鏈球菌非編碼小RNA研究進(jìn)展

呂澤軒， 宋 馨， 劉欣欣， 夏永軍， 艾連中， 熊智強

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海 200093

鏈球菌屬是一類常見低GC含量的革蘭氏陽性細(xì)菌，通常是球形或卵形細(xì)胞，具有發(fā)酵、無氧/厭氧、不運動、過氧化氫酶陰性和無孢子形成等特征，大部分菌株具有低致病性。目前從動物和人類的口腔、呼吸道、皮膚和皮膚表面以及土壤和植物等各種環(huán)境中至少發(fā)現(xiàn)55種鏈球菌[1]。根據(jù)其溶血特性，鏈球菌被分為三類：(I)α-溶血型鏈球菌[2]，如變形鏈球菌; (II)β-溶血型鏈球菌[3]，主要包括無乳鏈球菌和化膿性鏈球菌; (III)γ-溶血型鏈球菌，也稱為非溶血性鏈球菌，通常沒有致病性[4]。部分鏈球菌可同時感染人類和動物，如肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌和無乳鏈球菌是可導(dǎo)致急性感染的人類病原體。目前大量的非編碼小RNA(Small non-coding RNA, sRNA)在革蘭氏陽性細(xì)菌中被預(yù)測并驗證，但對鏈球菌sRNA的研究主要集中在毒力調(diào)節(jié)相關(guān)，對其他代謝途徑和生理功能的調(diào)控研究報道較少。

1 細(xì)菌sRNA

作為一類重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，細(xì)菌中存在的sRNA長度為40-500個核苷酸(nt)，通常不會翻譯成蛋白質(zhì)[5]。sRNA從位于開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)之間的基因間區(qū)(Intergenic Region，IGR)或5′和3′端非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)修飾中開始轉(zhuǎn)錄[6]。在轉(zhuǎn)錄后水平sRNA與mRNA分子互補配對或與相應(yīng)蛋白質(zhì)分子相互作用，從而使細(xì)菌對環(huán)境脅迫的響應(yīng)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[7, 8]。當(dāng)外部環(huán)境變化時，雖然某些基因的轉(zhuǎn)錄可能會停止，但sRNA可以通過快速調(diào)節(jié)已經(jīng)轉(zhuǎn)錄到細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行翻譯來響應(yīng)[9, 10]。大多數(shù)功能性sRNA通過反義RNA形式與靶向mRNA特異性結(jié)合來調(diào)控靶基因的表達(dá)。目前已發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌sRNA常被作為響應(yīng)外界環(huán)境壓力的調(diào)節(jié)元件，在細(xì)胞內(nèi)的生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。

因sRNA自身特性，很難通過實驗將其識別。首先，sRNA長度小且自身無法編碼蛋白質(zhì)，因此通過單核苷酸突變難以抑制它。其次，sRNA無法翻譯成蛋白質(zhì)，僅通過識別ORF則無法獲得其序列。因此，通常選用生物信息學(xué)預(yù)測與實驗驗證相結(jié)合的方法來預(yù)測并鑒定細(xì)菌sRNA及其靶基因。生物信息學(xué)方法主要是根據(jù)序列長度、堿基匹配、RNA二級結(jié)構(gòu)和序列保守性及其位置來預(yù)測細(xì)菌sRNA的靶標(biāo)。當(dāng)前用于預(yù)測sRNA靶基因的軟件有CopraRNA[12, 13]、sRNATarBase[14]、IntaRNA[15]、RNAPredator[16]、RNAhybrid[17]、sTarPicker[18]、RNAup[19]和TargetRNA2[20]。sRNA靶基因驗證已有多種實驗方法，目前遺傳方法、親和力技術(shù)、免疫共沉淀法和微陣列技術(shù)被廣泛應(yīng)用。此外，ribosome profiling(Ribo-seq)是最近開發(fā)可同時確定體內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的一種方法。Wang等[21]通過Ribo-seq驗證了RyhB(來自大腸桿菌的一種調(diào)節(jié)鐵利用的sRNA)的已知靶基因，還發(fā)現(xiàn)了許多RyhB新的靶標(biāo)。

隨著細(xì)菌中越來越多的sRNA被鑒定，反式和順式sRNA的調(diào)控機制逐漸被闡明。反式sRNA在Hfq蛋白(RNA伴侶蛋白)的幫助下，與正在翻譯的mRNA的核糖體結(jié)合位點(ribosome binding site，RBS)區(qū)域堿基互補，形成二級結(jié)構(gòu)，阻止了核糖體的結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯抑制(圖1-A-a)。反式sRNA與靶mRNA堿基互補后，涉及靶mRNA降解的RNaseE可以特異性地作用于富含AU的單鏈RNA上，同時降解靶mRNA和sRNA(圖1-A-b)。順式編碼sRNA可以在Hfq的幫助下直接與目標(biāo)mRNA進(jìn)行嚴(yán)格的堿基配對形成雙鏈結(jié)構(gòu)，從而增加mRNA的穩(wěn)定性，保護(hù)mRNA不受RNase E的降解(圖1-B)。細(xì)菌sRNA可以通過調(diào)節(jié)細(xì)菌的毒力來響應(yīng)生長條件的變化，使細(xì)菌適應(yīng)生存環(huán)境變化[22]，還可以通過調(diào)節(jié)群體感應(yīng)系統(tǒng)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)表達(dá)來控制細(xì)菌密度[23]。在生長環(huán)境缺乏營養(yǎng)的情況下，細(xì)菌sRNA(如CsrB和CsrC)可以在抗?fàn)I養(yǎng)脅迫中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[24, 25]。sRNA在細(xì)胞代謝中微量元素也不可或缺，可以調(diào)控細(xì)菌中微量元素的相對平衡。例如sRNA RyhB調(diào)節(jié)大腸桿菌中Fur(鐵吸收調(diào)節(jié)因子)和福氏志賀菌中的YdeP(負(fù)責(zé)酸度的調(diào)節(jié))[26]的基因表達(dá)。除調(diào)節(jié)耐酸性外，sRNA也可以調(diào)節(jié)溫度[27]和氧氣壓力[28, 29]等其他環(huán)境壓力。相同sRNA在不同細(xì)菌中可能具有不同的調(diào)控機制，導(dǎo)致其多種功能。

圖1 反式和順式sRNA調(diào)控機制

2 sRNA在鏈球菌中的生物學(xué)功能

2.1 化膿性鏈球菌(S. pyogenes)

化膿性鏈球菌是一種可以引起表面感染(膿皰瘡和咽炎)或全身性疾病(壞死性筋膜炎和中毒性休克)的細(xì)菌病原體?；撔枣溓蚓幸谚b定出sRNA，大多數(shù)都與毒力調(diào)節(jié)有關(guān)(表1和表2)。

2.1.1sRNA FasX

FasX是一種可影響蛋白質(zhì)(例如鏈激酶)的表達(dá)并將纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶的sRNA(～200 nt)[48]。FasX屬于fasBCAX操縱子 (fibronectin/fi-brinogen binding/haemolytic activity/streptokinase reg-ulator)，它包括編碼兩個組氨酸激酶(FasBC)和一個反應(yīng)調(diào)節(jié)子(FasA)的基因。FasX通過(I)穩(wěn)定skamRNA(編碼鏈激酶，毒力因子)來增強鏈激酶的表達(dá)、(II)與控制菌毛生物合成的mRNA堿基配對，使mRNA不穩(wěn)定來調(diào)節(jié)菌毛的生物合成和粘附和(III)抑制cpamRNA(編碼pilin蛋白)的翻譯[49-52]這三個步驟影響毒力因子的表達(dá)。

表1 鏈球菌中的sRNA概覽

*NB, northern blots; qRT-PCR, quantitative reverse transcription PCR

表2 鏈球菌中已研究的sRNA及靶基因功能概覽

2.1.2sRNA Pel/sagA和RivX

Pel/sagA(pleiotropic effect locus/streptolysin-associated gene A，～450nt)調(diào)節(jié)化膿性鏈球菌中的M及其相關(guān)蛋白并編碼streptolysin S(毒力因子，SLS)。CcpA(catabolite control protein A)、CovRS/CsRS(two-component regulatory systems，TCS)、LuxS(毒力因子)、Mga(multiple gene activator)、Nra(regulate pilus gene transcription)和RopB/Rgg(Rgg-like transcriptional regulator)多種轉(zhuǎn)錄因子均可抑制Pel的表達(dá)。此外，Pel的表達(dá)還受FasX抑制，在氨基酸缺乏時還可被CodY(pleiotropic repressor)、Irr(編碼雙組分系統(tǒng)Ihk-Irr)和SLS激活[30]。RivX衍生自轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子RivR的mRNA，有三個5′端可供選擇，可形成189、237和289 nt長的sRNA。Mga控制emm(編碼M蛋白)，C5a肽酶(C5a peptidase)和speB(編碼半胱氨酸蛋白酶)的表達(dá)，RivR和RivX均能正向調(diào)節(jié)Mga，因此可以激活毒力相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)[30]。

2.1.3sRNA MarS

新體制運行以來，省軍區(qū)系統(tǒng)總體呈現(xiàn)向好向上的發(fā)展勢頭，但工作機制不順暢、職責(zé)分工不明晰等問題仍然客觀存在，一定程度上抑制了新體制活力，影響制約了省軍區(qū)系統(tǒng)建設(shè)發(fā)展。

PAPPESCH等[32]在GAS M49591中報道了一種新型sRNA MarS (mga-activating regulatory sRNA)，與mgamRNA的5′UTR相互作用。它可以調(diào)節(jié)Mga依賴性毒力因子的表達(dá)，并影響莢膜的形成與透明質(zhì)酸的生物合成，從而提高菌株毒力。與FasX調(diào)控化膿性鏈球菌定植方式不同，MarS通過增強細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合表面蛋白(M protein、fibronectin-binding protein F1)的表達(dá)和刺激夾膜多糖(CPS)的合成而促進(jìn)粘附，同時抑制細(xì)菌的傳播。

2.2 肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)

肺炎鏈球菌是一種條件致病菌，可導(dǎo)致感染、敗血癥、腦膜炎和心內(nèi)膜炎等多種人類疾病，也是造成肺炎病人死亡的主要原因[53](表1和表2)。

2.2.1sRNA F20和F32

sRNA F20(srn157)和F32(tmRNA)主要與肺炎鏈球菌的毒力調(diào)節(jié)有關(guān)。F20和F32的缺失突變株均可減少肺炎鏈球菌對鼻咽或內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和侵襲，使其不適于在鼻咽和肺部環(huán)境下存活。在F20和F32缺失突變菌株中，許多蛋白質(zhì)的基因表達(dá)譜和豐度均發(fā)生了顯著變化。基于蛋白質(zhì)組學(xué)分析，ACEBO等[36, 54]發(fā)現(xiàn)在F20缺失突變株中嘌呤代謝顯著下調(diào)，但DNA合成和修復(fù)途徑顯著上調(diào)。因此，F(xiàn)20缺失對細(xì)菌毒力衰減具有多效性作用。KUMAR等[54]報道，F(xiàn)32突變株抑制了乳糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)等代謝途徑。F32突變體對細(xì)菌的致病性有重要影響，說明F32與細(xì)菌應(yīng)激反應(yīng)和致病性缺陷有關(guān)，并且在反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(tmRNA/SmpB system)中起著核心作用[55-57]。但目前這兩個sRNA與目標(biāo)基因之間的具體調(diào)控機制尚未闡明。

2.2.2csRNA(cia-dependent small sRNAs)

csRNAs是鏈球菌中CiaR(Cia，Competence induction and altered cefotaxime susceptibility)調(diào)節(jié)的sRNA家族[58]。CiaR是CiaRH雙組分系統(tǒng)(two-component regulatory systems，TCS)的響應(yīng)調(diào)節(jié)因子，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)β-內(nèi)酰胺敏感性、細(xì)菌素生物合成、細(xì)菌毒性和自溶作用。通過從14種鏈球菌菌株的基因組中尋找CiaR激活的啟動子，揭示了51個長度為51-202 nt的csRNA，可分為40種不同類型[59]。在這些csRNA中，有5個肺炎鏈球菌csRNA，即csRNA1-5，是由CiaR調(diào)節(jié)子中ccnA-E(cia-controlled non-coding RNA，ccn)轉(zhuǎn)錄而來。HALFMANN等[58]報道了csRNA4和csRNA5參與肺炎鏈球菌R6的固定相自溶(stationary-phase autolysis)。微陣列分析(microarray analysis)發(fā)現(xiàn)，csRNA1的失活表明其對鄰近基因mRNA的順式調(diào)控作用，也表明csRNA1在D39菌株中以共轉(zhuǎn)錄的形式存在[39]。但敲除或過表達(dá)csRNA1不影響細(xì)胞生長、應(yīng)激反應(yīng)、整體轉(zhuǎn)錄和毒力。

2.3 變形鏈球菌(S. mutans)

2.3.1sRNA L10-leader

XIA等[60]預(yù)測出334個sRNA，并驗證L10-Leader的功能。L10-Leader在酸性環(huán)境中上調(diào)，表明L10-Leader與靶mRNA的結(jié)合可能增強了靶mRNA的穩(wěn)定性并促使其翻譯。這使細(xì)胞能夠快速適應(yīng)酸性環(huán)境，并確保在各種環(huán)境脅迫下DNA正確匹配。但L10-Leader在酸性條件下具體的調(diào)控機制尚未闡明。

2.3.2sRNA133474

ZHU等[41]發(fā)現(xiàn)變形鏈球菌UA159和其他臨床分離菌株在不同pH環(huán)境(pH=5.5和7.5)中，存在9個與耐酸性相關(guān)的sRNA。其中，sRNA133474在pH=5.5時顯著下調(diào)。研究表明，變形鏈球菌雙組分系統(tǒng)中的liaS、liaR、comE、covR和ciaRmRNA與調(diào)節(jié)變形鏈球菌耐酸性相關(guān)，而sRNA133474通過抑制liaR、ciaR和covRmRNA的表達(dá)來調(diào)節(jié)變形鏈球菌的耐酸性。

2.4 豬鏈球菌(S. suis)

豬鏈球菌2型菌株主要可以引起豬的各類疾病，也能直接感染人體導(dǎo)致聽力喪失、腦膜炎和敗血性休克[62]。ZHANG等[43]在豬鏈球菌2型 P1/7(參考株)、98HAH33(高毒力分離株)和05ZYH33分離菌株中使用RNA-sequencing預(yù)測了56個sRNA，部分sRNA與細(xì)菌毒力和核糖開關(guān)(riboswitch)有關(guān)。三種菌株中都檢測到sRNA rliD和RatA，另外98HAH33和05ZYH33菌株含有sRNA cspA和rli38。sRNA rss04已被證實可抑制P1/7中莢膜多糖(CPS)的生物合成[44]，從而增強豬鏈球菌2型菌株在小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和侵襲能力。此外，rss04還可以通過調(diào)節(jié)CcpA和LuxS來影響生物膜的形成和CPS的生物合成[63-65]。但目前尚未具體描述sRNA的作用機理(表1和表2)。

3 鏈球菌sRNA調(diào)控是否依賴Hfq蛋白？

Hfq(也稱為HF-1)是一種RNA伴侶蛋白，廣泛存在于革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌中，在大腸桿菌Qβ噬菌體RNA復(fù)制時所需的重要宿主因子[65]。Hfq具有至少三個不同RNA結(jié)合表面，是一種環(huán)狀同源六聚體蛋白[6]。生物信息學(xué)和晶體結(jié)構(gòu)分析表明，Hfq與真核生物中的Sm和類Sm(LSm)蛋白具有高度同源性，因此也稱為類Sm蛋白[66, 67]。在革蘭氏陰性細(xì)菌中，sRNA和目標(biāo)mRNA相互作用必需Hfq的參與[68-70]。例如，在大腸桿菌中Hfq是sRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的核心。盡管sRNA調(diào)控對Hfq的需求取決于多種因素，但Hfq可促進(jìn)大多數(shù)細(xì)菌sRNA與目標(biāo)mRNA的配對，并參與調(diào)節(jié)RNA的翻譯加工、穩(wěn)定性和多聚腺苷酸化[71]。

雖然部分革蘭氏陽性細(xì)菌中也存在Hfq同源蛋白，但迄今為止革蘭氏陽性細(xì)菌中已知依賴Hfq的sRNA，僅報道單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的LhrA[72, 73]。根據(jù)比較基因組學(xué)分析，在已知的鏈球菌中尚未發(fā)現(xiàn)Hfq及其同源蛋白[74]。因此，我們認(rèn)為鏈球菌sRNA調(diào)控不依賴Hfq及其同源蛋白的參與。

4 存在問題與展望

盡管在鏈球菌中已經(jīng)預(yù)測并鑒定了一些sRNA，但目前大部分鏈球菌sRNA研究集中在對化膿性鏈球菌FasX、Pel、RivX和MarS及肺炎鏈球菌F20和F32等毒力調(diào)控。在鏈球菌中對響應(yīng)pH，氧氣和營養(yǎng)素等環(huán)境變化的sRNA研究非常有限。此外，由于缺乏對作用方式和靶標(biāo)鑒定的研究，目前對鏈球菌中sRNA調(diào)控的認(rèn)識有限。大量其他細(xì)菌中已報道的sRNA及其調(diào)節(jié)機制也尚未在鏈球菌中證實。因此，鏈球菌中還存在大量的未知sRNA亟待研究。

sRNA介導(dǎo)的基因抑制是利用天然sRNA為骨架，合理設(shè)計人工合成sRNA，使細(xì)胞在染色質(zhì)基因不被改變的情況下實現(xiàn)基因抑制。此技術(shù)已廣泛應(yīng)用于大腸桿菌[75]和枯草芽孢桿菌[76]等模式菌株的代謝工程中。人工合成sRNA已應(yīng)用于枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽性細(xì)菌，但能否應(yīng)用于鏈球菌的基因調(diào)控，例如能否用于鏈球菌中改善胞外多糖等各種天然產(chǎn)物的生物合成？盡管目前對鏈球菌sRNA人工設(shè)計還存在疑問，但通過對sRNA及其調(diào)控的深入研究，我們相信鏈球菌sRNA必將能夠作為一種簡單、有效的新型代謝工程和合成生物學(xué)遺傳工具。