發(fā)酵過程中一鍵式程序滅菌方法介紹及優(yōu)勢探討

（國藥集團重慶醫(yī)藥設計院有限公司，重慶 400042）

關鍵字：一鍵式滅菌；實消；連消；發(fā)酵

隨著生物發(fā)酵工業(yè)規(guī)模的擴大，生產(chǎn)中種子罐和發(fā)酵罐體積和數(shù)量也在增加，并且發(fā)酵過程要在沒有雜菌污染的條件下進行，為了避免染菌、保持生產(chǎn)的正常進行，這就要求企業(yè)投入更多的人力，也就會不可避免地增大滅菌過程中的人為誤操作概率，增加發(fā)酵生產(chǎn)的風險。在使用蒸汽滅菌的過程中會產(chǎn)生較大噪音，操作工也會有燙傷的危險，為了實現(xiàn)自動化操作，減少人為誤操作，提升職業(yè)衛(wèi)生水平，很多企業(yè)開始嘗試滅菌的自動化控制[1]，使生物發(fā)酵向更高的自動化方向發(fā)展。如連消系統(tǒng)的整體模塊化，使整個連消過程實現(xiàn)完全的自動化過程[2]。更有企業(yè)將自動化水消系統(tǒng)推廣無菌管路以及發(fā)酵罐的滅菌過程中[3]。因此在現(xiàn)代化企業(yè)的發(fā)酵生產(chǎn)中，需要設計一種一鍵式自動化程序滅菌方法（以下簡稱“一鍵式滅菌”），使其實現(xiàn)一鍵式控制模式，從而提高生產(chǎn)的效率和準確性，提升職業(yè)衛(wèi)生水平。

1 發(fā)酵生產(chǎn)中的滅菌工藝

發(fā)酵過程中生產(chǎn)菌種與培養(yǎng)基直接接觸混合，需要一個無雜菌生長的環(huán)境，因此接種前培養(yǎng)基的滅菌對發(fā)酵效率及產(chǎn)品的技術經(jīng)濟指標至關重要。

發(fā)酵過程，多使用液體培養(yǎng)基。生產(chǎn)過程中，液體培養(yǎng)基的滅菌方式主要有分批滅菌法（下稱“實消”）和連續(xù)滅菌法（下稱“連消”）[4]。在連續(xù)滅菌生產(chǎn)中還需要首先對發(fā)酵罐罐體進行空罐滅菌（下稱“空消”）。

1.1 實消工藝

分批滅菌也稱實罐滅菌或實消（以下簡稱實消），指將配制好的培養(yǎng)基全部輸送至發(fā)酵罐后，通入蒸汽直接加熱，再冷卻至接種溫度的滅菌過程。此過程的加熱、維持保溫和冷卻三個階段均在發(fā)酵罐中完成。

實消滅菌過程[5-6]（以種子罐為例）：

（1）進料。打開進料及排氣管路上的閥門，用泵將配制好的培養(yǎng)基從配制罐輸送到種子罐，進料完畢關閉進料閥門，開啟攪拌器攪拌或通入空氣防止料液沉積。

（2）升溫。將蒸汽從種子罐的物料進口、出口、壓縮空氣進口、取樣口等罐內(nèi)液面以下管口通入，通過控制排氣閥門開度控制罐壓，將罐壓維持在0.09～0.1 MPa（表壓），罐溫逐漸升高。

（3）保溫。待罐溫升高至119～121℃，調節(jié)蒸汽進汽量維持罐壓、罐溫穩(wěn)定，保溫30 min 左右，保溫過程中開動攪拌。

（4）降溫。保溫結束后，關閉蒸汽進汽閥、排氣閥，開啟壓縮空氣進氣閥，通入壓縮空氣，并開始在夾套中通入冷卻水或低溫水將培養(yǎng)基降至培養(yǎng)溫度，滅菌過程結束。

1.2 連消工藝

連續(xù)滅菌也稱連消，指將培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外，通過專門滅菌裝置，連續(xù)在不同設備中分別進行加熱、維持保溫和冷卻，然后進入發(fā)酵罐的滅菌過程。

連消滅菌過程（以發(fā)酵罐為例）：

培養(yǎng)基泵入加熱器，在15～30 s 之內(nèi)被快速加熱至滅菌溫度130～140℃，進入維持器維持5～8 min，然后在冷卻器中冷卻至40～50℃，最后輸送至已滅菌的發(fā)酵罐中。

連消后培養(yǎng)基所進的發(fā)酵罐，必須提前進行空罐滅菌，即空消?？障话憔S持罐壓0.15～0.2 MPa（表壓），罐溫為125～130℃，時間為30～45 min。滅菌后為避免罐壓急劇下降造成負壓，通壓縮空氣保壓，待經(jīng)過連續(xù)滅菌的無菌培養(yǎng)基輸入罐內(nèi)后，方可開冷卻水冷卻。

連消主要用于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的液體培養(yǎng)基的滅菌，已在維生素C、谷氨酸等工業(yè)中廣泛應用。

以上兩種滅菌工藝的操作為較傳統(tǒng)的人工控制，即在發(fā)酵現(xiàn)場人為操作各個蒸汽閥門的開閉來實現(xiàn)復雜的過程。較為先進的企業(yè)，將蒸汽控制閥門設置為自控閥，在控制室進行人工控制，這樣雖然能將操作人員從現(xiàn)場調離，但卻不能省去復雜的操作過程，因此設計一套通過邏輯控制編程實現(xiàn)的一鍵式滅菌方案尤為重要。

2 一鍵式程序滅菌

一鍵式滅菌是將整個發(fā)酵系統(tǒng)的操作過程通過邏輯控制編程后，匯總到一個按鍵來觸發(fā)整個過程，整個過程由計算機程序化控制。

現(xiàn)以具體工程為實例，對一鍵式滅菌方式進行介紹。由于本工程中種子罐實消與發(fā)酵罐的空消生產(chǎn)及控制方式相同，故省略種子罐的消毒介紹，直接以發(fā)酵罐的空消、種子罐向發(fā)酵罐移種的移種站滅菌為例，敘述一鍵式滅菌的控制步驟。

2.1 發(fā)酵罐（空消）與移種系統(tǒng)的一鍵式滅菌

2.1.1 發(fā)酵罐（空消）

滅菌控制自控閥門設置如圖1所示。

圖1 發(fā)酵罐的一鍵式滅菌Fig.1 One key sterilization of fermentation tank

進培養(yǎng)基管路上設計運程開關閥HS0。空氣精過濾器后進蒸汽管道設計遠程開關閥HS1和調節(jié)閥TV1，調節(jié)閥TV1 與罐溫聯(lián)鎖，取樣口蒸汽進口設遠程開關閥HS2。空氣精過濾器后空氣管道設計遠程開關閥HS3。排氣管道設計調節(jié)閥PV1、PV2 與罐壓聯(lián)鎖。冷卻水管道自控閥TV2、TV3 與罐溫聯(lián)鎖。

一鍵式滅菌過程如下：

連消后培養(yǎng)基進入發(fā)酵罐之前，需要對發(fā)酵罐進行空消。關閉罐與外界相連管道上的全部閥門。DCS打開HS0、HS1、HS2、HS3、HS4、TV1、 蒸汽輸入罐內(nèi)加熱罐體，罐內(nèi)空氣通過PV2 排出，罐體溫度升高至100℃時，關閉PV2，切換開啟PV1。通過蒸汽管調節(jié)閥TV1 與罐溫連鎖、排氣開關閥PV1 與罐壓連鎖，控制罐壓維持在0.09～0.1 MPa（表壓），罐溫逐漸升高至119～121℃，并維持罐壓、罐溫穩(wěn)定，保溫30 min。

保溫結束后，遠程自動關閉蒸汽進汽閥HS1、HS2、HS4，停止蒸汽對種子罐的熱量提供。開啟冷卻水管開關閥TV3、TV4，調節(jié)閥TV2，給罐體降溫，開啟壓縮空氣進氣閥HS3，通入經(jīng)除菌過濾的壓縮空氣后，罐壓連鎖開啟PV2；待罐溫降至培養(yǎng)溫度后，空消滅菌過程結束。

2.1.2 移種系統(tǒng)

滅菌自控閥門設置如圖2所示。

圖2 種子罐到發(fā)酵罐移種系統(tǒng)的一鍵式滅菌Fig.2 One key sterilization of seed tank to fermentor transfer system

此系統(tǒng)為連接種子罐與發(fā)酵罐的移種系統(tǒng)。系統(tǒng)中移種總管一端設置蒸汽進氣滅菌，并設有開關閥HS1和調節(jié)閥HS2。

正常工作時，先用蒸汽將移種總管滅菌，一鍵式自控程序自動打開蒸汽自控開關閥HS1和調節(jié)閥HS2，蒸汽通過移種總管到末端管道排氣出口排出。整個總管滅菌20 min 后，關閉末端自控閥，處于消后待用狀態(tài)。發(fā)酵罐空消時，打開對應的三通隔膜閥HS4，蒸汽吹到相應的發(fā)酵罐中，配合發(fā)酵罐的空消。

根據(jù)以上敘述過程，將各個系統(tǒng)自控閥控制方式相配合，在控制室DCS中編程，形成一鍵式自動化滅菌程序。整個過程實現(xiàn)一鍵式程序自動控制，無需人為操作和干預，從而可以降低滅菌過程中人為誤操作，提高滅菌過程的準確性。

2.2 一鍵式滅菌與傳統(tǒng)滅菌方式的對比

2.2.1 降低滅菌操作的復雜性，減少人為誤操作，提高滅菌效率

由于發(fā)酵生產(chǎn)的特性，發(fā)酵罐與外界的連接主要包括：發(fā)酵培養(yǎng)的空氣管路、輸入種子液和發(fā)酵培養(yǎng)基的物料管路、滅菌時排蒸汽管路、培養(yǎng)時的取樣口、發(fā)酵完成后的發(fā)酵液放料管路。以上接口在發(fā)酵培養(yǎng)之前均需用蒸汽滅菌至無菌級別，故需對以上接口依次進行滅菌。傳統(tǒng)的人為操作滅菌過程，極易造成生產(chǎn)的不利后果。如圖1，滅菌時的排蒸汽管路閥門PV1 開度過大會造成蒸汽用量增大或發(fā)酵罐滅菌壓力偏低；在滅菌后的降溫過程中，空氣閥門HS3開度過低，或者空氣閥門HS3 打開不及時而造成發(fā)酵罐的真空，從而造成發(fā)酵罐的癟罐現(xiàn)象；滅菌過程要求滅菌工人依次順序開啟和關閉多個滅菌閥門，使得滅菌時間延長從而導致滅菌效率降低。而在一鍵式滅菌程序中，由于提前在計算機中設置閥門連鎖開啟和關閉程序以及各個閥門的開度，程序式滅菌過程會依次有序進行，從而避免以上傳統(tǒng)式發(fā)酵滅菌生產(chǎn)中會出現(xiàn)的能耗增大、癟罐以及滅菌時間延長的不利后果，從而降低滅菌操作的復雜性，減少人為誤操作并提高滅菌的生產(chǎn)效率。

2.2.2 降低勞動強度，減少人員成本，避免操作中的燙傷風險及噪聲危害

隨著發(fā)酵產(chǎn)能的增大，發(fā)酵罐的體積也隨之增大，例如某發(fā)酵生產(chǎn)工廠的發(fā)酵罐高達18 m，穿越三層樓板，如圖1，需要滅菌的管路閥門HS3，HS0，HS4 分別分布在不同的樓層，在傳統(tǒng)手動滅菌時，就需要滅菌工人穿梭在不同樓層進行操作，無形中增大了滅菌工人的勞動強度；并且在蒸汽滅菌時，由于高溫蒸汽與低溫物料的混合，產(chǎn)生的極大噪聲也會造成滅菌工人的職業(yè)危害。一鍵式滅菌，可以計算機程序式連鎖，觸發(fā)后消毒程序自動進行，無需滅菌工人現(xiàn)場操作，從而降低了勞動強度，減少人員成本，避免了滅菌操作過程的燙傷風險和噪聲。

2.2.3 減少物料在管路中的殘余，降低染菌風險，提供新穎工程設計思路

在傳統(tǒng)的發(fā)酵生產(chǎn)工程設計中，為了減少2.2.2中所敘述的滅菌工人的勞動量，在設計時，往往會將圖1中的HS0，HS4 人為與HS3 同層安裝，這時就增加了進料和出料管的長度和U 形彎，造成在進料、移種、出料時的管路存料現(xiàn)象，從而導致物料浪費并增加染菌風險。一鍵式滅菌的設計，可以避免人員現(xiàn)場操作，從而取消HS0，HS4 與HS3的同層安裝設計，避免物料在管路中的殘余。并且移種管路中三通隔膜閥的使用進一步減少了移種時種子液在管路中的殘余，從而降低染菌風險。此種管路設計為以后的發(fā)酵生產(chǎn)設計提供了新穎的思路。

一鍵式滅菌方法與傳統(tǒng)滅菌方法的優(yōu)缺點對比如表1所示。

表1 一鍵式滅菌方法與傳統(tǒng)滅菌方法的優(yōu)缺點對比Tab.1 Comparison of advantages and disadvantages between one key program sterilization method and traditional sterilization method

3 結束語

隨著發(fā)酵生產(chǎn)的大規(guī)模擴大，發(fā)酵過程的自動化也在飛速發(fā)展。本文介紹的一鍵式滅菌方案與傳統(tǒng)的人工現(xiàn)場滅菌或人工手動控制室滅菌方法相比，能夠減少發(fā)酵生產(chǎn)中滅菌過程的人為誤操作；減少人員勞動成本；提高發(fā)酵的生產(chǎn)效率。而且在工作環(huán)境方面，可以在極大程度上降低蒸汽噪聲、蒸汽燙傷對消毒操作工的危害。

另一方面，本文對發(fā)酵罐、移種系統(tǒng)的一鍵式滅菌方案的介紹，能夠為后續(xù)發(fā)酵車間的滅菌設計提供一條重要思路。