零熱量甜味劑D-阿洛酮糖的研發(fā)進展

黃擎宇， 徐 錚*， 熊 強， 張 倩， 李克文， 徐 虹

1.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院 材料化學(xué)工程國家重點實驗室，江蘇 南京 211816；2.保齡寶生物股份有限公司，山東 禹城 251200

目前，世界范圍內(nèi)的肥胖、糖尿病、高血壓和高脂血癥等體重過度增加相關(guān)疾病的患病率和發(fā)病率顯著增加，而高脂肪高熱量食品是導(dǎo)致這種情況的主要原因。在中國這一現(xiàn)象尤為嚴重，肥胖患者與糖尿病患者數(shù)量已接近2億，并呈現(xiàn)出低齡化趨勢。在這一環(huán)境下，人們越來越重視食品的安全性和對人體健康的影響。低熱量、具備多種功能的食品因此在市場上越來越受到消費者歡迎，對此類食品的研究與開發(fā)成為了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注重點。D-阿洛酮糖是一種自然界存在極少的稀有糖，由于其對健康的益處，許多團隊陸續(xù)開始對其在功能性食品領(lǐng)域的研究與開發(fā)進行研究。

1 D-阿洛酮糖簡介

1.1 物理化學(xué)性質(zhì)

D-阿洛酮糖(D-psicose/D-Allulose)是一種稀有糖，甜度為蔗糖的70%[1]，作為碳水化合物的不可發(fā)酵組分以及作為農(nóng)產(chǎn)品中的游離糖存在。D-阿洛酮糖為白色粉末狀晶體，溶于水、甲醇、乙醇等，是D-果糖的C-3差向異構(gòu)體(見圖1)，IUPAC名為(3R,4R,5R)-1,3,4,5,6-pentahydroxyhexan-2-one。D-阿洛酮糖化學(xué)式為C6H12O6，摩爾質(zhì)量為180.156 g/mol，熔點為109 ℃，PSA118.22，CAS號551-68-8。安全性方面，D-阿洛酮糖已在2014年通過了美國FDA安全認證，2015年獲得了GRAS的認證[2]。

圖1 D-阿洛酮糖和D-果糖的化學(xué)式

1.2 現(xiàn)有來源

自然界中天然存在的D-阿洛酮糖含量極少，來源于少部分植物和少數(shù)細菌。2006年，香川大學(xué)IZUMORI團隊測定了日常生活中不同食品的D-阿洛酮糖的含量并公布了部分數(shù)據(jù)[3](見表1)。他們在實驗中發(fā)現(xiàn)，各種食品中的D-阿洛酮糖含量與制糖過程中的糖濃度，溫度和加熱時間密切相關(guān)。

表1 不同食品中的D-阿洛酮糖含量[3](μg/g)

1.3 功能性

日本科學(xué)家TAKATA等[4]通過建立并研究神經(jīng)毒素6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamin,6-OHDA)誘導(dǎo)嗜鉻細胞瘤細胞凋亡的體外帕金森氏病模型，發(fā)現(xiàn)D-阿洛酮糖對于細胞凋亡的抑制展示出了特殊效果,說明其可以起到保護神經(jīng)的作用。在治療神經(jīng)變性疾病時，由于D-阿洛酮糖可促進內(nèi)谷胱甘肽的增量調(diào)節(jié)，因而有望作為保護劑進行研發(fā)。

相對其他稀有糖，D-阿洛酮糖能更加有效地清除活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和抑制其產(chǎn)生的能力[5]，對先天免疫系統(tǒng)具有保護作用，這種功能對于防治多種疾病具有潛在的價值。例如D-阿洛酮糖能夠抑制ROS在睪丸組織中產(chǎn)生，從而阻止由di-(2-eth-ylhexyl)phthalate(DEHP)誘導(dǎo)的睪丸損傷，同時對氧化劑介導(dǎo)的睪丸損傷起到保護作用。由于對前炎性細胞活素有抑制作用，D-阿洛酮糖可以使炎性反應(yīng)中斷起到抗炎效果[6]；通過調(diào)節(jié)p38-促分裂原活化蛋白激酶(p38-Mitogen-Activated Protein Kinase)，單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的表達可被D-阿洛酮糖抑制，這在動脈粥樣硬化治療時可以發(fā)揮作用[7]。

D-阿洛酮糖的甜度在相當于蔗糖甜度的70%的同時幾乎不含熱量，在美國被稱為最具潛力的蔗糖替代品。IZUMORI團隊[8]2006年的小鼠實驗表明了相較于攝入其他糖類的小鼠組，攝入D-阿洛酮糖的小鼠血糖水平均比較低，后經(jīng)分析得知D-阿洛酮糖可以通過對脂肪肝酶和腸道α-糖苷酶的抑制，從而降低小腸對糖類的吸收速率來減少體內(nèi)脂肪的積累并抑制血糖濃的上升，可以用于對糖尿?、蛐偷闹委焄9]。在日本自治醫(yī)科大學(xué)的研究人員發(fā)布的一項小鼠實驗的結(jié)果中[10]，他們通過實驗發(fā)現(xiàn)D-阿洛酮糖可以促進“GLP1”的分泌，而GLP1可促進胰島素分泌、抑制食欲，能有效治療糖尿病。此外，HAYASHI和IIDA等人[11]通過臨床試驗結(jié)果證明了日常飲食中添加D-阿洛酮糖能降低餐后血糖水平，以及提高胰島素的敏感性和葡萄糖耐受性，大部分D-阿洛酮糖在小腸中被吸收并通過尿液從體內(nèi)排泄出去。

除了醫(yī)療價值，D-阿洛酮糖的口感和甜度與蔗糖相近，作為一種功能性甜味劑還能夠彌補傳統(tǒng)的甜味劑的不足，可以改善食品的風味、色澤、外觀和口感，具有延長貨架期等作用[12]。添加了D-阿洛酮糖的食品的膠凝度不僅可以得到提高，其風味也能夠被改善。同時D-阿洛酮糖還可以和食品蛋白發(fā)生美拉德反應(yīng)[13]可以形成較好的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，改善食品質(zhì)構(gòu)，并使食品在抗氧化性方面也有所提升[14]。在食品的加工中，利用D-阿洛酮糖與蛋白的美拉德反應(yīng)制成的功能性食品和特醫(yī)食品可對某些特定疾病進行防治，例如預(yù)防由氧化應(yīng)激導(dǎo)致的疾病、抗齲齒等[15]。

D-阿洛酮糖對植物也有一定影響。香川大學(xué)農(nóng)學(xué)研究所的研究人員稱發(fā)現(xiàn)了幾種稀有糖誘導(dǎo)水稻等害蟲防御相關(guān)基因的表達，同時他們正在研究稀有糖對調(diào)節(jié)植物生長的作用，以及用于抗病誘導(dǎo)和生長調(diào)節(jié)的材料的開發(fā)[16]，而D-阿洛酮糖就包含在這些稀有糖中。

2 D-阿洛酮糖的合成生產(chǎn)研究進展

2.1 化學(xué)法制備技術(shù)

阿洛酮糖的研究到今天約有28年的歷史[17]。迄今為止，D-阿洛酮糖的制取有生物合成法和化學(xué)合成法兩種。首先討論的是化學(xué)合成法，在2017年授權(quán)的一項專利(授權(quán)公告號：CN104447888B)[18]中，研究人員主要采用化學(xué)方法，選取價格較為低廉的葡萄糖作為原料，選擇無機材功能料鉬酸鹽作為催化劑，在80 ℃～120 ℃加熱后經(jīng)催化轉(zhuǎn)化、分離提純得到產(chǎn)物D-阿洛酮糖。產(chǎn)物通過有機溶劑法進行降溫結(jié)晶得到的D-阿洛酮糖產(chǎn)品，其含量可達98.5%～99.5%。相較于生物酶法生產(chǎn)D-阿洛酮糖出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化效率低，反應(yīng)慢、耗時長的問題，化學(xué)合成法的優(yōu)勢十分明顯。但化學(xué)合成存在著純化步驟較復(fù)雜，會產(chǎn)生化學(xué)廢料和無價值副產(chǎn)物等問題[19]，同時化學(xué)合成甜味劑甜味往往不夠純正，此法的產(chǎn)物與天然存在的D-阿洛酮糖口感是否存在差距還有待考證。并且化學(xué)合成法的應(yīng)用并不廣泛[20]，D-阿洛酮糖實際上難以化學(xué)合成[21]。

2.2 生物法制備技術(shù)

2.2.1菌種和酶

酶作為催化劑在精細化學(xué)品制造和食品加工等不同領(lǐng)域占有重要地位[22]，當今世界上生產(chǎn)D-阿洛酮糖的主要方法是以酶作為催化劑的生物合成法。在國外，日本香川大學(xué)的IZUMORI, YAMAKITA等人[17]1990年從菊芋假單細胞菌(Pseudomonascichorii)中分離純化得到D-塔格糖-3-差向異構(gòu)酶(D-tagatose 3-epimerase,DTEase)，首次描述了以D-塔格糖等為底物用生物方法合成D-阿洛酮糖的過程,并根據(jù)用于表征細菌的標準試驗中的菌株的結(jié)果將該生物體表征為產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenessp.701 B)。這次的探索象征著D-阿洛酮糖生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)的開始，該轉(zhuǎn)化法也屬于后來提出的Izumoring法[23]。目前，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并表征的可用于D-阿洛酮糖生物法合成的生物催化劑有D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶(D-psicose 3-epimerase,DPEase) 和D-塔格糖-3-差向異構(gòu)酶，并且大多數(shù)情況選擇D-果糖通過這兩種酶催化轉(zhuǎn)化來制取D-阿洛酮糖。已發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生DTE酶的菌種有菊芋假單細胞菌和類紅球細菌[24](Rhodobactersphaeroides)等；DPE酶的來源較多，包括根癌土壤桿菌[25](Agrobacteriumtumefaciens)、解纖維梭菌[26](Clostridiumcellulolyticum)、瘤胃菌[27](Ruminococcussp.)、梭狀芽孢桿菌[28](Clostridiumbolteae)、梭菌屬[29](Clostridiumsp.)和螺旋梭菌[30](Clostridiumbolteae)等。

在使用過程中，酶的保存是極為重要的一環(huán)，能夠延長酶的儲存壽命并保持穩(wěn)定性是將其投入商業(yè)應(yīng)用的基礎(chǔ)。江南大學(xué)的研究人員通過對比不含添加劑的DPE酶與加入一些常用的提高酶穩(wěn)定性的化學(xué)添加劑的DPE酶在15 d和30 d后的活性，得出結(jié)論MnSO4和乙二醇對于提高DPE酶的穩(wěn)定性和儲存有很大的幫助[31]。TSENG等人[32]發(fā)表了關(guān)于來源有Agrobacteriumsp. ATCC 31749的DPE酶研究成果的論文，文中提到他們發(fā)現(xiàn)ATCC 31749產(chǎn)出的DPE酶活性高于來源于根瘤土壤桿菌的DPE酶，除此之外還鑒定出殘留N234作為重要的界面殘基，對酶活性的影響極為顯著。隨著專家學(xué)者們越來越關(guān)注，有關(guān)DPE酶與DTE酶在保存、提高酶活等方面的研究也會成為D-阿洛酮糖研究中的熱點。

2.2.2國內(nèi)外發(fā)展動向

韓國CJ第一制糖株式會社和日本松谷化學(xué)工業(yè)株式會社是當今世界上生產(chǎn)D-阿洛酮糖主要的廠家[21]。松谷化學(xué)工業(yè)[33]主要是利用從不具有植物病原性的節(jié)桿菌(Arthrobactersp.ConnandDimmick)中得到的新型酮糖3-差向異構(gòu)酶催化D-阿洛酮糖和D-果糖之間的互相轉(zhuǎn)化，這與先前相比更適用于工業(yè)化生產(chǎn)。2011年授權(quán)的一項專利中，韓國CJ第一制糖株式會社[34]的研究人員克隆了源自根瘤土壤桿菌的DTE酶并表達，首次證明了只有源自根瘤土壤桿菌ATCC33970的DTE酶具有具有將D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的能力(圖2)。

圖2 簡易工藝流程圖

D-果糖和D-阿洛酮糖之間的轉(zhuǎn)化是可逆反應(yīng)，如果能夠使反應(yīng)平衡朝著生成-阿洛酮糖的方向移動，即可大幅度提高轉(zhuǎn)化率。2008年，韓國世宗大學(xué)Oh團隊[35]實驗發(fā)現(xiàn)，隨著硼酸鹽的加入，平衡逐漸向D-阿洛酮糖方向移動，當硼酸鹽與D-果糖的摩爾比達到0.6時達到最大轉(zhuǎn)化率，約為無硼酸鹽加入時的兩倍。研究人員解釋為由于硼酸鹽對不同糖親和力不同，其對D-阿洛酮糖的親和力要高于對D-果糖，因而與D-阿洛酮糖結(jié)合形成D-阿洛酮糖-硼酸鹽復(fù)合物，且形成的復(fù)合物不參與反應(yīng)。

重組后的大腸桿菌細胞生產(chǎn)效率明顯提高，非常適合用于D-阿洛酮糖的生產(chǎn)。但大腸桿菌是一種潛在病原菌[36]，不是公認的安全菌株，且產(chǎn)物多為包涵體，在食品及醫(yī)藥等行業(yè)的使用受到限制。2016年，Oh團隊在將D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖時嘗試了用GRAS菌株谷氨酸棒狀桿菌作為宿主表達DPEase基因，研究不同pH，溫度，金屬離子和細胞及底物濃度等條件對反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)金屬離子Co2+對提升酶的活力的作用最為明顯。此外，谷氨酸棒狀桿菌經(jīng)過透化后在優(yōu)化條件下進行反應(yīng)，通過Bio-LC系統(tǒng)(Dionex ICS-3000,USA)用電化學(xué)檢測器和CarboPac PA10色譜柱測定單糖濃度。分析得到，10 g/L透性細胞可使750 g/LD-果糖產(chǎn)生235 g/LD-阿洛酮糖，轉(zhuǎn)化率達到31%(w/w)，是非透性細胞的1.4倍[37]。

在國內(nèi)，江南大學(xué)江波團隊[23]在2008年對魚塘淤泥、水樣中富集分離的細菌進行分析篩選，得到一株轉(zhuǎn)化率較高的類紅球細菌(RhodobacterphaeroidesSKO11)，其產(chǎn)率達到6.54%。2011年該團隊以微生物ClostridiumcellulolyticumH10的基因為模板，通過基因合成成功獲得了DTE的編碼基因，并采用1 mmol/L的IPTG在28 ℃下誘導(dǎo)6 h后在大腸桿菌中成功表達[26]。天津工業(yè)生物技術(shù)研究所研究人員柏瑋等人[38]將來源于ClostridiumcellulolyticumH10的DPE基因與根癌土壤桿菌的DPE基因比對發(fā)現(xiàn)兩者相似度為60%，同樣可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖的互相轉(zhuǎn)化。該方法中，經(jīng)過在37 ℃下培養(yǎng)16 h后得到的ClostridiumcellulolyticumH10的基因在枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中進行表達，采用粗提取、親和層析、離子交換色譜三步方法得到純化的重組DPE蛋白，用其在50 ℃催化D-果糖1 h后反應(yīng)達到平衡，D-果糖轉(zhuǎn)化率為27.34%。

D-葡糖糖被廣泛應(yīng)用于制取D-果糖，為了獲得更廣泛的原料來源和降低成本，日本的研究人員在1995年就進行了以D-葡萄糖為底物轉(zhuǎn)化D-阿洛酮糖的實驗，但是轉(zhuǎn)化率只有10%[39]。2016年，我國江波團隊以D-葡糖糖為原料對D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化進行了更徹底的研究[40]。研究人員在Izumoring法的基礎(chǔ)上，把D-果糖與D-葡萄糖偶聯(lián)作為中間體，嘗試從D-葡萄糖中獲得D-阿洛酮糖。 其原理為先將D-葡萄糖通過D-葡糖糖異構(gòu)酶(GIase, EC 5.3.1.5)轉(zhuǎn)化為D-果糖，同時立刻用DPEase將轉(zhuǎn)化出的D-果糖異構(gòu)化為D-阿洛酮糖。研究發(fā)現(xiàn)在pETDuet-Glase/DPEase共表達系統(tǒng)中溫度是影響反應(yīng)的最主要因素，當處于65 ℃～75 ℃時系統(tǒng)高度活躍，相對活性保持在88%以上。當反應(yīng)在最佳條件下達到平衡時，D-阿洛酮糖、D-果糖和D-葡萄糖的平衡比約為3∶7∶6.5[40]。研究人員還指出加入硼酸鹽作為一種有效手段，有望幫助該體系轉(zhuǎn)化率獲得進一步提高。市場上D-葡萄糖比D-果糖更為常見且價格更為低廉，D-葡萄糖作為原料可以大大減少生產(chǎn)成本，這一方法為以D-葡萄糖為原料轉(zhuǎn)化D-阿洛酮糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供了實踐依據(jù)。

3 D-阿洛酮糖的分離純化

以D-果糖為原料的生物法生產(chǎn)D-阿洛酮糖的產(chǎn)物為D-阿洛酮糖和D-果糖的混合物，并且D-果糖占產(chǎn)物的大部分，因此如何從混合物中分離純化出D-阿洛酮糖具有重要意義。

2000年，香川大學(xué)IZUMORI團隊在制取D-阿洛酮糖時為了從混合物中分離出D-阿洛酮糖，選擇了在發(fā)酵D-果糖時使用面包酵母而不使用柱層析。研究人員將反應(yīng)產(chǎn)物在有氧條件下在40 L的罐子中用面包酵母處理24 h后，HPLC圖像顯示D-果糖已被全部降解，再在35 ℃下真空蒸發(fā)使上清液濃縮為糖漿后使用乙醇沉淀純化結(jié)晶，60 d內(nèi)可獲得約20 kg的D-阿洛酮糖晶體。這種方法的優(yōu)點十分明顯，簡單的操作和低廉的成本并可節(jié)省大量勞動力，使得其具有應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)并處理D-阿洛酮糖的潛力[41]。

雖然使用面包酵母的分離方法具有一定優(yōu)勢，但實際情況中例如長時間的細菌污染等問題的影響使其的應(yīng)用仍未普及。目前，模擬移動床(SMB)工藝是世界上工業(yè)生產(chǎn)中分離時常用的手段，其固定相和流動相的有效使用以及操作的連續(xù)性有助于減少溶劑的消耗和促進生產(chǎn)率的提高。韓國仁荷大學(xué)的研究人員使用裝有Dowex 50WX4-Ca2+離子交換樹脂的四柱模擬移動床，基于三角理論設(shè)計并模擬了分離D-阿洛酮糖和D-果糖的SMB過程，最終在穩(wěn)態(tài)下分離出的D-阿洛酮糖純度達到99.36%[42]。該結(jié)果證明了SMB方法(圖3)的實用性，并為工業(yè)大規(guī)模處理含有D-阿洛酮糖混合物的進一步研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

圖3 SMB流程簡圖[42]

離子交換樹脂分離作為制糖工業(yè)中常用的分離方法，江南大學(xué)的研究人員在2011年采用該方法對不同條件下D-阿洛酮糖的分離效果進行了測定，實驗得出進樣量10 mL，柱溫60 ℃，填料體積400 mL，去離子水為流動相，流速1 mL/min時為最佳分離條件，在此條件下可獲得純度為98.3%的D-阿洛酮糖[43]。

4 D-阿洛酮糖應(yīng)用前景

2014年，世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布了《成人和兒童糖攝入量指南》，該指南建議人們對“游離糖”攝入最好不超過總能量攝入的5%[44]，而這里所指的“游離糖”即傳統(tǒng)甜味劑如蔗糖、果糖等。2015年，我國甜味劑年產(chǎn)量由2010年的9.3萬噸達到了15.4萬噸，每年都在穩(wěn)定增長。與此同時，新型甜味劑在2016年也已經(jīng)占據(jù)了市場規(guī)模的約82%。因此，具有特殊功能，有益健康的D-阿洛酮糖有著極為廣闊的前景。

D-阿洛酮糖對于食品的風味、色澤、外觀、口感進行改善的作用，可以用于冰激凌，巧克力等一些誘人但易發(fā)胖的食物中，一方面保證口感的同時降低熱量減少發(fā)胖的擔憂，另一方面可增加食品的銷量；也可以代替薯片，口香糖等日常零食中的阿斯巴甜，做到更加安全衛(wèi)生，并減少食品的加工和貯藏中的氧化損失[45]。除了日常食品中可加入D-阿洛酮糖外，將其做成特醫(yī)食品也是很好的選擇，針對糖尿病人、肥胖癥患者等人群，做成的食品可以幫助抑制血糖升高和減少脂肪在身體內(nèi)的積累。D-阿洛酮糖對于神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用使其可以作為保護劑制成神經(jīng)保護類藥物、保健品等；同時在清除ROS、抗齲齒和應(yīng)對氧化應(yīng)激導(dǎo)致的疾病中的突出表現(xiàn)令其也具有被開發(fā)成藥物的潛力。此外，D-阿洛酮糖對于植物的特殊作用，例如防蟲害等，如果在日后能夠研究徹底并制造出對人類和環(huán)境都有利的農(nóng)業(yè)材料也將具有重大意義。“民以食為天,食以安為先”，在食品安全日漸突出的今天，低熱量、具備多種功能的食品會逐漸成為人們的主要食品。D-阿洛酮糖作為一種出色的功能性甜味劑，必定可以在未來的食品等行業(yè)發(fā)揮巨大作用，為改善人民生活水平做出貢獻。