培養(yǎng)基加氟后滲透壓變化對成釉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)影響的觀察

張樂 王垚 王軍強(qiáng) 曹偉靖 張學(xué)武

成釉細(xì)胞(ameloblast)是牙釉質(zhì)形成的關(guān)鍵細(xì)胞[1]，來源于牙胚內(nèi)釉上皮。成釉細(xì)胞對氟十分敏感，目前認(rèn)為過量的氟作用于成釉細(xì)胞，可造成細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，基質(zhì)分泌異常，功能障礙，繼而引起牙齒的發(fā)育和礦化障礙，導(dǎo)致氟牙癥的形成。

現(xiàn)階段獲得成釉細(xì)胞主要方法來源于體外培養(yǎng)，培養(yǎng)體外細(xì)胞的過程中，培養(yǎng)基的滲透壓需保持在一定的平衡范圍內(nèi)。如果滲透壓發(fā)生變化，平衡被打破會造成細(xì)胞生物學(xué)特性異常。前期，本課題組已成功制備染氟的成釉細(xì)胞[2]，由此發(fā)現(xiàn)體外染氟成釉細(xì)胞的一系列生物學(xué)特性發(fā)生變化。為明確這種變化的真正原因，我們在前期實(shí)驗(yàn)中初步發(fā)現(xiàn)加入氟化鈉、氯化鈉等滲透壓調(diào)節(jié)劑后可使培養(yǎng)基的滲透壓發(fā)生變化，這種變化對成釉細(xì)胞的形態(tài)方面未見明顯影響[3]。本研究將繼續(xù)通過觀察成釉細(xì)胞于不同環(huán)境中的超微結(jié)構(gòu)，明晰滲透壓對成釉細(xì)胞生物學(xué)特性的是否有影響。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料與儀器

健康的出生4 d的SD大鼠(西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)；透射電子顯微鏡(H-7650*，日本);全自動冰點(diǎn)滲透壓儀(ONE-TEN OSMOMETER，德國);50 mOsm/kg 和850 mOsm/kg 氯化鈉標(biāo)準(zhǔn)定標(biāo)液、NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaOH、Na2EDTA·2H2O、溴酚蘭、二甲苯(西安化學(xué)試劑廠);醋酸(天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠);膠原酶、胰酶、明膠(Sigma公司，美國);DMEM(Hyclone公司,美國);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司);甘油(西安交通大學(xué)法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室惠贈)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)組設(shè)置 通過本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)和查閱文獻(xiàn)資料[2-3]，實(shí)驗(yàn)選取0 mg/L氟化鈉，42 mg/L氟化鈉，84 mg/L 氟化鈉3 組。為觀察對比成釉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化情況，通過查閱文獻(xiàn)資料[4]和預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果：分別選取58.5 mg/L(1 mmol/L,324 Pa)氯化鈉、117 mg/L(2 mmol/L,329.2 Pa)氯化鈉、0.05 mg/L甘油(324.3 Pa)、0.09 mg/L甘油為42 mg/L(1 mmol/L,330.1 Pa)和84 mg/L(2 mmol/L,330.8 Pa)氟化鈉組的對照組[4]。

1.2.2 成釉細(xì)胞的體外培養(yǎng) 沿用本課題組已建立的體外培養(yǎng)成釉細(xì)胞方法[5-6]：取斷頸處死四天齡的SD大鼠，用75%的酒精浸泡頭部15 min后分離下頜骨，仔細(xì)剝離雙側(cè)下頜內(nèi)磨牙牙胚將其置于培養(yǎng)皿內(nèi)，PBS清洗兩遍，加入0.25%的 Ⅰ型膠原酶，輕柔剪碎牙胚，使其成d≤1 mm的組織塊，然后置于37 ℃恒溫孵育箱內(nèi)消化2 h。取出培養(yǎng)皿，放入超凈臺，靜置2 min，吸出上層消化液，棄之，PBS清洗，再加入新配置的0.25%胰酶，消化8 min，終止消化，靜置1 min，收集上清，放置于離心管，1 200 r/min離心3 min，棄去上清，將已配置好的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液加入，吹打混懸并均分，分別將其接種于已用明膠包被完成的培養(yǎng)瓶中。

1.2.3 分別于2、4 d時(shí)差別消化。5 d后，觀察待成釉細(xì)胞進(jìn)入生長期、且純度達(dá)到可以電鏡下檢查的要求后，7 組實(shí)驗(yàn)組分別加入含氟化鈉 0 mg/L(空白對照組)、42 mg/L、84 mg/L、氯化鈉 58.5mg/L、117 mg/L、甘油0.05 mg/L、0.09 mg/L的培養(yǎng)基。

1.2.4 48 h后 ①新鮮配制的0.25%的胰酶消化細(xì)胞，1 200 r/min，3 min離心收集細(xì)胞，戊二醛固定細(xì)胞；②細(xì)胞團(tuán)塊移入容器中，4 ℃ PBS漂洗3 次×10 min。4 ℃ 1% 四氧化鋨固定15 min，PBS漂洗3 次；③室溫下于系列丙酮脫水(每次10 min)：50%丙酮1 次,70%丙酮1 次,90%丙酮2 次,純丙酮3 次；④浸透：吸棄脫水劑，加包埋劑，靜置30 min，除去包埋劑，加純包埋劑1 ml，隔夜保存；⑤包埋：用混合包埋劑將成釉細(xì)胞團(tuán)塊注滿，于烤箱烘烤，固化成硬塊；⑥修塊：包埋塊裝在夾具上，顯微鏡下，修塊；⑦切片：先將包埋塊切成厚約1 μm的半薄切片，染色后鏡下觀察成釉細(xì)胞圖像，確定部位位置，作好標(biāo)記，切厚約60 nm的超薄切片，挑片，貼在銅網(wǎng)上；⑧電子染色：行檸檬酸鉛的染色和清洗。涼干觀察。

2 結(jié) 果

本研究使用透射電子顯微鏡觀察各組成釉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示：對照組(圖1)成釉細(xì)胞胞體呈橢圓狀，胞體表面有微絨毛，細(xì)胞核亦呈現(xiàn)不規(guī)則長圓形，大都居于中央，可見1～2 個清晰核仁，核仁大而明顯，核周圍胞漿內(nèi)有可見充足的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體，也可見線粒體和游離的核糖體，含蛋白質(zhì)分泌物，空泡和脂滴，還有清晰的屬上皮細(xì)胞的張力原纖維，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大都無明顯變化，僅個別內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張；42 mg/L (1 mmol/L)氟化鈉組(圖1中F1)成釉細(xì)胞大多體積變小，細(xì)胞連接較松散，個別細(xì)胞水腫，并有死細(xì)胞出現(xiàn)，細(xì)胞核皺縮，部分粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，高爾基體水腫，其余細(xì)胞器無明顯變化，張力原纖維稀疏；84 mg/L(2 mmol/L) 氟化鈉組(圖1中F2)成釉細(xì)胞膜溶解破壞，細(xì)胞核溶解，胞漿，細(xì)胞器溢出，大部分明顯腫脹，可見空泡性變。117 mg/L(2 mmol/L)氯化鈉組(圖2)，0.09 mg/L甘油組(圖3)成釉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)與對照組大致相同。張力原纖維溶解模糊(圖4)，界不清，染色體出現(xiàn)凝集，邊集現(xiàn)象(圖4)，細(xì)胞核碎裂后向包膜邊緣擴(kuò)散，或可形成凋亡小體(圖4)，被溶酶體吞噬，外排。線粒體極度水腫(圖4)，嵴崩解消散，結(jié)構(gòu)模糊。

3 討 論

近年來，國內(nèi)外學(xué)者從多方面對氟牙癥進(jìn)行研究，普遍認(rèn)為氟化物可以引起成釉細(xì)胞增殖、凋亡及蛋白分泌的一系列變化，但具體機(jī)制尚不清楚[7-8]。為直觀發(fā)現(xiàn)氟對體外培養(yǎng)成釉細(xì)胞的影響情況，本課題組前期在培養(yǎng)成釉細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入不同濃度的氟化鈉后發(fā)現(xiàn)氟離子的添加，成釉細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，增殖凋亡均發(fā)生了變化的同時(shí)考慮到氟離子的添加會導(dǎo)致培養(yǎng)基滲透壓的變化，從而懷疑滲透壓的這種改變是否間接干擾了氟對成釉細(xì)胞的影響，即體外培養(yǎng)成釉細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)功能的變化是由于氟離子的直接毒性作用，還是由于氟離子導(dǎo)致滲透壓的變化，間接影響細(xì)胞，有必要進(jìn)一步研究。

圖1 3 組成釉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察Fig 1 Observation of ameloblast ultrastructure of the 3 groups

圖2 117 mg/L氯化鈉組(N2)成釉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察Fig 2 Observation of the ultrastructure of ameloblasts of 117 mg/L sodium chloride group(N2)

圖3 0.09 mg/L甘油組(G2)成釉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察Fig 3 Observation of the ultrastructure of ameloblasts of 0.09 mg/L glycerol group(G2)

圖4 84 mg/L氟化鈉組成釉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察Fig 4 Ultrastructure observation of ameloblasts of 84 mg/L sodium fluoride group

細(xì)胞的生長和存活受到滲透壓十分顯著的影響，尤其對于體外培養(yǎng)細(xì)胞，滲透壓是關(guān)鍵的影響因素[9]。本研究在實(shí)驗(yàn)中將氟化物加入培養(yǎng)基，改變了培養(yǎng)基中溶質(zhì)的總離子濃度，繼而可能會影響培養(yǎng)基的滲透壓。本課題組前期實(shí)驗(yàn)[4]通過冰點(diǎn)滲透壓儀檢測各實(shí)驗(yàn)組滲透壓值，各實(shí)驗(yàn)組顯微鏡下及HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)滲透壓變化對成釉細(xì)胞形態(tài)無明顯影響，染氟成釉細(xì)胞形態(tài)變化與滲透壓的變化無關(guān)，而是由氟離子濃度改變所致。本實(shí)驗(yàn)通過透射電子顯微鏡分別繼續(xù)觀察了對照組，42 mg/L和84 mg/L的氟化鈉組，117 mg/L 氯化鈉組，0.09 mg/L甘油組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)滲透壓的改變對成釉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)無明顯影響。

細(xì)胞膜是細(xì)胞的機(jī)械性和化學(xué)性屏障，同時(shí)參與細(xì)胞的內(nèi)外物質(zhì)交換、運(yùn)動以及生長調(diào)控等；線粒體則是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生能量的主要場所；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與了細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成[10]；高爾基體與細(xì)胞的分泌活動和溶酶體的形成有關(guān)；而來源于上皮細(xì)胞的張力原纖維[11]，是上皮角蛋白中間絲，它們呈連于橋粒的致密束狀。在細(xì)胞連接處能加固細(xì)胞間的連接，在細(xì)胞內(nèi)起支持，保持細(xì)胞韌性和彈性的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)[12]：氟化鈉會引起原代成釉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。過量的氟化物作用于原代成釉細(xì)胞，首先會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,進(jìn)而導(dǎo)致非折疊蛋白反應(yīng)[13]。

本研究于電鏡下發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，42 mg/L 氟化鈉組細(xì)胞大多體積變小，細(xì)胞連接較松散，部分粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，高爾基體水腫，張力原纖維稀疏；84 mg/L 氟化鈉組細(xì)胞膜溶解破壞，細(xì)胞核溶解，胞漿，細(xì)胞器溢出，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)疏松形成空泡，線粒體腫脹嵴消失，張力原纖維溶解模糊，與其他文獻(xiàn)研究[14-15]結(jié)果相同。而與之滲透壓相同的117 mg/L 氯化鈉 0.09 mg/L甘油各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)均與對照組相似，并未出現(xiàn)明顯變化。根據(jù)上述變化可以推測：體外培養(yǎng)成釉細(xì)胞，培養(yǎng)基中隨著氟濃度的增加，成釉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化更明顯。成釉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化主要是由于氟的毒性作用。本課題組將對染氟成釉細(xì)胞生物學(xué)特性繼續(xù)進(jìn)一步的研究。