新型冠狀病毒肺炎的實(shí)驗(yàn)室分子診斷及生物安全

鄧少麗，劉 丁

(陸軍特色醫(yī)學(xué)中心：1.檢驗(yàn)科;2.疾病預(yù)防控制科，重慶 400042)

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是指由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染導(dǎo)致的病毒性呼吸道疾病。我國科學(xué)家從SARS-CoV-2感染者的支氣管、肺泡灌洗液標(biāo)本中檢測出泛β-冠狀病毒核酸陽性，并利用Illumina二代測序和Nanopore三代測序技術(shù)獲得了病毒的全基因序列。隨后，國內(nèi)各種核酸檢測試劑盒相繼面世，主要包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)、恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及快速卡式熒光PCR技術(shù)等。目前，RT-qPCR成為SARS-CoV-2核酸檢測的主流方法。隨著分子診斷的廣泛開展，SARS-CoV-2實(shí)驗(yàn)室分子診斷的靈敏度、特異度及實(shí)驗(yàn)室生物安全等問題成為研究的焦點(diǎn)。進(jìn)一步規(guī)范檢測技術(shù)，確保實(shí)驗(yàn)室生物安全是做好疫情防控工作的前提和保障。筆者根據(jù)多年的實(shí)驗(yàn)室工作經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合抗擊非典型肺炎、埃博拉病毒及COVID-19等工作經(jīng)歷，從以下幾方面進(jìn)行系統(tǒng)闡述，以期為臨床實(shí)驗(yàn)室病原體核酸檢測及生物安全提供參考。

1 病例定義

1.1疑似病例 疑似病例大多有流行病學(xué)史，如在發(fā)病前14 d內(nèi)有武漢市及周邊地區(qū)或其他有病例報(bào)告社區(qū)的居住史或旅行史；發(fā)病前14 d內(nèi)與SARS-CoV-2檢測陽性者有直接接觸史；發(fā)病前14 d內(nèi)曾接觸過來自武漢市及周邊地區(qū)或其他有病例報(bào)告社區(qū)的發(fā)熱或呼吸道感染癥狀患者；聚集性發(fā)病。針對(duì)疑似病例，可對(duì)其進(jìn)行流行病學(xué)史詢問，并結(jié)合臨床表現(xiàn)進(jìn)行綜合分析。臨床表現(xiàn)主要包括：發(fā)熱或呼吸道感染癥狀；具有COVID-19的影像學(xué)特征；白細(xì)胞計(jì)數(shù)正?；蚪档?，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)降低。具有上述流行病學(xué)史中的任何1項(xiàng)，同時(shí)符合臨床表現(xiàn)中的2項(xiàng)者，則可定為疑似病例[1]。

1.2確診病例 具有實(shí)驗(yàn)室分子診斷的病原學(xué)證據(jù)，確認(rèn)為SARS-CoV-2核酸陽性的患者即可診斷為確診病例[2]。實(shí)驗(yàn)室分子診斷主要包括：RT-qPCR檢測SARS-CoV-2核酸陽性；病毒基因測序發(fā)現(xiàn)與已知的SARS-CoV-2高度同源；除鼻咽拭子外，采集其他體液、分泌物進(jìn)行病毒核酸檢測結(jié)果陽性[1]。目前，RT-qPCR檢測病毒核酸是實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)的首選方法。血清SARS-CoV-2特異性IgM抗體和IgG抗體陽性也可作為病原學(xué)證據(jù)，對(duì)病毒核酸檢測進(jìn)行有效補(bǔ)充[3]。

1.3可能病例 除了確診病例和疑似病例的定義外，從實(shí)驗(yàn)室診斷的角度，筆者建議需要設(shè)置可能病例。可能病例可定義為有明確流行病學(xué)史和臨床癥狀，但RT-qPCR檢測結(jié)果陰性。按照國際應(yīng)對(duì)埃博拉病毒、中東呼吸綜合征冠狀病毒的慣例，設(shè)置可能病例可減少核酸檢測假陰性引起的漏診[4]。同時(shí)，建議對(duì)可能病例進(jìn)行SARS-CoV-2核酸重復(fù)檢測。

此外，對(duì)于接觸過COVID-19確診病例，且未進(jìn)行有效防護(hù)的人群，也應(yīng)納入分子檢測中。主要包括以下情況：與確診病例共同生活；對(duì)COVID-19患者提供醫(yī)療診治、護(hù)理時(shí)存在相關(guān)暴露；與確診COVID-19的醫(yī)護(hù)人員一起工作；直接接觸過確診病例的呼吸道分泌物者等。

2 臨床實(shí)驗(yàn)室檢測

鑒于現(xiàn)階段SARS-CoV-2感染仍在流行，為更好地開展核酸檢測工作，各醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在確保生物安全和檢測質(zhì)量的前提下開展RT-qPCR，用于臨床COVID-19診斷。RT-qPCR核酸檢測的適應(yīng)證包括:(1)用于確診疑似病例;(2)篩查有流行病學(xué)史的人群;(3)鑒別診斷發(fā)熱、社區(qū)獲得性肺炎及急性呼吸窘迫綜合征患者等。同時(shí)建議實(shí)驗(yàn)室也應(yīng)該檢測其他呼吸道相關(guān)病原體，如流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒等，但不應(yīng)該因?yàn)樵黾訖z測項(xiàng)目而延誤對(duì)SARS-CoV-2的及時(shí)檢測。

2.1標(biāo)本類型和標(biāo)本采集 SARS-CoV-2檢測的標(biāo)本類型包括呼吸道標(biāo)本、血液標(biāo)本、消化道標(biāo)本[1]。呼吸道標(biāo)本包含鼻咽拭子、口咽拭子、鼻咽抽取物、深咳痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液等，見表1。由于SARS-CoV-2造成的是下呼吸道感染，對(duì)患者而言，深咳痰液和支氣管、肺泡灌洗液等下呼吸道標(biāo)本為核酸檢測首選[5]。但由于臨床取樣困難，目前核酸檢測常用標(biāo)本為鼻咽拭子和口咽拭子，但重癥病例應(yīng)優(yōu)先采集下呼吸道標(biāo)本，如深咳痰液和支氣管、肺泡灌洗液。上呼吸道標(biāo)本的采集十分重要，合格的標(biāo)本是檢出的關(guān)鍵。鼻咽拭子和口咽拭子標(biāo)本應(yīng)分別從鼻咽壁和口咽壁正確采集，以提高檢測陽性率，而不是簡單地從鼻孔或口腔采集。在標(biāo)本收集中，可將鼻咽拭子和口咽拭子置于同一病毒保存液中。為保證病毒核酸的穩(wěn)定性及檢測的靈敏度，建議選用帶塑料桿的合成纖維植絨拭子，不宜使用海藻酸鈣拭子或木桿拭子，因?yàn)槠淇赡芎袦缁畈《竞鸵种芇CR反應(yīng)的物質(zhì)。對(duì)于無癥狀者，誘導(dǎo)排痰或強(qiáng)迫咳痰有助于收集下呼吸道標(biāo)本。在診斷標(biāo)準(zhǔn)中，血液標(biāo)本也可用于檢測SARS-CoV-2，但在臨床檢測中其陽性率低，不建議作為SARS-CoV-2篩查的常規(guī)檢測標(biāo)本。

表1 SARS-CoV-2檢測的標(biāo)本類型、容器與保存液及轉(zhuǎn)運(yùn)條件

在對(duì)有癥狀的確診、疑似或可能病例進(jìn)行常規(guī)標(biāo)本采集時(shí)，采集人員應(yīng)嚴(yán)格按照中國國家衛(wèi)生健康委員會(huì)《新型冠狀病毒肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南》的要求，個(gè)人防護(hù)裝備包括N95及以上的防護(hù)口罩、護(hù)目鏡、連體防護(hù)服、雙層乳膠手套、防水靴套[1]。如果接觸患者血液、體液、分泌物或排泄物時(shí)，應(yīng)及時(shí)更換外層乳膠手套。此外，當(dāng)氣管插管、支氣管或肺泡灌洗、咳痰等氣溶膠暴露時(shí)，應(yīng)加戴正壓頭套或全面型呼吸防護(hù)器。采集人員除需熟練掌握個(gè)人防護(hù)用品的使用技能外，還需經(jīng)當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心或所在醫(yī)療機(jī)構(gòu)的相關(guān)標(biāo)本采集培訓(xùn)。門診和住院患者由所在醫(yī)院醫(yī)護(hù)人員負(fù)責(zé)采集；密切接觸者標(biāo)本由當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心采集。采集過程最好在配有負(fù)壓通風(fēng)系統(tǒng)或每小時(shí)6～12次換氣的常壓隔離單人間內(nèi)進(jìn)行。嚴(yán)格限制參與采集工作的醫(yī)護(hù)人員人數(shù)，避免不必要的接觸。采集人員在接觸患者前后，以及在脫卸個(gè)人防護(hù)用品的每一步驟前后，均應(yīng)嚴(yán)格進(jìn)行手衛(wèi)生。采集結(jié)束后，做好環(huán)境清潔與消毒工作，層流房間空氣自凈30 min，普通房間用紫外線消毒。

2.2標(biāo)本的包裝與運(yùn)輸 對(duì)于醫(yī)療機(jī)構(gòu)的內(nèi)部運(yùn)送，可采用雙層包裝系統(tǒng)。所有標(biāo)本必須先用帶螺旋蓋的防漏塑料主容器包裝，并用75%乙醇擦拭消毒容器表面，再用可重復(fù)、密封、抗壓的二次容器包裝，消毒后安全運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。隨行標(biāo)本中應(yīng)有準(zhǔn)確的標(biāo)簽或條形碼，包括至少2個(gè)標(biāo)識(shí)的患者身份信息，以避免標(biāo)本混亂和污染。對(duì)于機(jī)構(gòu)外的運(yùn)送，則必須按照生物安全的需要，使用三重包裝系統(tǒng)的生物安全運(yùn)送箱；一重包裝與醫(yī)院內(nèi)部運(yùn)送相似，所有標(biāo)本必須用雙層容器包裝；二重包裝容器中應(yīng)裝有相關(guān)的信息表，如申請(qǐng)表格或三重包裝容器中的信息表格；每重包裝都需嚴(yán)格消毒，防止對(duì)外部環(huán)境及人員的污染。標(biāo)本的容器與保存液、轉(zhuǎn)運(yùn)條件見表1。

2.3標(biāo)本處理和核酸提取 標(biāo)本應(yīng)盡快檢測，檢測前建議56 ℃ 45 min滅活。若在24 h內(nèi)檢測，可置于4 ℃保存；若24 h內(nèi)無法檢測，則置于-70 ℃或以下保存。SARS-CoV-2 RNA的提取應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件、試劑盒說明書要求，采用適當(dāng)?shù)娜斯せ蜃詣?dòng)核酸提取方法，主要的核酸提取方法有磁珠法、離心柱法和一步裂解釋放法。從痰液、糞便、鼻咽拭子、口咽拭子或血液中提取核酸，應(yīng)根據(jù)儀器或試劑盒制造商的說明書進(jìn)行。RNA標(biāo)本應(yīng)儲(chǔ)存在-70 ℃或更低的溫度中。

2.4SARS-CoV-2的分子檢測及結(jié)果判讀 建議使用RT-qPCR對(duì)SARS-CoV-2的RNA進(jìn)行分子檢測。推薦選用SARS-CoV-2的開放讀碼框1ab(ORF1ab)、核殼蛋白(N)及包膜蛋白(E)基因作為檢測靶標(biāo)，并提供陽性對(duì)照和內(nèi)標(biāo)。實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)陽性病例需滿足以下2個(gè)條件中的1個(gè)[1]：(1)同一份標(biāo)本中SARS-CoV-2 2個(gè)靶標(biāo)(ORF1ab、N或E)RT-qPCR檢測結(jié)果均為陽性；如果出現(xiàn)單個(gè)靶標(biāo)陽性的檢測結(jié)果，則需要重新采樣，重新檢測；如果重新檢測結(jié)果仍然為單個(gè)靶標(biāo)陽性，則可判定為陽性。(2)2種類型標(biāo)本RT-qPCR檢測結(jié)果同時(shí)出現(xiàn)單個(gè)靶標(biāo)陽性或同種類型標(biāo)本2次采樣檢測中均出現(xiàn)單個(gè)靶標(biāo)陽性的結(jié)果，可判定為陽性。

結(jié)果判讀的第一步是驗(yàn)證內(nèi)控。內(nèi)控陰性表明擴(kuò)增過程失敗，可能是由于存在PCR抑制劑或其他原因。在這種情況下，為了消除抑制作用，需要對(duì)處理后的同一標(biāo)本進(jìn)行重新檢測，包括重新提取或稀釋提取的核酸。在疑似病例中獲得不確定的結(jié)果時(shí)，應(yīng)立即向醫(yī)院的感染控制部門報(bào)告。核酸檢測結(jié)果陰性不能排除SARS-CoV-2感染，需要排除可能產(chǎn)生假陰性的因素，包括標(biāo)本質(zhì)量差，標(biāo)本采集得過早或過晚，沒有正確的保存、運(yùn)輸和處理標(biāo)本，技術(shù)本身存在的原因，如病毒變異、PCR抑制等。若有明確接觸史的病例出現(xiàn)多次陰性結(jié)果，且不應(yīng)排除SARS-CoV-2感染時(shí)，應(yīng)通過采集其他部位的標(biāo)本(特別是下呼吸道標(biāo)本)來進(jìn)一步檢測；也可將標(biāo)本送至其他有資質(zhì)的單位進(jìn)行檢測確認(rèn)[6]。以靶標(biāo)ORF1ab、N為例，SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果判讀流程見圖1。

圖1 SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果判讀流程圖

3 實(shí)驗(yàn)室生物安全

對(duì)于疑似、確診或可能病例的臨床標(biāo)本，診斷工作和RT-qPCR檢測應(yīng)在具有BSL-2設(shè)施的臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。按照《新型冠狀病毒肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南》要求，應(yīng)穿戴適當(dāng)?shù)膫€(gè)人防護(hù)裝備，所有技術(shù)程序都應(yīng)在現(xiàn)有認(rèn)證的Ⅱ類生物安全柜中進(jìn)行，盡量減少氣溶膠和液滴的形成[1]。完成檢測工作后，用75%的乙醇消毒工作空間，去除所有個(gè)人防護(hù)用品。在離開實(shí)驗(yàn)室之前，無論何時(shí)摘除個(gè)人防護(hù)用品，手衛(wèi)生都是必要的。根據(jù)醫(yī)療廢物的立法規(guī)定，所有的醫(yī)療廢物和剩余標(biāo)本都應(yīng)該被丟棄，但是對(duì)于經(jīng)RT-qPCR檢測SARS-CoV-2呈陽性的臨床標(biāo)本，應(yīng)該在滅菌后丟棄。具有潛在傳染性的操作，其稀釋或分離等處理程序應(yīng)在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行[6]。此外，為了防止檢測過程中的污染，為實(shí)驗(yàn)室工作人員提供一個(gè)安全的環(huán)境，應(yīng)考慮包括實(shí)驗(yàn)室布局、檢測流程和生物安全設(shè)施等問題。

綜上所述，COVID-19流行期間實(shí)驗(yàn)室分子診斷對(duì)于疾病確診和密切接觸者的排查顯得尤為重要。各臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)積極制訂應(yīng)對(duì)措施以預(yù)防和控制COVID-19及其他新發(fā)傳染病引起的公共衛(wèi)生事件，進(jìn)一步提升實(shí)驗(yàn)室分子診斷的能力建設(shè)與生物安全。