銀杏外種皮乙醇提取物的抑菌活性

卜程洪，吳 進(jìn)，朱潔林，董云富，張 博*

(1.興義市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 興義 562400； 2.興義市南盤江鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，貴州 興義 562400)

銀杏(GinkgobilobaL.)又名白果，具備獨(dú)特的形態(tài)特征、系統(tǒng)進(jìn)化和分類地位。在銀杏成熟之際，種植者通常將大量剝離的銀杏外種皮棄于荒野或河流，讓其在自然的條件下分化降解，如此不僅危害土壤有益微生物、河中魚蝦，還影響空氣質(zhì)量，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。劉進(jìn)軍等[1]采用新鮮銀杏外種皮的濾液對櫻花樹的蟲害有防治效果，而噴灑的濾液不影響櫻花樹的正常生長。魏艷等[2]利用銀杏外種皮提取物中除去石油醚部分后，得到乙酸乙酯部分，對雜草枝莧幼根生長的抑制達(dá)74.4%，對芽生長抑制達(dá)46.4%，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物為主要除草活性成分。因此，筆者運(yùn)用植物化學(xué)的方法提取制備了銀杏外種皮的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇的萃取物，以期檢驗(yàn)銀杏外種皮提取物對采絨革蓋菌、腐皮鐮孢、禾谷鐮孢、尖孢鐮孢和蕓苔鏈格孢及大腸埃希氏菌、銅綠甲單孢菌、金黃色葡萄球菌和大腸沙門氏菌等病原菌的抑制作用，為銀杏外皮的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試病原真菌采絨革蓋菌、棉腐臥孔菌、腐皮鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、灰葡萄孢菌、蕓苔鏈格孢菌購自中國科學(xué)院微生物研究所中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)；病原細(xì)菌大腸埃希氏菌、大腸沙門氏菌亞種、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌亞種購自中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CFCC)。

1.2 銀杏外種皮提取物不同極性部位的制備

用乙醇超聲輔助提取銀杏外種皮，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀制備浸膏，用蒸餾水加熱溶解，分別用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，分別得到氯仿部分(CHCl3Fr.)、乙酸乙酯部分(EtOAc Fr.)、正丁醇部分(BuOH Fr.)，將水溶液部分置于大孔樹脂AB-8柱中，分別用蒸餾水-40%甲醇、60%甲醇、100%甲醇進(jìn)行洗脫，得到水溶液部分(H2O Fr.)、40%甲醇部分(40% MeOH Fr.)、60%甲醇部分(60% MeOH Fr.)、100%甲醇部分(100% MeOH Fr.)，將不同極性部分制備成浸膏待用。精確稱取適量粗提物，用蒸餾水將粗提物溶解，通過0.22 mm微孔濾膜，配制成BuOH Fr.50 mg/mL、CHCl3Fr.50 mg/mL、EtOAc Fr.50 mg/mL、40% MeOH Fr.50 mg/mL、60% MeOH Fr.50 mg/mL、100% MeOH Fr.40 mg/mL、H2O Fr.100 mg/mL，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 銀杏外種皮提取物不同極性部位抑菌活性的測定

1.3.1 病原真菌生長 參考帶毒平板法(生長速率法)測定[3]。每組重復(fù)3次，以無菌水作為空白對照，多菌靈作為陽性對照。于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天記錄各菌落生長情況，以十字交叉法統(tǒng)計病原菌的生長直徑，分別求出毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)R和半抑制濃度(EC50值)。

1.3.2 病原細(xì)菌的生長 采用十倍稀釋法制備菌懸液和牛津杯法[4]進(jìn)行病原細(xì)菌的生長情況測定，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。測量抑菌圈，計算平均值。抑菌直徑≥20 mm為極敏感“+++”；15 mm≤抑菌直徑<20 mm為高敏“++”；10 mm≤抑菌直徑<15 mm為中敏“+”；抑菌直徑<10 mm為低敏或無效“/”。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物不同極性部位的病原真菌抑制活性

由表1可見，銀杏外種皮提取物對鐮刀菌屬有一定的抑制作用。

2.1.1 采絨革蓋菌 銀杏外種皮各部位粗提物對采絨革蓋菌都具有較好的抑菌效果，CHCl3Fr.對彩絨革蓋菌的抑菌活性最好，EC50為25.3 mg/mL，H2O Fr.的抑菌效果最差，EC50為54.3 mg/mL。

2.1.2 蕓苔鏈格孢菌 BuOH Fr.和EtOAc Fr.對蕓苔鏈格孢菌有較好的抑制效果，其EC50分別為8.1 mg/mL和8.9 mg/mL。而H2O Fr.對蕓苔鏈格孢菌的抑制效果較差，EC50為100.3 mg/mL。

2.1.3 腐皮鐮菌 BuOH Fr.和40% MeOH Fr.對腐皮鐮菌的抑制效果較好，其EC50分別為19.6 mg/mL和23.3 mg/mL。

2.1.4 禾谷鐮孢菌 BuOH Fr.和EtOAc Fr.對禾谷鐮孢菌的抑制效果較好，其EC50分別為13.8 mg/mL和16.3 mg/mL。

2.1.5 尖孢鐮孢菌 BuOH Fr.和H2O Fr.對尖孢鐮孢菌的抑制效果較好，其EC50分別為8.4 mg/mL和10.6 mg/mL。

表1 銀杏外皮不同極性部分的抑制毒力

2.2 提取物不同極性部位的病原細(xì)菌抑制活性

由表2可見，銀杏外種皮粗提物的各部位對銅綠假單胞菌、大腸沙門氏菌亞種、大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌亞種都具有一定的抑菌活性，其抑菌圈均>20 mm，相對敏感度均為+++；其中EtOAc Fr.對大腸埃希氏菌的抑菌圈最大，為(42.33±0.20)mm；其次是BuOH Fr.、EtOAc Fr.和CHCl3Fr.對金黃色葡萄球菌亞種，分別(36.00±2.83)mm、(36.00±0.47)mm、(36.00±2.25)mm。抑菌圈最小的是60% MeOH Fr.對大腸埃希氏菌，抑菌圈為(24.17±0.14)mm。H2O Fr.的樣品濃度為100 mg/mL，其對銅綠假單胞菌、大腸沙門氏菌亞種、金黃色葡萄球菌亞種的抑菌效果與其他藥液部分相比效果較差，而抑菌圈也較小，分別為(29.00±2.83)mm、(27.33±1.41)mm和(30.83±0.47)mm。銀杏外種皮也可加工成飼料，抑制此類細(xì)菌在腸道的滋生。

表2 銀杏外皮不同極性部位對4種病原細(xì)菌的體外抑菌活性

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)通過銀杏外種皮的粗提物對5株病原真菌和4株病原細(xì)菌進(jìn)行抑菌活性測定表明，不同銀杏外種皮粗提物各部分表現(xiàn)出不同的抑菌活性，隨著藥液濃度的增加抑制病原菌生長的效果也越明顯，抑制率也越高。鄧業(yè)成等[5]報道銀杏外種皮的提取物酚酸類物質(zhì)對柿子、水稻、梨、玉米、柑橘、甘蔗、西瓜和香蕉等植物致病的病原菌有抑制作用，半抑制濃度為0.665 7～19.558 0 mg/mL；對芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌等多種病原細(xì)菌的抑制效果較好。這與本試驗(yàn)所得到的對病原菌沒有廣譜性效果的結(jié)果不同，可能是本試驗(yàn)未能針對性的提取銀杏外種皮酚酸類物質(zhì)有關(guān)，或本試驗(yàn)對不同的提取物進(jìn)行溶解時，采用的無菌水溶解有關(guān)。本試驗(yàn)不采用有機(jī)溶劑溶解提取物，是去除有機(jī)溶劑毒害植物，測定真實(shí)水溶性成分的抑菌效果。

陽振等[6]報道銀杏外種皮中銀杏酚酸類是主要的抑菌成分，占外種皮提取物的65%，對于抑菌活性方面有很好的效果。通過抑菌活性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一方面可以為采絨革蓋菌、腐皮鐮菌、禾谷鐮孢菌、尖孢鐮孢菌和蕓苔鏈格孢菌及大腸埃希氏菌、銅綠假單孢菌、金黃色葡萄球菌和大腸沙門氏菌等病原菌的防治提供理論依據(jù)，開發(fā)植物源農(nóng)藥；另一方面為銀杏外種皮的綜合利用和開發(fā)提供新方向，并促進(jìn)我國資源的利用、環(huán)境保護(hù)和生態(tài)和諧。