 在很大程度上與高溫脅迫下的淀粉積累量下降和貯藏蛋白占籽粒干重的相對比例增加所引起的“濃縮效應”有關(guān), 籽粒干重和淀粉積累量的下降, 是高溫處理下水稻籽粒貯藏蛋白的相對含量(%)增加的一個重要因素。此外, 高溫脅迫處理不僅影響水稻籽粒的貯藏蛋白總量, 而且影響貯藏蛋白的組成及其積累形態(tài)。本文人工氣候箱控溫試驗表明, 不同水稻品種籽粒中的醇溶蛋白含量在高溫處理下均一定程度下降, 這與馬啟林等[25]的研究結(jié)果基本一致。本文進一步揭示, 高溫處理所引起水稻籽粒醇溶蛋白含量的下降現(xiàn)象, 不僅表現(xiàn)在醇溶蛋白占籽粒干重的相對含量(%)上, 而且也表現(xiàn)在單位籽粒中的醇溶蛋白的絕對含量(mg grain-1)上(表1)。高溫處理在引起水稻籽粒醇溶蛋白及其13 kD 亞基組分含量下降的同時, 籽粒谷蛋白的57 kD 前體亞基(pro-glutelin)組分含量有所增加, 而37 kD 酸性亞基(α-glutelin)和22 kD 堿性亞基(β-glutelin)含量在不同溫度處理下的差異變化因品種而異(圖1)。與之相比, Dou 等[23]的大田增溫試驗結(jié)果表明, 夜間增溫會引起稻米粗蛋白含量增加, 但對稻米各種氨基酸組分的相對比例影響不大。因此, 灌漿溫度對稻米谷蛋白含量的影響相對較復雜, 可能既與水稻品種本身的谷蛋白含量高低及其各個亞基組分的比例差異等遺傳因素有關(guān), 也與高溫范圍或增溫幅度等生態(tài)因素存在一定聯(lián)系。

圖3 溫氮處理下水稻籽粒貯藏蛋白的SDS-PAGE 及其主要蛋白條帶的相對光密度差異Fig. 3 Differences in SDS-PAGE and relative optical density of storage protein treated under different temperature regimes and different N levels

氮肥水平是影響稻米粗蛋白含量的重要栽培因素之一。大量研究表明, 增施氮肥或前氮后移會引起稻米貯藏蛋白含量的較明顯增加[6-10]。在一定施氮量范圍內(nèi), 稻米蛋白含量隨氮肥(尤其是氮素穗肥)施用量的增加呈上升趨勢, 但不同水稻品種的稻米蛋白含量對氮肥的敏感程度不同, 氮肥施用量過高會引起部分水稻品種籽粒飽滿度下降[8,10-11]。在本文研究結(jié)果中, 增施氮肥使水稻籽?？偟鞍准捌? 種蛋白組分含量(%)顯著上升, 這與前人研究結(jié)果一致。本研究利用SDS-PAGE 對不同氮處理水平下籽粒貯藏蛋白亞基組成的檢測表明, 谷蛋白的57 kD前體亞基(pro-glutelin)、37 kD 酸性亞基(α-glutelin)和 22 kD 堿性亞基(β-glutelin), 以及醇溶蛋白的13 kD 亞基在高氮處理下含量均明顯高于其相同品種的低氮處理(LN)(圖2), 且增施氮肥引起水稻籽粒谷蛋白/醇溶蛋白的比值有所上升(表1), 但與灌漿結(jié)實期溫度處理相比, 氮肥處理對谷蛋白各個亞基的積累形態(tài)及其相對比例影響不甚明顯, 且同一品種在不同氮肥處理的谷蛋白/醇溶蛋白比值的變化幅度也沒有高溫處理對兩者比值的影響程度大。值得關(guān)注的是, 增施氮肥(HN 和MN)會引起稻米醇溶蛋白含量的顯著提高, 這與醇溶蛋白受高溫處理影響所表現(xiàn)出的下降趨勢有明顯不同, 這也是高溫處理有別于高氮處理對稻米貯藏蛋白組分影響的一個重要特點。據(jù)前人研究報道, 醇溶蛋白存在于蛋白體I (PB-I), 球蛋白和谷蛋白儲存于蛋白體II (PB-II)中[13,21,30]。其中, 富含谷蛋白的PB-II 蛋白體易于消化, 對食味負面效應小, 而以醇溶蛋白為主的PB-I對蛋白分解酶具有較強的抵抗力, 可能是稻米蛋白質(zhì)影響米飯食味的一個重要因素[30-31]。但在本研究中, 增施氮肥會引起稻米中的醇溶蛋白含量上升,而稻米醇溶蛋白含量在高溫處理下呈下降趨勢, 且同一品種在高氮處理(HN)下的谷蛋白/醇溶蛋白比值還略高于其低氮處理(LN)和中氮處理(MN)(表1和表2)。因此, 盡管稻米蛋白含量及其組分變化會對稻米蒸煮食味品質(zhì)產(chǎn)生明顯影響, 但稻米食味品質(zhì)與貯藏蛋白含量及組分間的關(guān)系可能較復雜, 尤其是灌漿結(jié)實期高溫造成的稻米食味品質(zhì)下降現(xiàn)象,實際上并不是高溫脅迫下籽粒醇溶蛋白含量升高所引起的。

隨全球氣候的變暖, 水稻高溫危害及其栽培措施緩解問題正日益引起人們關(guān)注[32]。據(jù)前人研究報道, 合理氮素穗粒肥可減輕或緩解高溫對水稻灌漿結(jié)實的脅迫傷害[33-35]。段驊等[36]認為, 在高溫脅迫下適當增施氮肥可提高水稻的結(jié)實率和千粒重, 減輕高溫對產(chǎn)量和稻米品質(zhì)的不利影響。吳翠平等[37]研究表明, 在基追比例1∶1 的基礎(chǔ)上增大拔節(jié)期氮素追施比例, 能顯著提高小麥常溫和高溫脅迫下籽粒產(chǎn)量, 緩解高溫脅迫對小麥千粒重和籽粒產(chǎn)量的不良影響, 但對小麥品質(zhì)影響不明顯。Ito 等[38]研究認為, 高溫脅迫會引起小麥籽粒中的淀粉合成受阻,而適度施氮能通過維持淀粉合成相關(guān)酶活性來減輕高溫危害。從而降低高溫下稻米堊白發(fā)生、提高稻米食味和整精米率。Tang 等[35]研究表明, 氮素粒肥可通過影響稻米淀粉組分及其有關(guān)理化特性來緩解高溫脅迫對稻米食味不利效應, 但對于灌漿溫度與氮素穗肥施用對稻米蛋白含量及其組分的影響效應目前尚不清楚。在本研究中, 高氮(HN)+高溫(HT2)處理組合下的稻米谷蛋白和總蛋白含量明顯高于高氮(HN)+常溫(NT)和低氮(LN)+高溫(HT2)等處理組合, 這說明高溫和高氮對稻米谷蛋白和總蛋白含量的影響存在著一定程度的“累加”效應, 但在高氮處理(HN)下高溫引起稻米醇溶蛋白含量的降低幅度相對小于其相應的低氮處理(LN), 有利于稻米醇溶蛋白含量在不同溫度處理下的相對穩(wěn)定(表3 和圖3)。此外, 本文溫氮兩因素試驗結(jié)果表明, 在低氮水平下, 高溫會引起籽粒谷蛋白的57 kD 前體亞基、37 kD 酸性亞基和22 kD 堿性亞基含量顯著升高, 而在高氮水平下, 谷蛋白的上述亞基組分隨溫度處理變化卻呈相反趨勢, 說明灌漿溫度對籽粒谷蛋白亞基組分的影響與氮處理水平有關(guān)。對于溫度與氮肥對稻米谷蛋白及其亞基組分影響的互作效應等問題,尚需今后進一步深入研究。

4 結(jié)論

高溫處理和增施氮肥雖然均會引起水稻籽粒總蛋白和谷蛋白等組分占籽粒干重相對含量(%)的顯著提升, 但高溫處理對單位籽粒中總蛋白與谷蛋白的絕對含量(mg grain-1)影響卻遠沒有增施氮肥的效應明顯, 因此灌漿結(jié)實期高溫所引起的稻米蛋白相對含量(%)上升現(xiàn)象, 在很大程度上與高溫脅迫處理下的淀粉積累量下降和貯藏蛋白占籽粒干重的相對比例增加所引起的“濃縮效應”有關(guān)。此外, 高溫處理與增施氮肥對稻米醇溶蛋白組分的影響存在明顯差別, 高溫處理會引起稻米醇溶蛋白在相對含量(%)和絕對含量(mg grain-1)上均呈現(xiàn)明顯下降, 并顯著提高稻米中的谷蛋白/醇溶蛋白比值, 而增施氮肥在引起稻米谷蛋白含量提高的同時, 稻米醇溶蛋白含量也呈現(xiàn)上升趨勢, 氮肥處理對谷蛋白/醇溶蛋白比值的影響相對小于溫度處理, 說明灌漿結(jié)實期高溫造成的稻米食味品質(zhì)下降現(xiàn)象, 并不是其在高溫脅迫下籽粒醇溶蛋白含量升高所引起的。高氮+高溫處理組合對稻米總蛋白與谷蛋白含量的影響程度要顯著大于單一高溫或高氮處理, 兩因素對稻米總蛋白含量和谷蛋白組分的影響存在一定程度的“累加”效應, 但增施氮肥可緩解稻米醇溶蛋白在高溫脅迫下的降低幅度, 有利于水稻在遭遇高溫脅迫氣候下稻米醇溶蛋白含量的相對穩(wěn)定。