響應面法優(yōu)化多層滴丸中長雙歧桿菌R175活菌數(shù)檢測方法

劉 峰， 馬 俊

深圳萬和制藥有限公司，廣東 深圳 518107

長雙歧桿菌是嬰兒、成人、老人腸道菌群中最普遍存在的雙歧桿菌[1，2]。盡管腸道菌群的組成可能隨著宿主飲食結構的變化發(fā)生改變，但一些特定的長雙歧桿菌卻可以在宿主腸道內(nèi)持續(xù)的存在[3，4]。它具有防治便秘[5]、抑制腸道致病菌[6]、調節(jié)腸道菌群、降低膽固醇[7]、促進營養(yǎng)物質的消化吸收[8]、延緩衰老[9]和增強機體免疫活性[10，11]等生理功能。

盡管雙歧桿菌不同菌株的耐受性有很大差異，雙歧桿菌屬對低pH值還是表現(xiàn)出高度的敏感性[12]。MASCO L等[13]指出，長雙歧桿菌在pH值為3的條件下處理1 h即開始大量減少； MAINVILLE I等[14]指出，動物雙歧桿菌的耐受性要明顯優(yōu)于長雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌。因此動物雙歧桿菌最先在歐洲被用于生產(chǎn)乳制品[13,15]。

雙歧桿菌已被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、飼料等各個領域。然而，長雙歧桿菌對生存環(huán)境要求苛刻，并且不能耐受人體消化道環(huán)境，難以保障足夠的活菌數(shù)到達人體腸道定植[15]。

滴丸是固體或液體藥物與適宜的基質加熱融化、乳化或混懸于基質中，再滴入不相混溶、互不作用的冷凝液中，由于表面張力的作用使液滴收縮冷卻成小丸狀的制劑[16]。多層滴丸是將藥物有效成分放在最內(nèi)層，并包括覆蓋最內(nèi)層的內(nèi)皮層，以及覆蓋該內(nèi)皮層構成的三層或三層以上的具有一定硬度的無縫膠囊制劑。最內(nèi)層包含一種油相載體，可以將活菌菌粉均勻分散；內(nèi)皮層是以固化油為主要成分的內(nèi)皮膜，可以防止水分進入內(nèi)層；外層是蛋白質類的外皮膜，具有物理硬度，滴丸不易變形。

在《中國藥典》的微生態(tài)活菌制品總論中，只有膠囊劑和粉劑的檢測方法，尚未列出其它不同制劑形式的微生態(tài)活菌制品的活菌數(shù)檢測方法，更無滴丸這類產(chǎn)品的檢測手段。而多層滴丸采用多種不同的材料將長雙歧桿菌層層包裹，在進行活菌數(shù)檢測的時候，使用常規(guī)的方法(中國藥典法、國標GB4789.35、國際標準ISO29981)都無法將其從復雜的成分中釋放出來，也就無法準確檢測其活菌數(shù)，為此我們開發(fā)了一項檢測方法來解決這個問題。

1 材料和方法

1.1 材料

多層滴丸(自制)，長雙歧桿菌菌粉R175(商業(yè)購買)。

1.2 主要儀器和試劑

均質機(IKA T25D S25)， 高壓滅菌鍋(Yamato SN310C)，天平(Sarorius SQP)，天平(Sarorius MSA 224-CE)，天平(Sarorius BSA224S)，超凈工作臺(蘇靜安泰 SW-CJ-1FD)，厭氧工作站(SHELLAB BACTRON EZ-2), TOSP Agar(Merck Millipore 100043), Mitsuoka’s buffer (根據(jù)配方自行配制)。

1.3 現(xiàn)有方法對多層滴丸中長雙歧桿菌R175活菌數(shù)的檢驗

采用三種常規(guī)方法，分別是《中國藥典》中的微生態(tài)活菌制品活菌數(shù)測定法，《食品安全標準》中的GB4789.35以及國際標準化委員會的標準ISO29981。

1.4 多層滴丸樣品前處理方法的單因素考察

多層滴丸中長雙歧桿菌包裹在最內(nèi)層，需要前處理使其從滴丸中釋放出來。我們對其采用37 ℃水浴后，再恒溫均質的處理方式：稱取149 mL Mitsuoka’s buffer，水浴使其溫度恒定在37 ℃，然后加入1 g多層滴丸樣品，繼續(xù)水?。凰『?，對含有多層滴丸的Mitsuoka’s buffer進行37 ℃恒溫均質處理。前處理共考察三個單因素，分別是水浴時間，均質速度和均質時間。

1.5 梯度稀釋、涂布培養(yǎng)和計數(shù)

取1 mL前處理后的多層滴丸樣品加入9 mL Mitsuoka’s buffer，反復吹打混勻，繼續(xù)10倍梯度稀釋至合適的稀釋度，取50 μL涂布在TOSP固體培養(yǎng)基(不含莫匹羅星鋰)，每個稀釋度3個板，37 ℃，40 h～44 h，厭氧倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)結束后，取菌落數(shù)在30～300個菌落的平板進行計數(shù)，并據(jù)稀釋度計算出每克樣品中含有的活菌數(shù)。

1.6 檢出率

本方法中檢出率是指多層滴丸樣品中檢測到的長雙歧桿菌R175活菌數(shù)占加入的長雙歧桿菌R175活菌數(shù)的百分比。

2 結果

2.1 現(xiàn)有方法對多層滴丸中長雙歧桿菌R175活菌數(shù)的檢驗

這三種方法是比較常用的檢測雙歧桿菌活菌數(shù)的方法。GB4789.35是食品中乳酸菌活菌數(shù)的檢測方法。多層滴丸屬于固體樣品，GB4789.35中對固體樣品的前處理方法為樣品10倍稀釋后，8 000 r/min～10 000 r/min均質1 min～2 min，或用拍擊式均質器拍打1 min～2 min，用上述方法處理后的多層滴丸樣品，分散性差并有抱團現(xiàn)象，只有少量雙歧桿菌從多層滴丸中釋放出來，檢測到的活菌數(shù)不足添加量的1%。ISO29981是乳品中雙歧桿菌活菌數(shù)的檢測方法，對樣品的前處理方法是振蕩；中國藥典中的微生態(tài)制劑只有膠囊劑和顆粒劑兩種劑型，前處理方法是對10倍稀釋的樣品充分搖勻。采用這三種處理方法，很難使雙歧桿菌活菌從具有一定硬度和無縫包裹的多層滴丸中釋放出來，檢出率極低。

表1 現(xiàn)有三種方法對多層滴丸中長雙歧桿菌R175活菌數(shù)的檢驗結果

2.2 單因素實驗

2.2.1不同水浴時間對檢出率的影響

因多層滴丸樣品的壁材和溫度有關，基于壁材熔點及考慮不影響長雙歧桿菌存活的溫度條件，本實驗對樣品處理的水浴溫度固定為37 ℃，水浴后再進行均質，考察了不同水浴時間對檢出率的影響，實驗參數(shù)及結果見表2。

表2 不同水浴時間對多層滴丸樣品檢出率的影響

從表1可以看出，多層滴丸樣品采用現(xiàn)有三種前處理方法，雙歧桿菌被包裹在多層滴丸中，無法釋放，基本檢測不到活菌。從表2可以看出，經(jīng)過水浴和均質，才可能檢測到其包裹的活菌。隨著水浴時間的增加，檢出率提高，當水浴時間為10 min時，檢出率最高；當繼續(xù)增加水浴時間時，檢出率無明顯變化，因此選定水浴時間10 min作為中間水平。

2.2.2不同均質速度對檢出率的影響

水浴時間設定為10 min，均質時間設定為5 min，然后采用4個不同均質速度進行考察，實驗參數(shù)及結果見表3。

表3 不同均質速度對多層滴丸樣品檢出率的影響

從表3可以看出，當均質速度為8 000 r/min～14 000 r/min時，隨著均質速度的提高，檢出率升高。均質速度為12 000 r/min時，檢出率最高，因此選定均質速度12 000 r/min作為中間水平。

2.2.3不同均質時間對檢出率的影響

水浴時間設定為10 min，均質速度均為12 000 r/min，然后采用4個不同均質時間進行考察，實驗參數(shù)及結果見表4。

表4 不同均質時間對多層滴丸樣品檢出率的影響

從表4可以看出,在均質時間1 min～5 min范圍內(nèi)，隨著均質時間的增加，檢出率升高，繼續(xù)增加均質時間，檢出率沒有明顯變化，甚至稍有下降，可能由于均質時間過長，溫度升高，導致部分活菌死亡。因此選定均質時間5 min作為中間水平。

2.3 基于中心復合設計的響應面法優(yōu)化前處理參數(shù)

2.3.1實驗設計

根據(jù)前期多層滴丸樣品前處理單因素考察結果，我們采用基于中心復合設計的響應面法對前處理參數(shù)進行優(yōu)化。以Box-Behnken為模型，以均質速度(A)，均質時間(B)，水浴時間(C)為考察因素，以檢出率作為響應值。實驗設計及實驗結果見表5和表6。

表5 響應面分析試驗因素水平表

表6 響應面分析試驗設計與結果

2.3.2實驗結果分析

以Box-Behnken為模型設計實驗，通過SAS9.2軟件采用正交旋轉二次回歸對數(shù)據(jù)進行方差分析，建立了二次響應面回歸模型，并進而求得了最優(yōu)響應因子水平。所得的分析結果如表7。

從表5～表7可得出二次回歸方程為：

檢出率(%)=70.46+0.24A+0.80B+2.81C-1.28AB+1.25AC+0.43BC-1.06A2-2.28B2-4.56C2

對上述方程中A、B、C求偏導，得出如下三個方程：

0.24-1.28B+1.25C-2.12A=0

0.8-1.28A+0.43C-4.56B=0

表7 方差分析

2.81+1.25A+0.43B-9.12C=0

解出即得，A=0.231，B=0.143 3，C=0.346 5。對應的各因素水平為均質速度為12 462 r/min，均質時間為5 min 17 s，水浴時間為11 min 44 s。

根據(jù)上述回歸方程作出響應面分析圖，響應面結果見圖1～圖3。

圖1

2.3.3實驗驗證

為驗證優(yōu)化模型，根據(jù)模型優(yōu)化的試驗條件進行試驗，理論檢出率為71.03%。為檢驗響應曲面法所得結果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件對三層滴丸進行了三次實驗，實際測得的雙歧桿菌檢出率分別為71.88%，72.22%，71.12%，平均為71.74%，與理論值接近。因此，基于響應面優(yōu)化多層滴丸中長雙歧桿菌R175活菌數(shù)檢測方法準確可靠。

3 討論

3.1 本方法的建立使多層滴丸中雙歧桿菌的活菌數(shù)得到了有效檢測

多層滴丸國內(nèi)外研究較少，尤其是多層滴丸在益生菌方面的應用，鮮有報導，更沒有針對滴丸型活菌產(chǎn)品的檢測方法。益生菌多層滴丸需要通過多種不同性質的壁材來滿足益生菌活著到達腸道的目的，成分復雜并含有大量固化油成分。同時，其外層為保證丸體的完整性，硬度較大，目前常見的前處理方法如ISO29981的振蕩，GB4789.35中的8 000 r/min～10 000 r/min均質1 min～2 min，不足以將外層破碎，使中層和內(nèi)層從滴丸中分散出來。而且，常見方法中沒有對樣品進行恒溫處理，容易造成多層滴丸樣品抱團，使內(nèi)層活菌仍然被包裹或僅一小部分釋放到緩沖液中，檢測結果和實際偏差較大。為此，對多層滴丸前處理的方法進行了優(yōu)化。

圖2

圖3

從本實驗結果來看，基于中心復合設計的響應面分析方法對于多層滴丸中長雙歧桿菌R175活菌數(shù)檢測方法的優(yōu)化，是一個合適的優(yōu)化工具。影響多層滴丸樣品前處理結果的因素包括均質速度，均質時間和水溶時間。響應面分析法從這些因素中找到了最優(yōu)的樣品前處理參數(shù)。通過本次研究，我們發(fā)現(xiàn)，對多層滴丸使用Mitsuoka’s buffer緩沖液，37 ℃水浴11 min 44 s，12 462 r/min均質5 min 17 s，并采用TOSP培養(yǎng)基，可獲得較好的活菌數(shù)檢測結果。我們優(yōu)化后活菌數(shù)檢出率和優(yōu)化前相比較，比原來GB4789.35的方法提高2個數(shù)量級，比ISO29981的方法提高6個數(shù)量級。綜上，利用響應面法成功地優(yōu)化了多層滴丸中長雙歧桿菌R175活菌數(shù)檢測方法，可以用于多層滴丸中長雙歧桿菌R175的活菌檢測。

3.2 顯著性分析

由表7可知，回歸系數(shù)為0.971 9，大于0.9，表明該模型相關性好。P值為0.000 1，說明該模型達到極顯著水平(P<0.01)，該實驗方法可靠。方程失擬項為0.706 9，大于0.05，所以不顯著，說明該回歸模型擬合度較好。其中，均質時間(B)的一次項，均質速度(A)和均質時間(B)的交互項，均質速度(A)和水浴時間(C)的交互項，均質時間(B)的二次項均達到顯著水平(P<0.05)； 水浴時間(C)一次項和水浴時間(C)二次項均達到極顯著水平(P<0.01)。選取的因素對檢出率的影響大小依次為：水浴時間(C)>均質時間(B)>均質速度(A)。

通過表6看出，三個因素0水平(37 ℃水浴10 min，12 000 r/min均質5 min)檢出率平均值為70.46%，而最優(yōu)條件(37 ℃水浴11 min 44 s，12 462 r/min均質5 min 17 s)檢出率平均值為71.74%，兩者檢出率差異為1.44%。在統(tǒng)計分析上，兩者沒有顯著性差異，這可能和這個產(chǎn)品的特性有關。在這些因素水平下，檢出率可能已經(jīng)接近極限。通過響應面分析方法，我們發(fā)現(xiàn)，和其他水平相比，0水平是較優(yōu)的條件，同時最優(yōu)條件的檢出率平均值要好于0水平的檢出率平均值。因此，我們的實驗設計和考察結果具有實用價值。

在實際操作中，樣品前處理參數(shù)中的轉速12 462 r/min較難控制。為了方便操作，在后續(xù)的實驗中采用可控制的前處理參數(shù)：37 ℃水浴11 min 44 s，12 400 r/min均質5 min 17 s。

3.3 建立本檢測方法，可以指導益生菌多層滴丸的研發(fā)和質量標準的建立

研究表明，益生菌在產(chǎn)品制劑中的活菌數(shù)至少要達到107CFU·mL-1或g-1才能對宿主發(fā)生益生功能[12]。所以活菌數(shù)是評價微生態(tài)制劑益生功效的核心指標。

雙歧桿菌是應用較多的一類益生菌，雙歧桿菌專性厭氧，對氧氣、pH、溫度、濕度等外界不良環(huán)境因素極為敏感[17]，長雙歧桿菌作為雙歧桿菌屬的一個種，對環(huán)境也極為敏感，在生產(chǎn)、貯藏和運輸?shù)倪^程中活菌數(shù)下降迅速[15]。同時雙歧桿菌多不能抵抗動物消化道的胃酸、膽鹽及多種消化酶的作用，我們使用多層滴丸的制劑技術幫助雙歧桿菌抵抗胃腸道的苛刻環(huán)境，來增強其對消化系統(tǒng)的耐受性。

但目前，多層滴丸在益生菌方面的研究較少，針對多層滴丸中的雙歧桿菌活菌數(shù)的評價，沒有合適的方法，得不到有效的數(shù)據(jù)。為此，需要建立一個針對性的方法，用以評價多層滴丸的核心質量指標即雙歧桿菌的活菌數(shù)。有了這種檢測方法，對益生菌多層滴丸的產(chǎn)品開發(fā)具有指導意義，可以通過對活菌數(shù)的變化情況來評估工藝的可行性，設定合理的參數(shù)；通過長期穩(wěn)定性研究過程中活菌數(shù)的變化規(guī)律，制定產(chǎn)品的貯藏條件和具體的保質期。同時也為多層滴丸的質量標準的建立奠定基礎。