活血通絡(luò)利水方含藥血清在高濃度谷氨酸環(huán)境下對(duì)Müller細(xì)胞谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體、谷氨酰胺合成酶蛋白表達(dá)及活性的影響※

賈 鑫 蘇學(xué)敏 張 越 袁立飛 楊贊章 張銘連

(河北省眼科醫(yī)院河北省眼科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 邢臺(tái) 054001)

活血通絡(luò)利水方為河北省首屆名中醫(yī)張銘連教授基于絡(luò)病理論和長(zhǎng)期臨床實(shí)踐創(chuàng)立的一首活血通絡(luò)名方，具有活血通絡(luò)、祛瘀解毒的功效，用于治療各種原因?qū)е碌哪拷j(luò)瘀阻而造成的缺血性眼病，并獲國(guó)家發(fā)明專利[1]?；钛ńj(luò)利水方在眼科臨床應(yīng)用20余年，治療缺血性眼病已取得確切臨床療效，能夠提高患者視力，改善視野[2-3]，并改善患者血脂水平和血液流變學(xué)指標(biāo)[4]。缺血性眼病視力損傷的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，重要原因之一為視網(wǎng)膜微環(huán)境中高濃度的谷氨酸(GLU)對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)的興奮性神經(jīng)毒性損傷[5-6]。Müller細(xì)胞作為視網(wǎng)膜內(nèi)主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，通過GLU-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLAST)和谷氨酰胺合成酶(GS)維持視網(wǎng)膜正常的GLU代謝，以支持并保護(hù)視網(wǎng)膜各級(jí)神經(jīng)元[7]。為進(jìn)一步探討活血通絡(luò)利水方的作用機(jī)制，我們采用高濃度GLU損傷Müller細(xì)胞，觀察活血通絡(luò)利水方含藥血清對(duì)細(xì)胞GLAST、GS蛋白表達(dá)及活性的影響，以期為中藥復(fù)方治療缺血性眼病提供更多的理論依據(jù)和防治思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 SD大鼠(雄性)40只，周齡6～8周，體質(zhì)量(180±20)g，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK[湘]2014—0011。SD大鼠Müller細(xì)胞，由上海哈靈生物科技有限公司提供(批號(hào)：HL-C643)。

1.1.2 藥物 活血通絡(luò)利水方藥物組成：黃芪30 g，當(dāng)歸尾15 g，赤芍12 g，川芎10 g，桃仁10 g，紅花10 g，水蛭6 g，丹參12 g，葛根30 g，絲瓜絡(luò)10 g，郁金10 g，石菖蒲10 g，澤蘭10 g，茺蔚子15 g，金銀花30 g。由河北省眼科醫(yī)院中藥房、制劑科提供。經(jīng)水煎，濃縮為含生藥2 g/mL和4 g/mL的合劑。

1.1.3 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱、-80 ℃冰箱(美國(guó)Thermo公司)；4 ℃冰箱(中國(guó)海爾集團(tuán))；倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)；TGL-16gR高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；電熱恒溫水槽(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；小型垂直電泳槽、小型轉(zhuǎn)印電泳槽(美國(guó)Bio-Red公司)；高效液相色譜儀(日本島津公司)；TS-2型脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.1.4 試劑 0.9%氯化鈉注射液(中國(guó)石藥銀湖制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H14020821，批號(hào)：41218093009)；銀杏葉片(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20027949，批號(hào)：18070621)；GLAST抗體(批號(hào)：ab416)，GS抗體(批號(hào)：ab73593)，β-actin抗體(批號(hào)：ab8227)，GLU(批號(hào)：G8415)，以上試劑均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(批號(hào)：BA1054)，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)制備試劑盒(批號(hào)：P1200)，免疫化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑盒(批號(hào)：AR1170)，以上試劑均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；蛋白裂解液(批號(hào)：C900226-0050)，蛋白印跡膜再生液(批號(hào)：C500031)，0.22 μm濾膜(批號(hào)：F502522)，以上試劑均購(gòu)自生工生物工程上海股份有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)(批號(hào)：M8180)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(批號(hào)：PC0020)，二甲基亞砜(批號(hào)：D8371)，脫脂奶粉(批號(hào)：D8340)，TBST緩沖液(批號(hào)：T1081),以上試劑均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；色譜級(jí)甲醇(批號(hào)：M20003)，購(gòu)自北京謹(jǐn)明生物科技有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(批號(hào)：ISEQ00010)，購(gòu)自美國(guó)Merck Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 活血通絡(luò)利水方含藥血清制備 將40只健康SD大鼠(雄性)按照隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，即正常組、銀杏葉組、活血通絡(luò)利水方低劑量組和活血通絡(luò)利水方高劑量組，每組10只?；钛ńj(luò)利水方低、高劑量組分別予濃度2、4 g/mL的活血通絡(luò)利水合劑10 mL/kg(20 g/kg、40 g/kg)灌胃，銀杏葉組予銀杏葉片水溶劑5.2 mg/kg灌胃，正常組予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃7 d。灌胃期間大鼠自由攝取食水。末次給藥1 h后，腹主動(dòng)脈取血，3 500 r/min離心10 min收集血清，滅活，0.22 μm濾膜過濾除菌，分裝并保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 Müller細(xì)胞以1×105個(gè)/mL密度接種于96孔板，每孔加入100 μL DMEM培養(yǎng)基，靜置于5%CO2、37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，分別加入含0、0.1、0.5、1、10、20、25、30 mmol/L GLU濃度的培養(yǎng)基處理24 h，各濃度處理組設(shè)立5個(gè)復(fù)孔，之后各孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)繼續(xù)孵育4 h。棄去上清液，各孔加入150 μL二甲基亞砜，搖床震蕩15 min溶解結(jié)晶物。應(yīng)用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)570 nm處測(cè)量各孔的吸光度值。計(jì)算各組吸光度均值，各組均值/0 mmol/L GLU均值為各組細(xì)胞存活率。

1.2.3 Western Blot檢測(cè)GLAST、GS蛋白表達(dá) Müller細(xì)胞設(shè)為5組，即正常組、模型組、銀杏葉組、活血通絡(luò)利水方低劑量組及活血通絡(luò)利水方高劑量組，各組設(shè)立8個(gè)復(fù)瓶。細(xì)胞以 2×106個(gè)/mL 密度接種于 T25 培養(yǎng)瓶，每瓶加入 2 mL DMEM培養(yǎng)基，靜置于5%CO2、37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至80%時(shí)，正常組、模型組每瓶加入正常血清0.5 mL、培養(yǎng)基2 mL，銀杏葉組每瓶加入銀杏葉5.2 mg/kg含藥血清0.5 mL、培養(yǎng)基2 mL，活血通絡(luò)利水方低、高劑量組每瓶分別加入活血通絡(luò)利水方20、40 g/kg含藥血清0.5 mL、培養(yǎng)基2 mL。除正常組外，其余4組均加入GLU 25 mmol/L。各組置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，加入裂解液充分裂解細(xì)胞成勻漿，4 ℃條件下13 300 r/min離心15 min，收集上清蛋白液，即為總蛋白提取物。BCA法測(cè)定蛋白濃度，每孔25 μg蛋白上樣，10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，分別孵育GLAST、GS抗體(1∶1 000)4 ℃反應(yīng)過夜，孵育二抗HRP-羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫反應(yīng)1 h，采用ECL試劑盒顯影蛋白質(zhì)。同一張膜使用TBST溶液清洗，加入蛋白印跡膜再生液，室溫震蕩30 min，TBST溶液清洗，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，之后孵育內(nèi)參β-actin抗體(1∶5 000)，孵育二抗，顯影。掃描圖像并應(yīng)用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值為半定量蛋白表達(dá)結(jié)果。

1.2.4 高效液相色譜(HPLC)法檢測(cè)GLU含量 Müller細(xì)胞設(shè)為4組，即模型組、銀杏葉組、活血通絡(luò)利水方低劑量組和活血通絡(luò)利水方高劑量組，各組設(shè)立8個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞以 5×105個(gè)/mL 密度接種于6孔板，每孔加入2 mL DMEM培養(yǎng)基，靜置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至80%時(shí)，模型組每孔加入大鼠正常血清0.5 mL、培養(yǎng)基2 mL，銀杏葉組每孔加入銀杏葉5.2 mg/kg含藥血清0.5 mL、培養(yǎng)基2 mL，活血通絡(luò)利水方低、高劑量組每孔分別加入活血通絡(luò)利水方20、40 g/kg含藥血清0.5 mL、培養(yǎng)基2 mL，各組均加入GLU 25 mmol/L。各組置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞上清液，用色譜級(jí)甲醇沉淀蛋白，過濾待測(cè)。采用HPLC法測(cè)定GLU濃度，色譜柱為大連依利特分析儀器有限公司SinoChrom-BP C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈：磷酸鹽緩沖液(0.02 mol/L，pH 6.0)，16∶84(V/V)，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為472 nm，柱溫20 ℃，進(jìn)樣容積20 μL。將 10 mmol/L GLU 標(biāo)準(zhǔn)品溶液用超純水稀釋成 12.5、25、50、100、250、500、1 000、2 500 μmol/L對(duì)照品溶液，設(shè)置正常培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，各對(duì)照品溶液和待測(cè)樣品按前述色譜條件進(jìn)樣，經(jīng) HPLC-紫外光譜(UV)檢測(cè)后得到各組色譜峰面積值。以各對(duì)照品組的GLU濃度為橫坐標(biāo)，譜峰面積值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到濃度-色譜峰面積值相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，再根據(jù)各樣品組的色譜峰面積值計(jì)算得出各樣品組的 GLU 濃度。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度GLU對(duì)Müller細(xì)胞存活率的影響 見表1。

由表1可見，GLU(0、0.1、0.5、1、10、20、25、30 mmol/L)處理24 h后，與0 mmol/L GLU濃度比較，0.1、0.5、1、10 mmol/L GLU濃度下Müller細(xì)胞存活率升高(P<0.05)，20、25、30 mmol/L GLU濃度下Müller細(xì)胞存活率逐漸降低(P<0.05)。結(jié)果表明，10 mmol/L及以下低濃度GLU促進(jìn)Müller細(xì)胞活性；20、25、30 mmol/L GLU抑制Müller細(xì)胞活性，造成細(xì)胞損傷，抑制作用隨GLU濃度的升高而增強(qiáng)。GLU濃度為25 mmol/L時(shí)，Müller細(xì)胞存活率與0 mmol/L濃度下細(xì)胞存活率相比約為0.67，說明該濃度GLU可以引起細(xì)胞毒性損傷并且大部分細(xì)胞尚存活，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇25 mmol/L GLU干預(yù)Müller細(xì)胞以建立GLU損傷細(xì)胞模型。

GLU濃度(mmol/L)n24 h存活率051.00±0.030.151.57±0.02?0.551.47±0.05?151.30±0.05?1051.08±0.03?2050.88±0.03?2550.67±0.02?3050.35±0.03?

與0 mmol/L GLU濃度比較，*P<0.05

2.2 各組含藥血清在高濃度GLU環(huán)境下對(duì)Müller細(xì)胞GLAST、GS蛋白表達(dá)的影響 見表2、圖1。

組 別nGLASTGS正常組80.79±0.100.91±0.13模型組80.44±0.13?0.55±0.08?銀杏葉組80.60±0.10?△0.70±0.06?△活血通絡(luò)利水方低劑量組80.65±0.15?△0.77±0.09?△活血通絡(luò)利水方高劑量組80.75±0.10△#0.84±0.18△#

與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與銀杏葉組比較，#P<0.05

注：1為正常組；2為模型組；3為銀杏葉組；4為活血通絡(luò)利水方低劑量組；5為活血通絡(luò)利水方高劑量組

圖1 各組含藥血清在高濃度GLU環(huán)境下對(duì)Müller細(xì)胞GLAST、GS蛋白表達(dá)的影響

由表2、圖1可見，與正常組比較，模型組、銀杏葉組、活血通絡(luò)利水方低劑量組Müller細(xì)胞GLAST、GS蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，而活血通絡(luò)利水方高劑量組與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，銀杏葉組和活血通絡(luò)利水方低、高劑量組Müller細(xì)胞GLAST、GS蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與銀杏葉組比較，活血通絡(luò)利水方高劑量組Müller細(xì)胞GLAST、GS蛋白表達(dá)升高(P<0.05)?；钛ńj(luò)利水方低、高劑量組組間Müller細(xì)胞GLAST、GS蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 各組含藥血清對(duì)Müller細(xì)胞胞外GLU含量的影響 見圖2、表3。

①為GLU對(duì)照品溶液；②為正常培養(yǎng)液；③為銀杏葉含藥血清培養(yǎng)液；④為活血通絡(luò)利水方含藥血清培養(yǎng)液

圖2 各組含藥血清HPLC色譜圖

組 別n胞外GLU含量(mmol/L)模型組82.43±0.12銀杏葉組82.12±0.21?活血通絡(luò)利水方低劑量組82.18±0.19?△活血通絡(luò)利水方高劑量組82.06±0.16?△

與模型組比較，*P<0.05；與銀杏葉組比較，△P>0.05

由圖2可見，各組樣品中GLU的分離度良好，各組培養(yǎng)液中的內(nèi)源性物質(zhì)及其他雜質(zhì)峰不干擾GLU的測(cè)定，專屬性理想。

由表3可見，與模型組比較，銀杏葉組和活血通絡(luò)利水方低、高劑量組Müller細(xì)胞胞外GLU含量降低(P<0.05)，即細(xì)胞對(duì)GLU的攝取能力增強(qiáng)；與銀杏葉組比較，活血通絡(luò)利水方低、高劑量組胞外GLU含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。活血通絡(luò)利水方低、高劑量組組間Müller細(xì)胞胞外GLU含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

缺血性眼病累及視網(wǎng)膜和視神經(jīng)時(shí)，往往影響患者視力，嚴(yán)重者甚至視力喪失?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，缺血性視網(wǎng)膜病變的重要原因之一為高濃度GLU對(duì)RGC的神經(jīng)毒性損傷[6]。GLU是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最多、十分重要的興奮性氨基酸，在視網(wǎng)膜內(nèi)亦作為主要神經(jīng)遞質(zhì)介導(dǎo)信息傳遞，其主要聚集、貯存在光感受器、雙極細(xì)胞和RGC，沖動(dòng)傳導(dǎo)時(shí)經(jīng)突觸短暫釋放。Müller細(xì)胞作為視網(wǎng)膜最主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，包繞并接觸視網(wǎng)膜各級(jí)神經(jīng)元，參與神經(jīng)遞質(zhì)代謝[7]。正常狀況下，Müller細(xì)胞通過GLU轉(zhuǎn)運(yùn)體GLAST攝取突觸間隙多余的GLU，經(jīng)GS作用轉(zhuǎn)化為無神經(jīng)毒性的谷氨酰胺，再釋放到胞外由神經(jīng)細(xì)胞攝入繼續(xù)轉(zhuǎn)化為GLU釋放到突觸間隙，即為GLU循環(huán)[8]。視網(wǎng)膜缺血、缺氧時(shí)，GLU被大量釋放，突觸間隙的GLU不能被及時(shí)清除而濃度升高，過度刺激其受體，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，啟動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞代謝衰竭而損傷死亡，進(jìn)一步加重缺血、缺氧損傷，形成惡性循環(huán)，最終影響視功能[6]。由此可見，調(diào)節(jié)Müller細(xì)胞保護(hù)RGC免受高濃度GLU神經(jīng)毒性損傷具有重要意義，而這一過程中GLAST、GS的作用十分重要。

張銘連教授在中醫(yī)學(xué)絡(luò)病理論的基礎(chǔ)上結(jié)合多年臨床診治經(jīng)驗(yàn)，提出了“目絡(luò)學(xué)說”，強(qiáng)調(diào)目絡(luò)是眼部運(yùn)行氣血、貫通榮衛(wèi)的樞紐和要道[9]。若目絡(luò)受邪，則氣行不暢，血行滯澀，產(chǎn)生瘀血、痰濕，相互搏結(jié)釀生毒邪，損傷目絡(luò)，虛、瘀、毒、水4種病理因素互相影響，形成惡性循環(huán)，終致目絡(luò)瘀阻，發(fā)為缺血性眼病[10]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)已證實(shí)的視網(wǎng)膜高濃度GLU對(duì)RGC的神經(jīng)毒性損傷，正是毒邪蘊(yùn)結(jié)、損傷目絡(luò)的體現(xiàn)之一。張教授在該學(xué)說的指導(dǎo)下，基于清代王清任的補(bǔ)陽還五湯以及臨床實(shí)踐，創(chuàng)立了活血通絡(luò)利水方，臨證加減組方治療缺血性眼病療效顯著[2-3]?；钛ńj(luò)利水方以活血化瘀、益氣通絡(luò)為治則，方中黃芪為補(bǔ)氣之要藥，大補(bǔ)元?dú)庖灾\(yùn)行，祛瘀通絡(luò)；當(dāng)歸尾補(bǔ)血，協(xié)同行血；川芎、丹參、赤芍活血行滯，以復(fù)氣機(jī)；葛根、石菖蒲輕揚(yáng)升發(fā)，宣氣通竅；郁金行氣解郁，涼血祛瘀；桃仁、紅花活血破瘀；水蛭破血祛瘀。全方養(yǎng)血與活血藥同用，補(bǔ)氣與通絡(luò)藥并使，相得益彰[11]。高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、血管痙攣或血栓阻塞等均為缺血性眼病的重要病因[12]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪可以調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞，擴(kuò)張血管，調(diào)整血壓，控制血流，并且改善血液流變學(xué)和微循環(huán)，增強(qiáng)毛細(xì)血管功能，延緩動(dòng)脈硬化，抑制血小板聚集[13]。川芎所含川芎嗪、阿魏酸具有促進(jìn)血管舒張、抑制血栓形成的作用[14]；丹參能調(diào)節(jié)血脂代謝，降低血液黏稠度，延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[15]；葛根的主要有效成分葛根素能降低血糖，改善血管功能，增加局部血液灌注[16]。

相關(guān)研究證明，活血通絡(luò)利水方能保護(hù)兔視網(wǎng)膜缺血—再灌注損傷，減輕視網(wǎng)膜水腫，其機(jī)制可能與減輕視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷和炎性反應(yīng)、改善Müller細(xì)胞水液代謝、抑制血-視網(wǎng)膜屏障通透性升高有關(guān)[17-18]。Müller細(xì)胞作為視網(wǎng)膜主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，不僅參與維持視網(wǎng)膜水液穩(wěn)態(tài)，亦維持視網(wǎng)膜正常GLU代謝，保護(hù)視功能。因此，對(duì)Müller細(xì)胞GLU代謝功能的測(cè)定能夠進(jìn)一步探究活血通絡(luò)利水方的作用機(jī)制。在實(shí)驗(yàn)研究中，通過檢測(cè)Müller細(xì)胞GLAST、GS蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞外GLU含量，進(jìn)而評(píng)價(jià)Müller細(xì)胞GLU代謝功能[19-20]。本研究通過體外培養(yǎng)Müller細(xì)胞，觀察活血通絡(luò)利水方含藥血清低、高劑量組在高GLU環(huán)境下對(duì)Müller細(xì)胞GLAST、GS蛋白表達(dá)和胞外GLU含量的影響，以探究活血通絡(luò)利水方對(duì)Müller細(xì)胞GLU代謝功能的調(diào)節(jié)作用。

觀察結(jié)果表明，活血通絡(luò)利水方能夠有效促進(jìn)高GLU環(huán)境下Müller細(xì)胞GLAST、GS蛋白表達(dá)和活性。10 mmol/L 及以下低濃度 GLU 促進(jìn)Müller細(xì)胞活性；20、25、30 mmol/L GLU 抑制 Müller 細(xì)胞活性，造成細(xì)胞損傷，抑制作用隨 GLU 濃度升高而增強(qiáng)；且 GLU 濃度為 25 mmol/L 時(shí)，引起細(xì)胞毒性損傷的同時(shí)大部分細(xì)胞尚存活，成功建立 GLU 損傷細(xì)胞模型。與正常組比較，模型組Müller細(xì)胞GLAST、GS蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，說明高濃度GLU抑制Müller細(xì)胞GLAST、GS蛋白表達(dá)；與模型組比較，銀杏葉組和活血通絡(luò)利水方低、高劑量組Müller細(xì)胞GLAST、GS蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，并且細(xì)胞外GLU含量均降低(P<0.05)，說明藥物干預(yù)能夠挽救Müller細(xì)胞GLAST、GS蛋白表達(dá)和活性，促進(jìn)Müller細(xì)胞代謝GLU。其中，活血通絡(luò)利水方高劑量組的調(diào)節(jié)作用更為明顯，該組Müller細(xì)胞GLAST、GS蛋白表達(dá)水平與銀杏葉組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與正常組和活血通絡(luò)利水方低劑量組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明活血通絡(luò)利水方高劑量組對(duì)Müller細(xì)胞GLAST、GS蛋白表達(dá)的上調(diào)作用更強(qiáng)，可以恢復(fù)到正常水平，優(yōu)于銀杏葉組。然而，活血通絡(luò)利水方高劑量組胞外GLU含量較低劑量組和銀杏葉組均降低，但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明活血通絡(luò)藥物干預(yù)能夠恢復(fù) Müller 細(xì)胞 GLAST、GS 蛋白活性，但不同劑量組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述，本研究證實(shí)了活血通絡(luò)利水方含藥血清能夠?qū)Ω逩LU環(huán)境下Müller細(xì)胞GLAST、GS蛋白表達(dá)和活性發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)GLU代謝平衡，進(jìn)一步豐富了活血通絡(luò)利水方治療缺血性眼病的作用機(jī)制研究。