基于CRISPR/Cas9 核糖核蛋白體DNA 定點(diǎn)內(nèi)切酶體外活性建立高效基因型分析技術(shù)

王 南 祁顯濤,2 劉昌林 謝傳曉,* 朱金潔,*

1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京100081; 2 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 安徽合肥230036

2012年9月, Jinek 等[1]在體外驗(yàn)證了sgRNA/Cas9 核糖核蛋白復(fù)合體具有DNA 定點(diǎn)剪切的活性。次年, 張峰課題組首次報(bào)道了CRISPR/Cas9 在人類(lèi)細(xì)胞中定點(diǎn)編輯DNA 的活性[2]。自此, 基因編輯技術(shù)成為生命科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)發(fā)展前沿, 研究熱度呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。CRISPR/Cas 基因編輯技術(shù)不僅可應(yīng)用于基因敲除、基因插入、定點(diǎn)突變與染色體重組等遺傳操作[3-6], 而且還派生出如堿基編輯、轉(zhuǎn)錄激活或抑制、表觀(guān)修飾以及DNA 與RNA 原位示蹤成像等一系列重要的遺傳學(xué)工具[7-11]。然而, 對(duì)該系統(tǒng)的體外應(yīng)用卻鮮有報(bào)道?；谠撓到y(tǒng)的DNA 定點(diǎn)剪切的功能, 該系統(tǒng)可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為位點(diǎn)限制性?xún)?nèi)切酶,拓展普通限制性?xún)?nèi)切酶無(wú)法靶向的位點(diǎn), 從而滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的基因型快速鑒定的需求。

目前, 應(yīng)用最廣泛的為組分優(yōu)化的 II 型CRISPR/Cas9 系統(tǒng), 由Cas9 與sgRNA 兩個(gè)元件組成。在sgRNA 的指導(dǎo)下, Cas9 蛋白可在PAM 基序上游的3 nt 處特異性剪切DNA 雙鏈[12]。為打破Cas9蛋白對(duì)PAM 序列的依賴(lài)性, 科學(xué)家們已開(kāi)發(fā)多種識(shí)別不同PAM 序列的Cas9 蛋白變體[13], 其中, 基于蛋白結(jié)構(gòu)優(yōu)化獲得的Cas9NG 的靶向范圍最廣[14]。目前, 不同版本的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于不同物種的植物基因組編輯[15-17]?；诮?jīng)典的CRISPR/Cas9 系統(tǒng), 我國(guó)科學(xué)家首次創(chuàng)建了水稻的CRISPR/Cas9 突變體庫(kù)[18], 我們課題組也針對(duì)玉米的ZmWx[19-20]、ZmLg1[21]、ZmMTL[22]等多個(gè)位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)DNA 的定點(diǎn)編輯, 獲得了多個(gè)具有重要育種價(jià)值的突變體材料。如何對(duì)基因編輯突變體進(jìn)行快速的基因型鑒定成為當(dāng)前該技術(shù)發(fā)展亟待解決的重要問(wèn)題。此外, 除基因編輯突變體具有基因型快速鑒定的需求外, 任何基于DNA 序列變異的位點(diǎn)均需要一種快速、經(jīng)濟(jì)、可靠、高效與高通量的基因型鑒定技術(shù)。例如, 人工誘變及化學(xué)誘變?nèi)后w突變體的快速篩選、基因功能解析中分離群體中個(gè)體的基因型快速鑒定、突變體基因型的快速鑒定等, 因此, 建立高效簡(jiǎn)便的方法對(duì)于功能基因組學(xué)研究與作物分子育種等均具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

目前, 用于植物突變體基因型鑒定的技術(shù)主要包括PCR 限制性?xún)?nèi)切酶酶切(PCR/RE)、錯(cuò)配特異性核酸酶酶切(T7E I/Surveyor assay)、Sanger 測(cè)序、二代測(cè)序(Next-generation sequencing, NGS)及高分辨率溶解曲線(xiàn)分析(High-resolution melting analysis,HRMA)等, 這些技術(shù)都存在自身的優(yōu)點(diǎn), 但同時(shí)也有局限性。PCR/RE 技術(shù)嚴(yán)重依賴(lài)于突變堿基附近的限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn), 限制了靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的自由度從而限制了其范圍[23]?；贒NA 雙鏈錯(cuò)配原理的T7E I 或CEL I 酶切檢測(cè), 商業(yè)酶價(jià)格高昂, 技術(shù)上也存在不能有效區(qū)分純合突變與野生型以及雜合突變與雙等位基因突變的限制[24]。Sanger 測(cè)序雖可直觀(guān)地呈現(xiàn)靶點(diǎn)突變信息, 但其價(jià)格昂貴, 不適用于大規(guī)模突變?nèi)后w檢測(cè)。NGS 及衍生的Hi-TOM 技術(shù)主要適用于高通量篩選鑒定, 無(wú)法滿(mǎn)足對(duì)小量與中量樣本突變體材料早期快速鑒定的需要[25]。2018年高彩霞團(tuán)隊(duì)首先嘗試開(kāi)發(fā)了基于 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的PCR/RNP 技術(shù)[26], 該技術(shù)不受限制性酶切位點(diǎn)選擇的局限, 同時(shí)可精準(zhǔn)區(qū)分野生型、純合突變及雜合突變等基因型, 成本低廉、快速高效, 可實(shí)現(xiàn)突變體高通量篩選, 但檢測(cè)體系仍需要優(yōu)化,進(jìn)一步提高檢測(cè)效率、特異性與靈敏度, 才能進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

本研究的目標(biāo)是建立與優(yōu)化基于CRISPR/Cas9與CRISPR/Cas9NG 核糖核蛋白體定點(diǎn)DNA 內(nèi)切酶體外活性的基因型高效分析技術(shù), 為該技術(shù)的高效應(yīng)用奠定完善的技術(shù)方案。本研究利用原核表達(dá)并純化的Cas9 蛋白或Cas9NG 蛋白為DNA 內(nèi)切酶, 以體外轉(zhuǎn)錄的靶向ZmWx基因靶點(diǎn)的 sgRNA 或esgRNA 為向?qū)?RNA 分子, 通過(guò)體外組裝為sgRNA/Cas9-RNP 復(fù)合體, 對(duì)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)基因編輯手段獲得的玉米ZmWx突變體靶點(diǎn)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行酶切, 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)突變體的基因型分析。本研究將為突變體的高效基因型分析提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

基于ZC01 玉米自交系背景創(chuàng)制的靶向ZmWx基因CRISPR-Cas9 基因編輯等待基因型分析的玉米材料[19], BL21(DE3)大腸桿菌表達(dá)感受態(tài)(北京全式金生物技術(shù)有限公司, 貨號(hào)3CD801), PET30a-Cas9 載體(構(gòu)建), PET 30a-Cas9NG載體(構(gòu)建)。

1.2 方法

1.2.1 Cas9 及Cas9NG 蛋白的原核表達(dá)載體構(gòu)建

從本實(shí)驗(yàn)室保存載體上設(shè)計(jì)引物(表1), 擴(kuò)增獲得Cas9 片段, 使用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI 和NheI 雙酶切PET 30a 載體, 瓊脂糖凝膠電泳分離后, 進(jìn)行膠回收純化?；厥占兓腃as9 片段與PET 30a 線(xiàn)性載體, 用NEB 組裝酶(北京NEB 公司) 50 ℃, 1 h進(jìn)行組裝, 轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)大腸桿菌表達(dá)感受態(tài)中, 均勻涂布在卡那抗性的LB 固體培養(yǎng)基上, 37℃過(guò)夜培養(yǎng), 挑取單克隆酶切鑒定, 將獲得的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送上海英濰捷基公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與Snapgene 載體圖譜比對(duì)一致, 即獲得PET 30a-Cas9 載體。用上述方法, 將限制性?xún)?nèi)切酶NheI 替換為Hind III, 構(gòu)建得到PET 30a-Cas9NG 載體。

1.2.2 Cas9 及Cas9NG蛋白的原核表達(dá)與純化

將構(gòu)建好的融合His標(biāo)簽的Cas9 和Cas9NG蛋白原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到原核表達(dá)菌株BL21(DE3)中。挑取單克隆, 2 次擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600在0.7～0.8 之間。冰浴后加入0.5 mol L-1IPTG溶液誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。以下步驟均在4℃進(jìn)行： 超聲破碎裂解后, 取上清, 進(jìn)行Ni-NTA瓊脂糖介質(zhì)親和層析, 然后進(jìn)行陽(yáng)離子交換柱層析, 收集各組分進(jìn)行10% SDS-PAGE鑒定, 根據(jù)凝膠電泳結(jié)果收集含有洗脫蛋白的各組分, 最后,用100,000-MWCO蛋白超濾管將含有洗脫蛋白的組分緩沖液替換為蛋白存儲(chǔ)液(50 mmol L-1Hepes,150 mmol L-1KCl, 1 mmol L-1TCEP, 20% Glycerol,pH 7.5)。分裝后液氮速凍, 于?80°C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 Cas9 及Cas9NG蛋白的定量 對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行BSA (bovine serum albumin)粗定量后, 使用BCA蛋白快速測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白精確定量(上海英濰捷基公司), 首先制備蛋白標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋液和BCA工作液, 然后分別取標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品20 μL加入到微孔板中, 之后加入20 μL工作試劑, 充分混勻, 震蕩30 s, 室溫靜置5 min, 用分光光度計(jì)測(cè)量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品在480 nm處的吸光度。最后作出蛋白標(biāo)準(zhǔn)品吸光度相對(duì)于濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn), 根據(jù)待測(cè)樣品在480 nm處的吸光度, 在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出待測(cè)樣品相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量, 從而計(jì)算得出待測(cè)樣品的濃度。

1.2.4 RNA體外轉(zhuǎn)錄 利用引物重疊PCR原理,設(shè)計(jì)引物sgRNA scaffold F、sgRNA scaffold R (表1)擴(kuò)增獲得sgRNA轉(zhuǎn)錄模板, 用2%瓊脂糖凝膠電泳分離后, 回收純化。使用T7 轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京NEB公司)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄, 體外轉(zhuǎn)錄體系為2 μL模板, 15 μL NTP Mix, 3 μL T7 轉(zhuǎn)錄酶, RNase-free H2O補(bǔ)至40 μL。37℃孵育3.5 h。結(jié)束后, 加入2 μL DNase I、8 μL RNase-free H2O消化模板DNA。然后用RNA純化濃縮試劑盒(ZYM公司)進(jìn)行純化濃縮, 分光光度計(jì)測(cè)得濃度后, 通過(guò)10% Urea-PAGE鑒定sgRNA的質(zhì)量。液氮冷凍, ?80℃保存?zhèn)溆谩２捎孟嗤椒ǐ@得高純度esgRNA。

1.2.5ZmWx突變體DNA提取 切取玉米ZmWx突變體種子部分, 充分研磨, 置于1.5 mL EP管中,加入1 mL裂解緩沖液(10 mmol L-1Tris-HCl, 1 mmol L-1EDTA, pH 8.0, 0.1% SDS, pH 8.0), 混勻后于65℃水浴1 h, 10,000×g離心2 min, 小心吸取上清液于一支新的1.5 mL EP管中, 加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24﹕1)(北京酷來(lái)博生物技術(shù)有限公司),充分混勻后, 10,000×g離心10 min, 吸取上清液于一支新的1.5 mL EP管中, 加入0.2 倍體積7.5 mol L-1的醋酸銨和2 倍體積的無(wú)水乙醇沉淀DNA, 10,000×g離心1 min, 棄上清液, 用70%無(wú)水乙醇洗滌2 次,棄上清液, 室溫干燥, 用0.2 mL TE溶液溶解DNA,?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 PCR/RNP酶切 以種子DNA為模板, 設(shè)計(jì)引物ZmWxF、ZmWxR (表1), 通過(guò)PCR擴(kuò)增sgRNA靶標(biāo)兩側(cè)各300～500 bp序列。PCR程序?yàn)?5℃預(yù)變性3 min; 94℃變性25 s, 63℃退火25 s, 72℃延伸30 s,35 個(gè)循環(huán); 72℃總延伸2 min; 4℃保存。將X μg Cas蛋白、X μg esgRNA、2 μL Buf 3.1 (北京NEB公司)和(12-X) μL RNase-free H2O混合均勻, 37℃孵育0.5 h進(jìn)行預(yù)組裝, 加入6 μL PCR產(chǎn)物, 37℃孵育2 h。然后加入2 μL RNaseA, 37℃孵育15 min以消化RNA, 65℃孵育20 min使蛋白質(zhì)變性, 終止反應(yīng)。結(jié)束后進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將ZmWx突變體PCR產(chǎn)物送上海英濰捷基公司測(cè)序, 以驗(yàn)證酶切檢測(cè)結(jié)果。

1.2.7 引物設(shè)計(jì) 本研究所用引物除ZmWxF、ZmWxR由Primer premier軟件設(shè)計(jì)外, 其他引物均由Snapgene軟件設(shè)計(jì), 并委托上海英濰捷基公司合成。引物信息見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRISPR-Cas9、Cas9NG 蛋白原核表達(dá)與純化

構(gòu)建Cas9 與Cas9NG 蛋白原核表達(dá)載體, 載體的主要元件有T7 啟動(dòng)子、Lac 操縱子、His 蛋白純化標(biāo)簽、目標(biāo)蛋白的CDS 序列及T7 終止子等(圖1-A)。通過(guò)親和純化與陽(yáng)離子交換純化兩步法對(duì)原核表達(dá)的Cas9 與Cas9NG 蛋白純化后, 獲得純度較高的Cas9 與Cas9NG 蛋白制品(圖1-B, C)。結(jié)果表明, 收集1 L 誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌可純化約4 mg的Cas9 蛋白, 且經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換柱二次純化獲得的蛋白樣品, 純度顯著提高。經(jīng)過(guò)一次原核表達(dá)及純化所獲得的蛋白制品在產(chǎn)量和純度上可滿(mǎn)足后續(xù)酶切實(shí)驗(yàn)需要。

2.2 RNA 的體外轉(zhuǎn)錄與基于esgRNA/Cas9-RNP和esgRNA/Cas9NG-RNP 檢測(cè)體系的初建立

目前, 應(yīng)用最為廣泛的sgRNA 骨架序列為81 nt(圖2-A), 后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)將sgRNA 骨架序列的poly U位點(diǎn)的第4 個(gè)堿基突變?yōu)镃 以及延長(zhǎng)RNA 雙鏈部分5 個(gè)堿基對(duì)(圖2-B), 可有效提高基因編輯的效率[27-28]。因此, 本研究采用兩種sgRNA 骨架序列進(jìn)行Cas9-RNP 與Cas9NG-RNP 實(shí)驗(yàn)體系的建立。首先, 設(shè)計(jì)體外轉(zhuǎn)錄靶向本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表ZmWx基因編輯位點(diǎn)的sgRNA 或esgRNA 引物, 見(jiàn)表1 所示。通過(guò)PCR 擴(kuò)增獲得體外轉(zhuǎn)錄的DNA 模板后, 利用T7 轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行體外RNA 轉(zhuǎn)錄, 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化后, 經(jīng)10% Urea-PAGE 電泳鑒定。結(jié)果顯示, 經(jīng)過(guò)體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA 條帶大小在100 nt 左右, esgRNA條帶大小在110 nt 左右, 與預(yù)期RNA 條帶大小一致且質(zhì)量較好, 純化后esgRNA 有部分雜帶(圖2-C),推測(cè)可能是由體外轉(zhuǎn)錄DNA 模板回收不純所致。

表1 本研究所用引物Table 1 Primer sequences used in this paper

圖1 Cas9 與Cas9NG 蛋白的原核表達(dá)及純化Fig. 1 Purification of Cas9 and Cas9NG protein

圖2 sgRNA、esgRNA 體外轉(zhuǎn)錄及基于esgRNA/Cas9-RNP 和esgRNA/Cas9NG-RNP 檢測(cè)體系的建立Fig. 2 In vitro transcription of sgRNA and esgRNA, as well as the establishment of cleavage assay via esgRNA/Cas9-RNP and esgRNA/Cas9NG-RNP

以野生型ZmWx種子DNA 為模板, 通過(guò)PCR擴(kuò)增sgRNA 靶標(biāo)兩側(cè)各300～500 bp 序列, 作為酶切底物。然后將 Cas9 蛋白、Cas9NG 蛋白分別與sgRNA、esgRNA 預(yù)組裝為4 種RNP 復(fù)合體, 對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切, 結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),以驗(yàn)證RNP 活性。結(jié)果顯示, sgRNA/Cas9-RNP 或sgRNA/Cas9NG-RNP 在ZmWx位點(diǎn)上不具有酶切活性, 底物 DNA 均沒(méi)有被切開(kāi)。而基于 esgRNA/Cas9-RNP 或基于esgRNA/Cas9NG-RNP 可對(duì)ZmWx靶點(diǎn)底物DNA 進(jìn)行充分酶切, 酶切產(chǎn)生400 bp 與500 bp 兩條DNA 條帶(圖2-D)。

2.3 基于esgRNA/Cas9-RNP 和esgRNA/Cas9NGRNP 檢測(cè)體系的優(yōu)化及其對(duì)不同基因型的區(qū)分

針對(duì)esgRNA/Cas9-RNP 或esgRNA/Cas9NGRNP 兩種突變體基因型檢測(cè)方法進(jìn)行酶切體系的進(jìn)一步優(yōu)化。采用控制變量法分別研究了esgRNA 用量、Cas9 或Cas9NG 蛋白用量和酶切反應(yīng)時(shí)間等對(duì)酶切效率的影響。對(duì)于 esgRNA/Cas9-RNP, 當(dāng)esgRNA 和Cas9 蛋白均為1 μg 時(shí), 酶切反應(yīng)時(shí)間為0.5 h, 可實(shí)現(xiàn)對(duì)500 ng 靶位點(diǎn)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的充分酶切(圖3-A～C)。對(duì)于esgRNA/Cas9NG-RNP,當(dāng)esgRNA 和Cas9NG 均為2 μg 時(shí), 酶切反應(yīng)時(shí)間為4 h, 實(shí)現(xiàn)對(duì)500 ng 靶位點(diǎn)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的充分酶切(圖 3-E～G)。采用優(yōu)化后的 esgRNA/Cas9-RNP 與esgRNA/Cas9NG-RNP 檢測(cè)體系, 分別對(duì)ZmWx基因編輯產(chǎn)生的3 種不同基因型材料進(jìn)行基因型鑒定, 以驗(yàn)證基于 sgRNA/Cas9-RNP系統(tǒng)是否能夠準(zhǔn)確區(qū)分不同的基因型。優(yōu)化后的esgRNA/Cas9-RNP 與esgRNA/Cas9NG-RNP 檢測(cè)體系均具備準(zhǔn)確區(qū)分不同基因型PCR 產(chǎn)物的能力,能夠有效區(qū)分野生型、純合突變體及雜合突變體材料(圖3-D, H)。

圖3 基于esgRNA /Cas9-RNP 及esgRNA/ Cas9NG-RNP 檢測(cè)體系的優(yōu)化Fig. 3 Optimization of cleavage assay via esgRNA /Cas9-RNP and esgRNA/ Cas9NG-RNP

2.4 利用Cas9NG 拓寬檢測(cè)位點(diǎn)范圍

前人的研究結(jié)果表明, Cas9NG 作為spCas9 的變體, 由于替換了PI 功能域中(PAM-interacting, PI)識(shí)別PAM 的第2 和第3 位堿基的氨基酸, 使其不再具有識(shí)別特異性, 從而可以識(shí)別PAM 為“NG”基序, 極大地拓展了基因編輯的范圍[13-14]。因此, 我們探索應(yīng)用Cas9NG 拓寬檢測(cè)位點(diǎn)范圍。

我們?cè)赯mWx編輯位點(diǎn)附近重新設(shè)計(jì)了6個(gè)PAM為“NG”的靶位點(diǎn)(圖4-A), 通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄及凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn), 6 個(gè)esgRNA的分子量大小正確, 轉(zhuǎn)錄效果較好(圖4-B)。應(yīng)用優(yōu)化后的esgRNA/Cas9NG-RNP體系, 將Cas9NG與6 種esgRNA分別組裝成RNP, 對(duì)野生型ZmWx靶位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切。從圖4-C可以看出, 僅有第6 組對(duì)野生型WaxyPCR 產(chǎn)物有酶切活性, 而第 6 組esgRNA 的PAM 為“AGG” 。 結(jié) 果 表 明, 利 用esgRNA/Cas9NG-RNP并不能拓寬ZmWx靶位點(diǎn)檢測(cè)的范圍。

圖4 基于esgRNA/Cas9NG-RNP 檢測(cè)體系對(duì)不同ZmWx 位點(diǎn)的檢測(cè)Fig. 4 Cleavage assay of different targets for ZmWx locus via esgRNA/Cas9NG-RNP

2.5 基于esgRNA /Cas9-RNP 檢測(cè)體系篩選基因編輯突變體

由于esgRNA/Cas9-RNP在檢測(cè)反應(yīng)中RNP用量、酶切反應(yīng)時(shí)間及剪切效率均優(yōu)于esgRNA/Cas9NGRNP, 本研究利用esgRNA/Cas9-RNP系統(tǒng)對(duì)ZmWx基因編輯突變?nèi)后w進(jìn)行基因型檢測(cè)。結(jié)果表明, 對(duì)隨機(jī)選擇的32 個(gè)ZmWx基因編輯材料的靶位點(diǎn)進(jìn)行酶切后,ZmWx野生型、純合突變體及雜合突變體均得到有效區(qū)分(圖5-A)。為進(jìn)一步確定利用esgRNA/ Cas9-RNP進(jìn)行突變體基因型鑒定的可靠性, 我們隨機(jī)選擇3 種基因型的一個(gè)樣品進(jìn)行Sanger測(cè)序。通過(guò)峰圖判讀與序列比對(duì)可知, 測(cè)序結(jié)果與檢測(cè)結(jié)果一致(圖5-B)。

圖5 基于esgRNA/Cas9-RNP 的ZmWx 基因編輯突變體檢測(cè)Fig. 5 Genotyping genome-edited ZmWx mutant via esgRNA/Cas9-RNP

3 討論

建立一種快速、經(jīng)濟(jì)、高效與高通量的突變體基因型鑒定技術(shù)對(duì)作物基因功能鑒定等基礎(chǔ)研究與分子育種研究等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。因此,此類(lèi)技術(shù)具有重要研發(fā)價(jià)值。此前已研發(fā)了多種基因型鑒定方法, 本方法與其相比, 在應(yīng)用范圍與簡(jiǎn)便高效性上具有重要的優(yōu)勢(shì)。以當(dāng)前應(yīng)用較廣的基于限制性?xún)?nèi)切酶的PCR/RE 檢測(cè)和基于DNA 雙鏈錯(cuò)配原理的T7E I 或CEL I 酶切檢測(cè)為例。PCR/RE 方法嚴(yán)重依賴(lài)于突變位點(diǎn)處具有合適的II 型限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn), 識(shí)別位點(diǎn)為6 bp 的限制性?xún)?nèi)切酶約4K DNA 區(qū)間才能有一個(gè)合適的位點(diǎn), 而依賴(lài)CRISPR/Cas9 PAM-NGG 基序的特征, 約16 bp 即能有一個(gè)合適的位點(diǎn), 約為前者的260 倍?；贒NA 雙鏈錯(cuò)配原理的T7E I 或CEL I 酶切檢測(cè)無(wú)法有效區(qū)分純合突變體與野生型, 雙等位基因突變體和雜合突變體,商業(yè)化的酶價(jià)格高昂, 檢測(cè)體系還依賴(lài)PAGE 膠,成本高昂, 實(shí)驗(yàn)體系操作繁瑣。而本研究采用的方法, 經(jīng)過(guò)一次原核表達(dá)及純化獲得的Cas9 蛋白(4 L原核表達(dá)菌液)可用于至少10,000 個(gè)酶切體系的檢測(cè), 不同位點(diǎn)突變體材料的檢測(cè)只需替換與靶位點(diǎn)匹配的sgRNA 即可, 體外轉(zhuǎn)錄1 個(gè)反應(yīng)的esgRNA可用于至少200 個(gè)酶切體系檢測(cè), 合計(jì)1 個(gè)反應(yīng)的成本在1 元以下。整個(gè)檢測(cè)反應(yīng)可在1～3 h 內(nèi)完成,檢測(cè)都是基于簡(jiǎn)易的瓊脂糖凝膠分析, 能夠滿(mǎn)足對(duì)突變體進(jìn)行早期高通量基因型的快速高效分析。此外, 基于sgRNA/Cas9-RNP 的檢測(cè)體系還具有應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn), 不僅適用于由 ZFN、TALEN、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1 等序列特異性核酸酶定點(diǎn)編輯突變體的基因型分析, 還適用于自然變異、人工誘變突變體在特定位點(diǎn)上的基因型分析。

我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)積累的經(jīng)驗(yàn)還表明,ZmWx位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的sgRNA 無(wú)法介導(dǎo)Cas 蛋白活性, 推測(cè)原因是通過(guò)T7 啟動(dòng)子體外轉(zhuǎn)錄靶向ZmWx位點(diǎn)的sgRNA, 在體外酶切緩沖液中不能形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu), 從而不能與Cas 蛋白形成有剪切活性的核糖核蛋白體(RNP)。因此, 將 sgRNA 替換為骨架序列優(yōu)化的esgRNA 是必要的, 該優(yōu)化會(huì)顯著提高檢測(cè)體系對(duì)位點(diǎn)的兼容性, 優(yōu)化的 esgRNA 分別與 Cas9 及Cas9NG 蛋白組裝形成的RNP 復(fù)合體可實(shí)現(xiàn)底物DNA 的充分酶切, 這與前人研究的結(jié)論是一致的,即通過(guò)對(duì)sgRNA 骨架序列優(yōu)化, 可以提高sgRNA結(jié)合靶位點(diǎn)的能力, 從而提高CRISPR-Cas9 的切割效率[27-28]。此外, 本研究發(fā)現(xiàn), 基于 esgRNA/Cas9NG-RNP 的檢測(cè)體系, 除在PAM 為“NGG”序列的6 號(hào)靶位點(diǎn)有較強(qiáng)的剪切活性外, 在PAM 為非“NGG”的靶位點(diǎn)均沒(méi)有檢測(cè)到明顯的剪切活性。推測(cè)原因可能是Cas9NG 蛋白變體對(duì)于靶向位點(diǎn)具有一定的偏好性, 不同的靶位點(diǎn)由于GC 含量的不同、堿基的分布差異, sgRNA 識(shí)別結(jié)合靶位點(diǎn)的能力有所不同, 基于esgRNA/Cas9NG-RNP 的檢測(cè)體系還有待于蛋白活性的進(jìn)一步優(yōu)化。該數(shù)據(jù)對(duì)利用Cas9NG 的NG-PAM 基序特征擴(kuò)大體內(nèi)CRISPR/Cas9 基因編輯設(shè)計(jì)位點(diǎn)自由度具有重要參考價(jià)值。

4 結(jié)論

利用Cas9 或Cas9NG 變體蛋白與sgRNA 核糖核蛋白復(fù)合體(sgRNA/Cas9-RNP 或 sgRNA/Cas9NG-RNP)體外DNA 定點(diǎn)內(nèi)切酶活性, 建立并優(yōu)化了一種簡(jiǎn)便、高效與低成本的基因型分析技術(shù)。esgRNA/Cas9 形成的 RNP 復(fù)合體核酸酶活性比esgRNA/Cas9NG 高, 酶切等量底物需要的RNP 復(fù)合體的量少且時(shí)間更短, 可用于突變體基因型的高通量鑒定。利用esgRNA/Cas9NG 拓寬目標(biāo)靶位點(diǎn)的檢測(cè)數(shù)據(jù)為CRISPR/Cas9NG 活體基因編輯技術(shù)研發(fā)提供了重要參考數(shù)據(jù)。