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    御唐丸對2型糖尿病大鼠空腹血清胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、甘油三酯、總膽固醇水平及胰腺組織胰島素表達(dá)的影響※

    2020-06-30 11:31:50周妍妍高麗娟
    河北中醫(yī) 2020年3期
    關(guān)鍵詞:糖尿灌胃低劑量

    鄭 南 謝 寧 李 全 周妍妍 高麗娟

    (黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

    糖尿病是一種內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病,其特征為慢性持續(xù)性的血糖濃度增高、糖耐量異常及尿糖結(jié)果陽性,并可伴有脂質(zhì)代謝異常。根據(jù)糖尿病發(fā)病原因的不同,臨床中又以2型糖尿病為主,且隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變,2型糖尿病發(fā)病率呈逐年升高趨勢[1]。近年來大量臨床研究顯示,中醫(yī)藥對于2型糖尿病在控制血糖、改善胰島素抵抗、提高胰島素表達(dá)等方面療效確切,且具有毒副作用小、依賴性小的特點[2]。御唐丸是黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)謝寧教授結(jié)合自己多年的臨床經(jīng)驗研制而成的純中藥復(fù)方制劑,臨床研究表明其對2型糖尿病療效確切[3]。為進(jìn)一步闡述御唐丸的作用機制,我們觀察御糖丸對糖尿病模型大鼠空腹血清胰島素(FINS)、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平及胰腺組織胰島素表達(dá)情況的影響,結(jié)果如下。

    1 材料與方法

    1.1 動物 清潔級SD雄性大鼠150只,體質(zhì)量180~200 g,周齡8周,采購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心,動物合格證號:SYXK(黑)2017-012。

    1.2 藥物 御唐丸(主要由黃芪、山茱萸、龜版、烏梅、女貞子、麥冬、山藥、白芍、鹿茸、西洋參、玉竹及葛根組成,由黑龍江省中西醫(yī)結(jié)合研究所制劑室負(fù)責(zé)加工制作);糖尿樂膠囊(河南輔仁堂制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字Z10983076);鹽酸二甲雙胍片(北京京豐制藥集團(tuán)有限公司,國藥準(zhǔn)字H11021518)。

    1.3 主要試劑及儀器

    1.3.1 試劑 大鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒、TC測定試劑盒、TG測定試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司);鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司);胰島素免疫組化檢測試劑盒(上海一研生物科技有限公司)。

    1.3.2 儀器 Infinite F50全自動酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司);ZY-1280型全自動生化分析儀(上海科華生物工程股份有限公司);BX60生物顯微鏡(日本Olympus公司);紫外分光光度計(上海奧析科學(xué)儀器有限公司);快速血糖儀(德國羅氏公司);組織包埋機、石蠟切片機(澳大利亞Daintree Scientific公司)。

    1.4 實驗方法

    1.4.1 模型制備 將150只SD大鼠隨機分為空白對照組20只及造模組130只??瞻捉M予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。造模組予高脂高糖飲食喂養(yǎng),并采用STZ腹腔注射法建立2型糖尿病模型[6],連續(xù)喂養(yǎng)10周,以大鼠空腹腹腔注射血糖(FPG)>16.7 mmol/L且維持1周以上表示造模成功。最后共108只造模成功。

    1.4.2 分組及給藥 將造模成功的108只大鼠隨機分為御唐丸高劑量組、御唐丸低劑量組、糖尿樂膠囊組、鹽酸二甲雙胍組及模型對照組,每組20只,剩余8只大鼠剔除。御唐丸高、低劑量組分別按2.70、1.35 g/(kg·d)予御唐丸藥液灌胃,糖尿樂膠囊組按0.09 g/(kg·d)予糖尿樂膠囊藥液灌胃,鹽酸二甲雙胍組按2.43 g/(kg·d)予鹽酸二甲雙胍片藥液灌胃,空白對照組及模型對照組分別予2 mL/d蒸餾水灌胃。各組大鼠均連續(xù)灌胃8周。

    1.5 檢測指標(biāo)及方法

    1.5.1 標(biāo)本采集 各組大鼠均在末次給藥后禁食水12 h,然后通過摘除眼球取血的方法獲得全血,室溫靜置1 h,以3 000 r/min離心10 min,取上清液,-80 ℃冷凍保存。取血完畢后采用脫頸法處死大鼠,解剖并摘取胰腺組織,置于4%的多聚甲醛固定液中固定,備用。

    1.5.2 FINS檢測及HOMA-IR計算 各組大鼠取血后首先采用快速血糖儀進(jìn)行FPG檢測,然后均取定量血清,采用ELISA法進(jìn)行FINS檢測,嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行測定。得到FPG及FINS數(shù)值后再根據(jù)公式計算HOMA-IR。計算公式:HOMA-IR=(FPG×FINS)/22.5。

    1.5.3 TG及TC檢測 各組均取定量血清,采用全自動生化分析儀進(jìn)行檢測,嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行測定。

    1.5.4 胰腺組織胰島素表達(dá)檢測 采用免疫組化染色法對各組大鼠胰腺組織胰島素表達(dá)進(jìn)行檢測。主要步驟:用石蠟包埋胰腺組織并切片,60 ℃恒溫烤箱中至少烤片1 h,放入盛有二甲苯的容器中脫蠟3次,每次10 min,梯度乙醇水化,每次2 min;按照一抗的需要,采用抗原修復(fù)液對組織切片進(jìn)行抗原修復(fù)處置,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次;封閉緩沖液封閉,37 ℃孵育30 min,滴加一抗,37 ℃孵育2 h,PBS洗滌3次;封閉緩沖液封閉,37 ℃孵育10 min,滴加二抗,37 ℃孵育30 min,PBS洗滌3次;滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素(HRP-SA)(濃度1∶50~200),37 ℃孵育30 min,PBS洗滌5次;使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色,蒸餾水沖洗,蘇木素復(fù)染,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,甘油封固劑封片。最后在顯微鏡下觀察,并采用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)[麥克奧迪(廈門)醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司]進(jìn)行分析,棕黃色顆粒為陽性表達(dá),淡藍(lán)色背景為陰性表達(dá),陽性目標(biāo)面積占統(tǒng)計場面積的百分比就是陽性目標(biāo)面密度,記錄數(shù)值。

    2 結(jié) 果

    2.1 大鼠入組情況 實驗過程中,各組部分大鼠由于高血糖水平、STZ毒性及灌胃不當(dāng)?shù)仍虺霈F(xiàn)死亡,灌胃8周后共計死亡29只,最終每組各選取順利完成實驗的8只大鼠進(jìn)行統(tǒng)計分析。

    2.2 各組大鼠灌胃后血清FINS及HOMA-IR水平比較 見表1。

    組 別nFINS(mmol/L)HOMA-IR空白對照組88.83±1.261.71±0.16模型對照組838.08±2.01?41.02±4.75?糖尿樂膠囊組833.89±2.21△26.46±2.92△鹽酸二甲雙胍組837.82±2.69△20.86±1.98△御唐丸低劑量組834.57±4.93△23.08±3.02△#御唐丸高劑量組829.54±1.82△#□◇21.23±2.72△#

    與空白對照組比較,*P<0.05;與模型對照組比較,△P<0.05;與糖尿樂膠囊組比較,#P<0.05;與鹽酸二甲雙胍組比較,□P<0.05;與御唐丸低劑量組比較,◇P<0.05

    由表1可見,與空白對照組比較,模型對照組灌胃后FINS及HOMA-IR水平均明顯升高(P<0.05)。與模型對照組比較,糖尿樂膠囊組、鹽酸二甲雙胍組、御唐丸低劑量組及御唐丸高劑量組灌胃后FINS及HOMA-IR水平均明顯下降(P<0.05)。與糖尿樂膠囊組比較,御唐丸高劑量組灌胃后FINS及HOMA-IR水平均明顯降低(P<0.05),御唐丸低劑量組灌胃后HOMA-IR水平明顯降低(P<0.05)。與鹽酸二甲雙胍組比較,御唐丸高劑量組灌胃后FINS水平明顯降低(P<0.05),HOMA-IR水平與其相當(dāng)(P>0.05),御唐丸低劑量組FINS及HOMA-IR水平與其比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與御唐丸低劑量組比較,御唐丸高劑量組灌胃后FINS水平明顯降低(P<0.05),HOMA-IR水平與其相當(dāng)(P>0.05)。

    2.3 各組大鼠灌胃后血清TC及TG水平比較 見表2。

    組 別nTCTG空白對照組81.21±0.090.38±0.05模型對照組82.81±0.60?1.44±0.51?糖尿樂膠囊組82.27±0.31△1.14±0.22△鹽酸二甲雙胍組81.57±0.28△0.65±0.15△御唐丸低劑量組82.26±0.28△□0.85±0.14△#御唐丸高劑量組81.68±0.17△#◇0.67±0.15△#

    與空白對照組比較,*P<0.05;與模型對照組比較,△P<0.05;與糖尿樂膠囊組比較,#P<0.05;與鹽酸二甲雙胍組比較,□P<0.05;與御唐丸低劑量組比較,◇P<0.05

    由表2可見,與空白對照組比較,模型對照組灌胃后TC及TG水平均明顯升高(P<0.05)。與模型對照組比較,糖尿樂膠囊組、鹽酸二甲雙胍組、御唐丸低劑量組及御唐丸高劑量組灌胃后TC及TG水平均明顯降低(P<0.05)。與糖尿樂膠囊組比較,御唐丸高劑量組灌胃后TC及TG水平均明顯降低(P<0.05),御唐丸低劑量組灌胃后僅TG水平明顯降低(P<0.05)。與鹽酸二甲雙胍組比較,御唐丸高劑量組灌胃后TC及TG水平與鹽酸二甲雙胍組相當(dāng)(P>0.05),御唐丸低劑量組TC水平則明顯高于鹽酸二甲雙胍組(P<0.05)。與御唐丸低劑量組比較,御唐丸高劑量組灌胃后TC水平明顯低于御唐丸低劑量組(P<0.05),TG水平與其相當(dāng)(P>0.05)。

    2.4 各組大鼠灌胃后胰腺組織胰島素表達(dá)情況比較 見表3。

    組 別n胰腺組織胰島素空白對照組56.260±1.104模型對照組50.570±0.123?糖尿樂膠囊組50.875±0.179鹽酸二甲雙胍組52.224±0.535△御唐丸低劑量組51.589±0.402△御唐丸高劑量組53.003±0.845△#◇

    與空白對照組比較,*P<0.05;與模型對照組比較,△P<0.05;與糖尿樂膠囊組比較,#P<0.05;與御唐丸低劑量組比較,◇P<0.05

    由表3可見,與空白對照組比較,模型對照組灌胃后胰腺組織胰島素表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與模型對照組比較,鹽酸二甲雙胍組、御唐丸低劑量組及御唐丸高劑量組灌胃后胰腺組織胰島素表達(dá)均明顯升高(P<0.05),糖尿樂膠囊組表達(dá)雖也有升高趨勢,但比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與糖尿樂膠囊組比較,御唐丸高劑量組灌胃后胰腺組織胰島素表達(dá)明顯升高(P<0.05),御唐丸低劑量組表達(dá)雖也有升高,但比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與鹽酸二甲雙胍組比較,御唐丸高、低劑量組灌胃后胰腺組織胰島素表達(dá)水平與其比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與御唐丸低劑量組比較,御唐丸高劑量組灌胃后胰腺組織胰島素表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。

    2.5 各組大鼠灌胃后胰腺組織胰島素免疫組化觀察情況 空白對照組:胰島細(xì)胞邊界清晰,染色顆粒分布濃密均勻。模型對照組:胰島細(xì)胞被破壞,染色顆粒分布密度不均。糖尿樂膠囊組:胰島細(xì)胞邊界模糊,分布紊亂,染色顆粒微見。鹽酸二甲雙胍組:胰島細(xì)胞邊界清晰,染色顆粒分布較少。御唐丸低劑量組:胰島細(xì)胞結(jié)構(gòu)趨于完整,染色顆粒相對明顯。御唐丸高劑量組:胰島細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對完整,染色顆粒明顯。見封3,圖1。

    3 討 論

    2型糖尿病是一種慢性代謝性疾病,其發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果,與糖尿病家族史、不良飲食習(xí)慣、體力活動少、肥胖、酗酒等因素密切相關(guān),同時由于長期高血糖的影響,可導(dǎo)致碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂,大血管、微血管受損,造成多器官的慢性損傷和功能障礙,而導(dǎo)致一系列并發(fā)癥[4-5]。2型糖尿病為進(jìn)展性的疾病,胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能障礙是其發(fā)病的主要原因,但在其發(fā)生和發(fā)展過程中,究竟是胰島素抵抗先出現(xiàn),還是胰島素分泌量不足先出現(xiàn),尚存在一定爭議[6-7]。胰島素抵抗是指一定濃度胰島素對葡萄糖代謝所產(chǎn)生的生物反應(yīng)偏低、生物學(xué)效應(yīng)減弱的現(xiàn)象。胰島β細(xì)胞合成并分泌胰島素主要由血糖濃度的高低決定,但當(dāng)機體出現(xiàn)胰島素抵抗時,胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取和利用的效率下降,正常水平的胰島素?zé)o法激發(fā)誘導(dǎo)肌肉和脂肪細(xì)胞吸收葡萄糖的信號,血糖濃度不斷升高,又會對胰島β細(xì)胞產(chǎn)生刺激作用,進(jìn)而促使胰腺代償性合成分泌更大量的胰島素,產(chǎn)生高胰島素血癥以維持血糖的穩(wěn)定,而一旦胰島β細(xì)胞受到破壞,在高血糖的情況下無力表達(dá)和分泌更多的胰島素,則說明患者正從單純的胰島素抵抗向2型糖尿病轉(zhuǎn)變[8-9]。脂質(zhì)代謝紊亂也是2型糖尿病最常見的臨床表現(xiàn)之一,胰島素抵抗或胰島素含量不足均可減弱機體對釋放游離脂肪酸(NEFA)的抑制作用,脂肪組織發(fā)生快速分解,導(dǎo)致大量NEFA被釋放,NEFA通過門靜脈循環(huán)入肝,促進(jìn)肝臟分泌大量的TC、TG,導(dǎo)致TC、TG水平明顯升高[10]。另外,脂蛋白酯酶是水解TG的關(guān)鍵酶,其活性不僅取決于基因的表達(dá),還與胰島素的作用密切相關(guān)。2型糖尿病患者由于胰島素水平不足或胰島素抵抗,導(dǎo)致胰島素作用減弱,脂蛋白酯酶活性降低,進(jìn)而出現(xiàn)TG水平升高[11]。本實驗結(jié)果也顯示,模型對照組FINS、HOMA-IR、TC及TG水平較空白對照組均明顯升高(P<0.05),且胰腺組織中胰島素表達(dá)明顯降低(P<0.05)。糖尿樂膠囊和鹽酸二甲雙胍片都是臨床上治療2型糖尿病的常用藥,對2型糖尿病均有確切療效[12-13],因此我們選為陽性藥物進(jìn)行對照觀察。本實驗結(jié)果也顯示,糖尿樂膠囊和鹽酸二甲雙胍片對糖尿病模型大鼠血清FINS、HOMA-IR、TC、TG均有不同程度的改善。

    2型糖尿病屬中醫(yī)學(xué)消渴范疇,《內(nèi)經(jīng)》中有消渴、消癉、肺消、晶消、消中等10余種病名[14]?!端貑枴て娌≌摗吩唬骸按宋鍤庵缫玻黄D。夫五味入口,藏于胃,脾為之行其精氣,津液在脾,故令人口甘也。此肥美之所發(fā)也……肥者令人內(nèi)熱,甘者令人中滿,故其氣上溢,轉(zhuǎn)為消渴。”雖然歷代中醫(yī)學(xué)者對2型糖尿病的病因、病機認(rèn)識各不相同,治療方法也各有側(cè)重,但均以健脾補腎為重,認(rèn)為消渴是以陰虛為本,燥熱為標(biāo),真陰虧竭于下,相火妄動于上,水火失濟(jì)所致。脾為后天之本,主升清,運化水谷精微,濡養(yǎng)五臟六腑,若氣機升降失常,脾所化生之精微不得上達(dá)反而直趨下行,終致陰精自小便而出。腎藏先天之本,主納氣,腎陽充足則氣化、蒸騰作用如常,腎陽不足,津液代謝異常,津液向上輸布無力則口渴欲飲,膀胱失于氣化則小便量多頻數(shù)。御唐丸正是謝寧教授以健脾補腎、益氣養(yǎng)陰為法治療2型糖尿病的經(jīng)驗方。方中黃芪、西洋參健脾益氣,滋陰補腎,養(yǎng)陰生津;玉竹養(yǎng)陰潤燥,生津止渴;麥冬重滋肺胃,與西洋參合用又走腎水,金水肺腎相濟(jì),止渴生津潤燥;山茱萸補肝益腎,收斂固澀;山藥補中益氣,消渴生津,山藥重補脾之陰精,黃芪重補脾之陽氣,兩藥共用,化漏濁,益脾精,助脾胃運化;葛根升陽止瀉,生津止渴;鹿茸補腎壯陽,補精益髓;烏梅收斂生津,清熱除煩;龜版滋陰潛陽,補腎健骨;女貞子補腎填精;白芍養(yǎng)血調(diào)經(jīng),斂陰止汗??v觀全方,配伍精當(dāng),共奏健脾補腎、益氣養(yǎng)陰之功效?,F(xiàn)代藥理研究表明,黃芪主要含有氨基酸類、微量元素、黃酮類、皂甙、多糖等成分,能夠減少胰島β細(xì)胞的凋亡,并促進(jìn)胰島β細(xì)胞合成并分泌胰島素[15];西洋參的主要活性成分是人參總皂苷,能夠促進(jìn)胰島組織合成并分泌胰島素,抑制胰島β細(xì)胞凋亡,提高機體攝取和消耗葡萄糖的能力,對糖、脂代謝通路產(chǎn)生影響,減少腸道對脂肪及葡萄糖的吸收[16];女貞子中的齊墩果酸對糖尿病大鼠具有良好的降血糖、降血脂效果,并且齊墩果酸還具有抗自由基損傷的作用,可增強機體的抗氧化能力[17];玉竹多糖對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血糖有顯著的抑制作用,可增加機體對葡萄糖的攝取,促進(jìn)肌糖原合成[18]。本實驗結(jié)果也顯示,御唐丸高、低劑量組干預(yù)后,血清FINS、HOMA-IR、TC、TG水平及胰腺組織胰島素表達(dá)情況較模型對照組均有明顯改善(P<0.05),且御唐丸高劑量組FINS、TC水平及胰腺組織胰島素表達(dá)情況改善優(yōu)于御唐丸低劑量組(P<0.05),且其治療效果優(yōu)于糖尿樂膠囊,基本與鹽酸二甲雙胍片相當(dāng),并在降低FINS水平方面優(yōu)于鹽酸二甲雙胍片(P<0.05)。

    綜上所述,御唐丸對糖尿病大鼠具有確切療效,可明顯降低大鼠血清FINS水平,,提高胰腺組織的胰島素的表達(dá),減輕胰島素抵抗情況,降低TC及TG水平,改善脂質(zhì)代謝,且具有一定的量效關(guān)系,高劑量水平可能效果更佳。

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