加味啟膈散抑制細(xì)胞增殖治療Barrett食管作用機(jī)制研究

胡蓆寶， 田晶晶， 梁若冰， 袁紅霞

Barrett食管(Barrett' s esophagus, BE )是指食管下段復(fù)層鱗狀上皮被化生的單層柱狀上皮替代的一種病理現(xiàn)象，可伴有或不伴有腸上皮化生，其中伴腸上皮化生者屬于食管腺癌(Esophagealadenocarcinoma，EAC)的癌前病變[1]。伴隨進(jìn)食習(xí)慣改變，進(jìn)食過量營養(yǎng)等生活習(xí)慣的變化，近年來EAC的發(fā)病率逐漸增長，尤其以西方國家顯著，其發(fā)病率己超過了食管鱗癌[2]，在EAC患者中，接近90%有BE既往史[3]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于BE的病因尚不完全明確，目前，尚未找到治愈BE的有效方法，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療BE主要采用對癥治療和隨診，必要時(shí)可予內(nèi)鏡及手術(shù)治療，對于近期解決臨床癥狀療效可，但遠(yuǎn)期療效尚未得到有力的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。因此，尋找有效合理的治療BE的方法，對有效防治BE及EAC的二級預(yù)防具有重要的臨床意義。近年來，中醫(yī)藥治療BE逐漸受到醫(yī)學(xué)界的重視，但目前對BE的病機(jī)認(rèn)識(shí)尚未得到統(tǒng)一，藥物作用及其機(jī)理和途徑還未明確，限制了其臨床應(yīng)用及推廣。本研究旨在通過檢測Ki-67和PCNA蛋白表達(dá)以探索加味啟膈散抑制細(xì)胞增殖對BE的治療機(jī)制，為BE的臨床治療及EAC的二級預(yù)防提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級成年健康Wistar 大鼠72只，10周齡，雌雄各半，體重（220±20）g，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0002。于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)房中飼養(yǎng)，自由攝食進(jìn)水。自然晝夜，自然光照。室內(nèi)通風(fēng)，室溫維持在18～22 ℃，相對濕度維持于40%～70%。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)器材及試劑 烤箱（上海慧泰儀器制造有限公司DHG-9140A），中性樹膠（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），山羊血清（北京元亨）抗體稀釋液（博士德 AR1016），鹽酸左氧氟沙星注射液（江蘇揚(yáng)子江藥業(yè)），右旋糖酐鐵注射液（浙江天瑞藥業(yè)）， PCNA、Ki-67免疫組化試劑盒（MDL-北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及造模 全部動(dòng)物以普通顆粒大鼠飼料常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)將其分為6組，每組12只大鼠，分別為正常組，模型組，中藥全方組，中藥行氣活血組，中藥理氣化痰組，中藥化痰祛瘀組。除正常組外，其余五組均采用改良后的“食管十二指腸端側(cè)吻合加鐵劑術(shù)”制備BE模型[4]，具體方法為：取上腹正中劍突下約0.5 cm處，縱行切開皮膚約2 cm，然后沿腹白線剪開肌層和腹膜，將胃提出，剪斷肝胃韌帶，顯露食管，分離食管下段迷走神經(jīng)及血管，絲線結(jié)扎賁門，用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉食管上段，固定食管，從賁門上0.3 cm處切斷食管；縫合賁門并荷包包埋入胃中，保留全胃；在距幽門1 cm處側(cè)壁避開血管縱行切開十二指腸壁約0.5 cm，隨后將食管下端全層與十二指腸切口行端側(cè)吻合，吻合完畢后進(jìn)行分層縫合。術(shù)后24 h禁食不禁水，術(shù)后3日內(nèi)，每天每只大鼠腹腔注入鹽酸左氧氟沙星注射液1.5 mg/kg。術(shù)后第2周給予鐵劑，術(shù)后1天禁食不禁水，術(shù)后3天內(nèi)每天注入適量左氧氟沙星（1.5 mg/kg）到腹腔，同時(shí)給予葡萄糖鹽水自由飲用，術(shù)后14天注射右旋糖酐鐵液，每周2次，每次30 mg/kg，持續(xù)31周。

1.2.2 加味啟膈散及其拆方的制備 加味啟膈散全方組：沙參10 g，砂仁10 g，荷葉10 g，生姜6 g，郁金10 g，厚樸10 g，紫蘇10 g，茯苓10 g，川貝母10 g，清半夏10 g，丹參20 g，當(dāng)歸20 g，仙鶴草30 g。行氣活血組（全方組去掉化痰藥）：全方組去茯苓10 g，川貝母10 g，清半夏10 g；理氣化痰組（全方組去掉祛瘀藥）：全方組去丹參20 g，當(dāng)歸20 g，仙鶴草30 g；化痰祛瘀組（全方組去掉理氣藥）：全方去郁金10 g，厚樸10 g，紫蘇10 g。藥物選用北京康仁堂藥業(yè)有限公司中藥配方顆粒，將按照規(guī)定劑量的中藥配方顆粒以適量開水充分溶解，得到0.66 g/mL濃度中藥藥液，折合成生藥量為5.4 g/mL。按人與大鼠給藥劑量換算，大鼠每日給藥劑量為生藥10 g/kg。

1.2.3 給藥方法 31周造模成功，第32周開始，正常組及模型組大鼠，給予生理鹽水1 mL/100g灌胃，每日2次，各治療組大鼠分別給予相應(yīng)藥液10 g/kg灌胃，每日2次，連續(xù)給藥14天后，處死并進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.2.4 處死及取材 各組動(dòng)物進(jìn)行處死前，均予禁食1天不禁水，然后采用10%水合氯(0.3 mL/100g) 腹腔注射麻醉,自吻合口以上約0.5 cm處剪取1.0 cm長食管組織，4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋并切片。

1.2.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.2.5.1 一般狀態(tài)觀察 每天觀察并記錄各組大鼠體重、毛色、精神狀態(tài)及進(jìn)食情況。

1.2.5.2 細(xì)胞增殖相關(guān)指標(biāo)測定 采用免疫組化法檢測PCNA、Ki-67 蛋白表達(dá)。結(jié)果判斷：Ki-67、PCNA 在細(xì)胞核中表達(dá)，以細(xì)胞核呈棕黃色至深棕黃色為 Ki-67、PCNA蛋白表達(dá)陽性。高倍視野（×400）下分別隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，觀察陽性細(xì)胞百分比。按陽性細(xì)胞所占比例分為：陽性細(xì)胞≤5%或細(xì)胞無棕色顆粒的視為陰性，記為“-”；陽性細(xì)胞占5 %～25%為弱陽性，記為“+”；陽性細(xì)胞占26 %～50%的為陽性，記為“++”；陽性細(xì)胞占＞ 50%為強(qiáng)陽性，記為“+++”。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)通過均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)通過頻數(shù)或率表示；多組間計(jì)量數(shù)據(jù)在滿足正態(tài)分布要求條件下進(jìn)行方差分析；等級資料比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較時(shí)采用Bonferroni 對P值進(jìn)行校正。以P＜0.05判定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀察 各組大鼠體重隨周齡的變化而增加。于4周后，模型組、理氣化痰組、行氣活血組、化痰祛瘀組個(gè)別大鼠飲食量下降，活動(dòng)度有一定降低；14周后觀察發(fā)現(xiàn)毛發(fā)無光澤、頸部脫毛、精神狀態(tài)差；全方組大鼠飲食量、活動(dòng)度、毛發(fā)光澤度情況優(yōu)于模型組、理氣化痰組、行氣活血組及化痰祛瘀組，且無脫毛現(xiàn)象。正常組大鼠實(shí)驗(yàn)過程中無死亡，模型組死亡3只，全方組死亡2只，行氣活血組死亡4只，理氣化痰組死亡5只，化痰祛瘀組死亡5只。對死亡大鼠進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)，4只死于吸入性肺炎、10死于彌漫性腹膜炎、5只死于吻合口狹窄。

2.2 各組大鼠Ki-67 蛋白表達(dá) 正常組中Ki-67蛋白的表達(dá)有1只為弱陽性；模型組中有8只為強(qiáng)陽性；理氣化痰組中有6只為強(qiáng)陽性；行氣活血組中有 5 只為強(qiáng)陽性；化痰祛瘀組中強(qiáng)陽性有4只。全方組中無強(qiáng)陽性，1只中等陽性，3只弱陽性，6只為陰性。組間方差分析結(jié)果顯示各組的Ki-67 表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=43.181，P＜0.001）。進(jìn)一步Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)顯示，與正常組相比，全方組Ki-67表達(dá)水平無顯著差異（P＞0.05），而其他治療組與模型組的表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，全方組Ki-67表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與全方組比較，理氣化痰組和行氣活血組大鼠的 Ki-67 表達(dá)水平較高（P＜0.05），而中藥化痰祛瘀組與全方組間無顯著差異（P＞0.05）。見表1，圖1。

2.3 各組大鼠PCNA蛋白表達(dá) 正常組大鼠食管組織PCNA蛋白表達(dá)呈陰性；模型組中強(qiáng)陽性7只，中等陽性2只；理氣化痰組中強(qiáng)陽性5只，中等陽性和弱陽性各1只；行氣活血組中強(qiáng)陽性5只，中等陽性3只；化痰祛瘀組中強(qiáng)陽性3只，中等陽性4只；全方組中等陽性1只，弱陽性4只，陰性5只；正常組中均為陰性。組間方差分析結(jié)果顯示各組PCNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=41.587，P＜0.001）；進(jìn)一步Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)顯示，與正常組比，模型組、理氣化痰組、行氣活血組和化痰祛瘀組PCNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），全方組和正常組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比，全方組PCNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與全方組比，理氣化痰組和行氣活血組PCNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），化痰祛瘀組與全方組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2，圖2。

表1 各組大鼠Ki-67 蛋白表達(dá)情況

圖1 各組大鼠Ki-67 蛋白表達(dá)（免疫組化法，×400）

表2 各組大鼠PCNA蛋白表達(dá)情況

圖2 各組大鼠PCNA 蛋白表達(dá)（免疫組化法，×400）

3 討論

BE是指食管黏膜上皮化生的一種病理變化。臨床上大多數(shù)BE患者常伴隨有燒心、反酸、胸骨后痛等胃反流的基本癥狀，故中醫(yī)將其列入到 “膈噎”的范疇。歷代醫(yī)家對其機(jī)制有不同的認(rèn)識(shí)，《靈樞·上膈》：“氣為上膈者”?！豆沤襻t(yī)統(tǒng)》針對膈噎進(jìn)行論述的過程中，則是認(rèn)為“必有死血?！倍谒未岸鄶?shù)會(huì)基于寒和陰盛的角度來分析膈噎，《諸病源候論》之中記載的原因?yàn)椋骸瓣庩柌缓?，藏氣不理”。在金代與元代的時(shí)候，則更多的基于陰虛陽盛的角度形成一定程度的認(rèn)知，諸如朱丹溪在著述中提出：“偏助陽氣，積成膈熱”等。由此可見膈噎病因病機(jī)復(fù)雜。

課題組根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)提出“痰、氣、瘀互結(jié)于食道”為BE的發(fā)病之本，食道為胃所主，故“胃失和降”為病機(jī)關(guān)鍵。憂思過慮、飲食不節(jié)、陰精損傷或久病等因素，首先傷及脾氣，脾傷則津液不布，聚而為痰，痰氣交阻于食道；肝為風(fēng)木之臟，主疏泄而藏血，其氣升發(fā)，喜條達(dá)而惡抑郁，司情志；郁怒傷肝，肝失疏泄，氣為血之帥，氣郁則血停，瘀血阻滯于食道；痰、氣、瘀互結(jié)于食道，食道為胃所主，胃失和降日久出現(xiàn)了膈噎的癥狀，從而發(fā)生BE。

啟膈散出自《醫(yī)學(xué)心悟》，現(xiàn)代醫(yī)家根據(jù)“異病同治”理論，應(yīng)用此方辨證論治反流性食管炎[5-6]、Barrett食管[7]、食管癌[8]等，均取得顯著療效。加味啟膈散則是在啟膈散的基礎(chǔ)上加味而成。全方組成為沙參、川貝母、茯苓、砂仁、郁金、丹參、當(dāng)歸、半夏、厚樸、生姜、蘇葉、荷葉、仙鶴草，為理氣活血、化痰降逆之劑。其方證病機(jī)特點(diǎn)是痰氣瘀互結(jié)，胃失和降。沙參甘涼潤燥；川貝母苦辛瀉降，清熱化痰；合用滋潤干槁之胃脘，調(diào)理氣機(jī)阻滯，為君藥。茯苓甘淡和中；砂仁沁香悅脾，有助于開胃；郁金活血疏肝，解除煩郁，達(dá)到良好的破瘀以及清心等效果；丹參可以實(shí)現(xiàn)活血化瘀和營等基本的療效。當(dāng)歸活血養(yǎng)血，助丹參活血之功；以上諸藥共奏利氣開郁、活血化痰之功，合為臣藥。方中半夏、厚樸、生姜、蘇葉等藥材取半夏厚樸湯之意，半夏化痰散結(jié)，降逆和胃；厚樸下氣除滿，助半夏散結(jié)降逆；生姜和胃止嘔，制半夏之毒；蘇葉芳香行氣，理肺舒肝，助厚樸行氣寬胸、宣通郁結(jié)之氣；通過辛苦合用的治療方式，辛以行氣散結(jié)，痰涎得化，專治證屬痰氣交阻的梅核氣，合為佐藥。荷葉為輕清之品，其性平，升舉清陽，可宣上焦陽氣，升提胃氣，于大隊(duì)降肅之藥中少佐可使升中有降，降中有升；仙鶴草收斂止血、消腫解毒，合為使藥。全方共奏行氣散結(jié)，化痰降逆，活血祛瘀，使郁氣得疏，痰涎得祛，瘀血得化。配伍嚴(yán)謹(jǐn)，標(biāo)本兼治，諸藥配合合理，共成理氣活血、化痰降逆，從而使胃腑得降，癥狀得解。

正常的食管鱗狀上皮細(xì)胞大多數(shù)處于靜止?fàn)顟B(tài)，僅部分基底層細(xì)胞有增殖能力。有研究[9]證明從正常食管到反流性食管炎到BE再到EAC，食管上皮的細(xì)胞增殖率依次逐漸增強(qiáng)。而目前反映細(xì)胞增殖常用檢測指標(biāo)有 PCNA和Ki-67。PCNA和Ki-67是與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核蛋白，可反映細(xì)胞增殖活性和腫瘤惡性傾向。

Ki-67作為一個(gè)細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，在細(xì)胞增殖周期的細(xì)胞核中表達(dá)，在 G0 期和G1早期不表達(dá)，G1中期到晚期出現(xiàn)，S期和G2期逐漸增加，M期達(dá)高峰，M期后迅速降解或丟失抗原決定簇。Ki-67具有半衰期短、陽性表達(dá)覆蓋于整個(gè)有絲分裂期等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是判斷細(xì)胞增殖活性的重要參考指標(biāo)[10-11]。有研究表明，Ki-67 表達(dá)高低與腫瘤的分化程度、轉(zhuǎn)移和預(yù)后緊密相關(guān)[12]。既往研究[13]顯示，在重度 RE和BE中Ki-67陽性率和表達(dá)強(qiáng)度相較于正常食管黏膜組織和一般的食管炎癥均明顯增高，提示 Ki-67的陽性表達(dá)在重度RE和BE的細(xì)胞增殖中有重要作用。因此，檢測Ki-67對判斷BE的發(fā)展及預(yù)后有一定的意義。

PCNA是DNA聚合酶的輔助因子，該蛋白主要聚集部位是細(xì)胞核，直接參與細(xì)胞增殖過程中DNA 復(fù)制，其在DNA合成的G1末期開始增加，在S期為最高峰，在G2期、M期含量明顯降低，與細(xì)胞周期中DNA合成狀態(tài)一致，是一種評價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的敏感指標(biāo)。有研究[14]結(jié)果表明PCNA在食管鱗癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織及食管正常組織，并且食管鱗癌組織中細(xì)胞增殖越活躍，細(xì)胞增殖能力越高，食管鱗癌組織的分化程度越低，臨床分期越晚，其組織中的PCNA陽性表達(dá)率就會(huì)更高，說明在食管鱗癌的分化過程中PCNA是重要的參與者。還有很多研究發(fā)現(xiàn)在胃癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤組織等中PCNA陽性表達(dá)率也明顯高于癌旁組織以及正常組織[15-17]。由此可見對 PCNA 進(jìn)行組織學(xué)檢測可以判斷細(xì)胞增殖活性及腫瘤惡性程度，從而有助于判斷疾病預(yù)后。

本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比，全方組大鼠PCNA表達(dá)水平明顯降低，而全方組也不同程度地低于理氣化痰組、行氣活血組和化痰祛瘀組，說明加味啟膈散可有效抑制PCNA表達(dá)，且全方組的效果優(yōu)于各拆方組；正常組和全方組間大鼠的PCNA表達(dá)水平無明顯差異；理氣化痰組、行氣活血組和化痰祛瘀組間也無明顯差異。在 Ki-67 表達(dá)水平上，與模型組相比較，全方組大鼠的Ki-67 表達(dá)水平明顯低于模型組，說明加味啟膈散可有效抑制 Ki-67表達(dá)；而全方組也分別低于理氣化痰組和行氣活血組大鼠的Ki-67表達(dá)水平，與化痰祛瘀組大鼠的Ki-67 表達(dá)水平無明顯差異，與正常組和全方組間大鼠的Ki-67表達(dá)水平無明顯差異，說明全方組的效果優(yōu)于理氣化痰組和行氣活血組。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加味啟膈散全方能顯著抑制大鼠BE模型的Ki-67及PCNA表達(dá)，作用分別優(yōu)于各拆方組，提示加味啟膈散可通過抑制BE時(shí)Ki-67、PCNA的過表達(dá)，從而抑制細(xì)胞過度增殖，起到對BE的治療作用。