木香對(duì)脾虛大鼠胃腸道運(yùn)動(dòng)及血清乙酰膽堿酯酶、一氧化氮水平的影響※

侯 影 張 旭

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧 沈陽(yáng) 110032)

木香為菊科植物木香的干燥根，圓柱形或平圓柱形，味辛、苦，性溫，入三焦、脾、胃、膽、大腸經(jīng)。木香乃三焦氣分之藥,是治療胃腸道疾病的常用藥，其生品行氣，止痛，健脾，消食，主要用于脾胃氣滯，胸脅，脘腹脹痛，食積，消化不良，食欲不振等，而煨制木香則可實(shí)腸止瀉，臨床多用于泄瀉腹痛、瀉痢里急后重等[1]。隨著現(xiàn)代人飲食結(jié)構(gòu)的改變，加之社會(huì)生活節(jié)奏加快、工作壓力加重，胃腸道疾病的發(fā)病率逐年增高，已對(duì)人們正常的工作、生活造成嚴(yán)重影響[2]。乙酰膽堿(ACh)為胃腸道動(dòng)力的興奮性遞質(zhì)，具有促進(jìn)胃腸道運(yùn)動(dòng)、加快胃腸道排空的作用。一氧化氮(NO)廣泛分布于胃腸道，是一種抑制性遞質(zhì)，與多種胃腸道疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。兩者的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)維持正常的胃腸功能具有重要意義[3]。為進(jìn)一步探討木香治療胃腸道疾病的作用機(jī)制，我們擬通過(guò)對(duì)木香生品、麩煨品對(duì)脾虛模型大鼠血清乙酰膽堿酯酶(AChE)、一氧化氮(NO)及離體十二指腸收縮功能的影響進(jìn)行研究，以期為臨床用藥提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠92只，體質(zhì)量(210±20)g，周齡(6±3)周，均由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(遼)2018-0003。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑

1.2.1 木香 木香購(gòu)自云南省西雙版納傣族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院翟延君教授鑒定為菊科植物木香的干燥根。木香麩煨品的制備；按照100 kg木香飲片加入30 kg麥麩，110～120 ℃煨制10 min即可。然后取木香生品、麩煨品各50 g,粉碎成細(xì)粉，分別倒入大燒杯中，加入300 mL蒸餾水浸泡1 h，加熱沸騰30 min后過(guò)濾。剩余藥物再加200 mL蒸餾水煎煮，再加熱沸騰20 min后過(guò)濾，合并2次濾液，水浴加熱濃縮為1.0 g/mL。冷卻后再分別將木香生品濾液、麩煨品濾液加水調(diào)制成生藥含量1.0、0.5、0.25 g/mL濃度的藥液。

1.2.2 其他 枸櫞酸莫沙必利分散片(成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20031110，批號(hào)100802)；利血平注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H12020905，批號(hào)1007013)；AChE檢測(cè)試劑盒、NO檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；臺(tái)氏液(按照文獻(xiàn)[4]中方法配制)。

1.3 主要儀器 Sunrise酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)[北京北分瑞利分析儀器(集團(tuán))有限責(zé)任公司]；LMS-2A型二道生理記錄儀(成都儀器廠)；YSD-4型藥理生理實(shí)驗(yàn)多用儀、恒溫電熱器、肌肉張力換能器(蚌埠市無(wú)線電二廠)；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)；TGL-16C型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 模型制備及分組 將92只大鼠在室溫25 ℃，相對(duì)濕度50%～70%，常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，期間可以自由飲水、攝食。然后將92只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、莫沙必利對(duì)照組、木香生品高劑量組、木香生品中劑量組、木香生品低劑量組、木香麩煨品高劑量組、木香麩煨品中劑量組及木香麩煨品低劑量組，每組10只，模型對(duì)照組12只。除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠均予利血平注射液0.50 mg/(kg·d)腹腔注射建立脾虛模型[5]，正常對(duì)照組大鼠予0.9%氯化鈉注射液0.5 mg/(kg·d)腹腔注射，共注射14 d。

1.4.2 灌胃給藥 各組大鼠(模型對(duì)照組取其中10只)在腹腔注射造模的同時(shí)予灌胃給藥。木香生品高、中、低劑量組和木香麩煨品高、中、低劑量組分別按照7.00、3.50、1.75 g/(kg·d)的濃度予相應(yīng)藥液灌胃，莫沙必利對(duì)照組按照0.35 mg/(kg·d)予枸櫞酸莫沙必利分散片藥液灌胃，正常對(duì)照組及模型對(duì)照組分別予0.9%氯化鈉注射液7.00 mg/(kg·d)灌胃，共連續(xù)灌胃14 d。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 血樣采集及處理 各組大鼠灌胃14 d后禁食不禁水12 h，然后通過(guò)眼眶靜脈叢采血2 mL，于室溫靜置1 h，再以3 500 r/min離心15 min，收集上清液，將血清標(biāo)本放于-20 ℃保存。

1.5.2 血清NO測(cè)定 采用化學(xué)比色法檢測(cè)各組大鼠血清NO含量。具體操作如下：雙蒸餾水0.1 mL加入空白管，標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(100 μmol/L)0.1 mL加入標(biāo)準(zhǔn)管，血清樣本0.1 mL加入測(cè)定管，各管分別加入混合試劑0.4 mL，混勻，37 ℃水浴60 min，分別加入試劑三0.2 mL、試劑四0.1 mL(詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū))，充分混勻30 s，室溫下靜置40 min，以3 500 r/min離心10 min，取0.5 mL上清液，再各加入0.6 mL顯色劑，混勻，靜置10 min，使用蒸餾水調(diào)整零度。波長(zhǎng)550 nm、0.5 cm光徑，測(cè)定各組光密度(OD)值，并計(jì)算NO含量。計(jì)算公式：NO含量=[(測(cè)定管OD值-空白管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值)]×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

1.5.3 血清AChE測(cè)定 采用化學(xué)比色法檢測(cè)各組大鼠血清AChE含量。具體操作如下：測(cè)定管加入血清樣本0.05 mL、8 μmol/L ACh應(yīng)用液0.25 mL，對(duì)照管加入蒸餾水0.05 mL、8 μmol/L ACh應(yīng)用液0.25 mL，空白管加入蒸餾水0.30 mL，3個(gè)管再分別加入試劑一0.5 mL，混合均勻，37 ℃水浴靜置20 min，然后依次加入試劑三應(yīng)用液1.0 mL、試劑四0.5 mL、試劑五0.25 mL、試劑六0.5 mL(詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū))，混勻，以3 000 r/min離心10 min，取上清，空白調(diào)整零度。波長(zhǎng)520 nm，1 cm光徑測(cè)定各試管OD值，并計(jì)算血清AChE含量。計(jì)算公式：AChE含量=[(對(duì)照管OD值-測(cè)定管OD值)/對(duì)照管OD值]×[標(biāo)準(zhǔn)品濃度/8 μmol/L]×[1/取樣量]。

1.5.4 離體十二指腸收縮情況 將模型對(duì)照組剩余2只大鼠采用脫頸法處死，解剖后將十二指腸取出，剝離腸系膜，置于盛有臺(tái)氏液的培養(yǎng)皿中，并用臺(tái)氏液將腸內(nèi)容物沖洗干凈，然后用手術(shù)剪將腸管剪成數(shù)小段，每段約2 cm，放入離體腸管活動(dòng)生理記錄裝置中，一端系于肌肉張力換能器上，另一端系于吊鉤上,懸掛于恒溫水浴鍋內(nèi)。通入混合氣體(5%二氧化碳與95%氧氣)，控制水浴恒溫(37±0.5)℃，首先加入20 mL臺(tái)氏液，待腸管的收縮運(yùn)動(dòng)狀況穩(wěn)定后，記錄其收縮曲線，并計(jì)算平均振幅。然后依次加入木香生品和木香麩煨品高、中、低密度(1.0、0.5、0.25 g/mL)藥液，每個(gè)濃度加藥50 μL,給藥后觀察5 min，分別記錄每組胸管的收縮曲線。每次觀察完畢后用生化液沖洗腸管3次，待腸管恢復(fù)收縮后再進(jìn)行下一種藥物實(shí)驗(yàn)。以給藥前腸管的平均振幅為標(biāo)準(zhǔn)，給藥后各組收縮振幅與其相比得到相對(duì)收縮振幅，進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠灌胃后血清NO含量比較 見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組灌胃后血清NO含量明顯升高，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，僅莫沙必利對(duì)照組灌胃后血清NO含量明顯下降，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，木香生品和木香麩煨品高、中、低劑量組與模型對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

組 別nNO正常對(duì)照組1030.06±3.20模型對(duì)照組1035.26±5.24?莫沙必利對(duì)照組1022.84±2.57△木香生品高劑量組1034.86±9.82木香生品中劑量組1033.49±4.89木香生品低劑量組1032.42±6.51木香麩煨品高劑量組1026.51±4.38木香麩煨品中劑量組1029.94±6.13木香麩煨品低劑量組1033.86±12.91

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型對(duì)照組比較，△P<0.05

2.2 各組大鼠灌胃后血清AChE含量比較 見(jiàn)表2。

組 別nAChE正常對(duì)照組10128.09±40.92模型對(duì)照組1088.89±10.20?莫沙必利對(duì)照組10126.84±11.83△木香生品高劑量組10118.13±24.54△木香生品中劑量組10109.56±21.31△木香生品低劑量組10105.96±21.16木香麩煨品高劑量組1085.42±39.26木香麩煨品中劑量組10113.60±36.14木香麩煨品低劑量組10110.04±32.73

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型對(duì)照組比較，△P<0.05

由表2可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組灌胃后血清AChE含量明顯下降，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，莫沙必利對(duì)照組、木香生品高劑量組和木香生品中劑量組灌胃后血清AChE含量明顯升高，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但木香生品低劑量組和木香麩煨品高劑量組、木香麩煨品中劑量組、木香麩煨品低劑量組與模型對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 各組大鼠離體十二指腸相對(duì)收縮振幅比較 見(jiàn)表3。

組 別n相對(duì)收縮振幅模型對(duì)照組2100.0±11.6木香生品高劑量組2130.0±10.5?木香生品中劑量組2125.0±17.0木香生品低劑量組2119.0±15.1木香麩煨品高劑量組2123.0±18.1木香麩煨品中劑量組2120.0±9.7木香麩煨品低劑量組2115.0±10.1

與模型對(duì)照組比較，*P<0.05

由表3可見(jiàn)，與模型對(duì)照組比較，木香生品高劑量組大鼠離體十二指腸相對(duì)收縮振幅明顯增強(qiáng)，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。木香生品中劑量組、木香生品低劑量組和木香麩煨品高劑量組、木香麩煨品中劑量組、木香麩煨品低劑量組大鼠離體十二指腸相對(duì)收縮振幅與模型對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

胃腸道運(yùn)動(dòng)是消化系統(tǒng)最基礎(chǔ)的生理功能，其調(diào)節(jié)機(jī)制主要包括腸神經(jīng)系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)調(diào)節(jié)和胃腸激素的體液調(diào)節(jié)[6]。胃腸動(dòng)力障礙性疾病是臨床常見(jiàn)的胃腸道疾病，主要包括功能性消化不良、胃食管反流、腸易激綜合征、慢性便秘等，主要表現(xiàn)腹脹、腹痛、惡心、嘔吐、腹瀉、便秘等[7]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，胃腸動(dòng)力障礙的發(fā)生與神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂、免疫因素、胃腸激素、胃腸道炎癥、內(nèi)臟高敏感狀態(tài)等多種因素相關(guān)，臨床多以對(duì)癥治療為主[8]。NO屬于細(xì)胞外信息分子，廣泛分布于胃腸道，是胃腸道中一種新型的生物信息抑制性遞質(zhì)，與胃腸道生理、病理活動(dòng)具有密切關(guān)系，此外對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)也具有調(diào)節(jié)作用[9-10]。在一氧化氮合酶(NOS)的作用下，體內(nèi)多種細(xì)胞均可以生成NO，效應(yīng)細(xì)胞在NO及其他相關(guān)信號(hào)分子的作用下，可促進(jìn)環(huán)磷鳥(niǎo)嘌呤核苷(cGMP)及環(huán)磷酸腺苷(cAMP)濃度升高，產(chǎn)生超極化作用的平滑肌細(xì)胞，進(jìn)而減少鈣離子的內(nèi)流，增加鈣離子在肌質(zhì)網(wǎng)的攝取,起到舒張消化道平滑肌的作用，另外NO還可直接作用于肌細(xì)胞抑制胃動(dòng)素及ACh的釋放，松弛平滑肌，減弱胃腸蠕動(dòng)，且對(duì)胃腸移行性復(fù)合運(yùn)動(dòng)也有抑制作用[11-13]。ACh是一種神經(jīng)遞質(zhì)，主要存在于膽堿能神經(jīng)末梢突觸間隙，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)終板突觸后膜的皺褶中聚集較多，能特異性地作用于各類膽堿受體，可與胃腸道平滑肌表面的M受體結(jié)合，引起胃腸道平滑肌收縮，從而促進(jìn)胃及十二指腸運(yùn)動(dòng)，加快胃排空[14-15]。AChE是ACh的水解酶，可在膽堿能突觸間對(duì)ACh進(jìn)行降解，進(jìn)而終止神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)突觸后膜的興奮作用，避免受體細(xì)胞膜持續(xù)去極化而造成的傳導(dǎo)阻滯，保證神經(jīng)信號(hào)傳遞，臨床上常通過(guò)檢測(cè)AChE水平變化來(lái)反映ACh水平變化情況，其含量與ACh呈正相關(guān)[16-17]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，胃腸動(dòng)力障礙性疾病屬脾胃病范疇，基本病機(jī)為脾胃失調(diào)，氣機(jī)失常，采用相應(yīng)的中醫(yī)藥治療療效確切，具有副作用小、選擇面廣等優(yōu)點(diǎn)[18]。木香是臨床常用的傳統(tǒng)中藥材，具有行氣止痛、調(diào)中導(dǎo)滯、健脾消食的功效，《本草綱目》言其“主心腹一切滯氣。和胃氣,泄肺氣,行肝氣。凡氣郁而不舒者,宜用之”?，F(xiàn)代藥理研究表明，木香對(duì)胃腸道運(yùn)動(dòng)具有興奮和抑制的雙向調(diào)節(jié)作用，不同的給藥劑量、不同的提取部位都可產(chǎn)生不同的藥理作用，在某一劑量范圍內(nèi)能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的胃腸運(yùn)動(dòng)，另一劑量范圍又會(huì)產(chǎn)生抑制胃腸運(yùn)動(dòng)的作用[19]。脾虛證是指脾氣虛損引起的一系列脾胃功能失常的表現(xiàn)。相關(guān)研究表明，脾虛模型動(dòng)物的胃腸道運(yùn)動(dòng)明顯減弱[20]，因此我們通過(guò)建立脾虛模型進(jìn)一步研究木香生品和麩煨品對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組造模后血清NO含量較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，AChE含量明顯降低(P<0.05)，表明脾虛大鼠的胃腸活動(dòng)功能受到抑制，胃腸活動(dòng)明顯減弱。與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性藥物莫沙必利對(duì)照組大鼠血清NO含量明顯下降(P<0.05)，AChE含量明顯升高(P<0.05)，而木香生品和麩煨品高、中、低劑量各組中僅木香生品高、中劑量組血清AChE含量明顯升高(P<0.05)，提示木香生品高、中劑量組對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)有興奮作用。

研究表明，胃腸道的平滑肌具有自動(dòng)節(jié)律性收縮的功能，但作用不規(guī)則且收縮緩慢。正常的胃腸道運(yùn)動(dòng)還需要受到外來(lái)神經(jīng)和內(nèi)在神經(jīng)系統(tǒng)的共同支配，這些神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)控制胃腸道運(yùn)動(dòng)具有關(guān)鍵性作用[21]。外來(lái)神經(jīng)主要為交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)，內(nèi)在神經(jīng)主要為黏膜下神經(jīng)叢和肋間神經(jīng)叢，各個(gè)系統(tǒng)相互關(guān)聯(lián)、相互聯(lián)系，進(jìn)而共同調(diào)節(jié)胃腸道平滑肌的腺體分泌和運(yùn)動(dòng)[22]。在適宜的條件下，即使已經(jīng)脫離外來(lái)神經(jīng)的支配，離體腸管仍然具有壁內(nèi)神經(jīng)叢及平滑肌收縮的作用，溫度、化學(xué)物質(zhì)、牽張刺激等均可對(duì)其運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生影響，可以很好地反映出不同藥物對(duì)離體腸管的直接作用[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，木香生品高劑量組離體腸管的相對(duì)收縮振幅明顯更高(P<0.05)，說(shuō)明高劑量木香生品可促進(jìn)離體腸管收縮，其余各組也有升高趨勢(shì)，但比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

綜上所述，木香對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)具有興奮作用，可明顯促進(jìn)胃腸道運(yùn)動(dòng)，其中以木香生品高劑量組的效果最明顯，這也是木香理氣作用的體現(xiàn)，其作用機(jī)制可能與升高ACh水平有關(guān)，但對(duì)NO作用不明顯，為木香臨床的合理應(yīng)用提供了參考。