FBXO31對(duì)人宮頸癌細(xì)胞C-33A增殖的影響及其在人宮頸癌組織中的表達(dá)和臨床意義研究

秦曉洋，張偉杰

宮頸癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率高。 雖然醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步使宮頸癌的診治已有顯著改善，但目前宮頸癌患者的治療效果和預(yù)后仍不理想，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致宮頸癌患者生存率低的主要因素[1]，因此，進(jìn)一步探究宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尤為重要，對(duì)新的分子靶向藥物的研發(fā)也意義重大。

F-box蛋白是泛素E3連接酶SCF（Skp1-Cul1-F8box）的重要組成部分，有408個(gè)氨基酸，其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。FBXO31（F-box only protein 31）是F-box蛋白家族成員之一。研究顯示，F(xiàn)BXO31在不同腫瘤中可以是抑癌基因，也可以是癌基因[2]。截至目前，關(guān)于FBXO31在宮頸癌中作用的報(bào)道較少，本研究通過(guò)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FBXO31對(duì)宮頸癌C-33A細(xì)胞增殖的影響，分析其在宮頸癌組織中的表達(dá)情況，以期尋找宮頸癌治療可能潛在的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料及實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)材料為人宮頸癌C-33A細(xì)胞。選取2014年1月—2017年6月在河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院（我院）行手術(shù)切除的70例宮頸癌患者的癌組織及癌旁組織（距癌灶邊緣＞2 cm）為研究材料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均為原發(fā)腫瘤，且無(wú)其他臟器轉(zhuǎn)移。②手術(shù)可切除，且術(shù)前未行化療等輔助治療。③術(shù)后標(biāo)本經(jīng)我院病理科兩位醫(yī)師閱片確診為宮頸癌。④一般情況良好。⑤依從性好，可進(jìn)行規(guī)律隨訪者。本研究資料齊全，無(wú)失訪。且已經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及患者知情同意。實(shí)驗(yàn)分組：添加FBXO31者為實(shí)驗(yàn)組，且 FBXO31 濃度依次為 50、75、100、200 μmol/L，無(wú) FBXO31的單細(xì)胞懸液組為對(duì)照組（各組n=50）。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組分別經(jīng) 24、48、72 h 后終止培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法 先將C-33A細(xì)胞依次進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及傳代。然后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C-33A細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液（濃度為 5×104/mL），接種于 96 孔板（200 μL，104個(gè)/孔），并常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞完全貼壁后按照實(shí)驗(yàn)分組分別加入不同濃度的FBXO31 100 μL 和培養(yǎng)液 100 μL，對(duì)照組加入培養(yǎng)液，每組各5個(gè)復(fù)孔。每管細(xì)胞均分3份，分別放置3個(gè)不同時(shí)間（24、48、72 h）干預(yù)后，每孔分別加入 20 μL MTT 溶液，錫箔紙包裹后孵箱避光培養(yǎng)5 h。棄去培養(yǎng)液后再每孔加入200 μL二甲基亞砜（DMSO），避光并低速震蕩10 min，待結(jié)晶物充分溶解后使用自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)570 nm處吸光度值，計(jì)算光密度（OD）。細(xì)胞抑制率（%）=[（陰性對(duì)照組OD值－實(shí)驗(yàn)組OD值）/陰性對(duì)照組OD值]×100%。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法 術(shù)后標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定后予以石蠟包埋，并連續(xù)切片（4 μm，各5張），65℃烤片、予以二甲苯脫蠟后水化，使用EDTA修復(fù)液高壓修復(fù)2 min，并用磷酸鹽緩沖液（PBS）試劑洗滌3次后加入濃度為30 moL/L的過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫（37℃）孵育，以羊血清封閉20 min后吸凈周?chē)鷿B液。再加入一抗（兔抗人FBXO31多克隆抗體（1∶500），加入PBS試劑重復(fù)以上操作（空白對(duì)照），放入4℃冰箱過(guò)夜后再添加二抗（生物素化山羊抗兔IgG），室溫烘烤30 min后再用PBS沖洗3次。室溫下二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色8 min，清水沖洗，并用蘇木素復(fù)染、乙醇脫水后以中性樹(shù)膠封片，備鏡下觀察。結(jié)果判定（Thomas綜合計(jì)分法）[3]：光鏡下觀察每張切片（5個(gè)視野/張）的染色強(qiáng)度及染色廣度（陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比）。染色強(qiáng)度評(píng)分：0分（無(wú)色），1分（淡黃色），2分（棕黃色），3分（黃褐色）；染色廣度評(píng)分：0分（0～10%），1分（11%～25%），2分（26%～50%），3分（51%～75%），4分（76%～100%）。染色強(qiáng)度+染色廣度綜合得分進(jìn)行評(píng)判：0～4分為陰性表達(dá)（-）；5～12分為陽(yáng)性表達(dá)（+）。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）法 取宮頸癌組織及癌旁組織，分別提取總蛋白，Bradford比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，再分別加入同等濃度的細(xì)胞裂解液及緩沖液，沸水煮沸3 min后采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度：2組分別取100 μg樣品上樣后行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后以4%BSA封閉2 h，并漂洗。脫脂后加入FBXO31一抗（1∶1 000）及β-actin一抗（1∶2 000），4℃過(guò)夜后行 TBST沖洗 3次（15 min/次），再加入適量辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記IgG二抗（1∶2 000），室溫（37℃）孵育1 h后再次行TBST沖洗3次（15 min/次），最后用ECL試劑盒顯影，掃描儀曝光掃描并保存膠片，Image J軟件分析目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值來(lái)計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 隨訪 上述病例均定期來(lái)我院復(fù)查時(shí)進(jìn)行隨訪。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定性資料用率（%）表示，組間比較用配對(duì)或成組χ2檢驗(yàn)或確切概率法。定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間整體比較采用兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，組內(nèi)兩兩時(shí)間點(diǎn)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)FBXO31對(duì)人宮頸癌C-33A細(xì)胞增殖的影響 FBXO31作用于C-33A細(xì)胞后，細(xì)胞增殖受到抑制。整體比較示4個(gè)組間、3個(gè)時(shí)間點(diǎn)、組和時(shí)間的交互作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示C-33A細(xì)胞抑制率在不同組間、不同時(shí)間點(diǎn)的變化大，且隨時(shí)間的變化趨勢(shì)受分組的影響。組間兩兩比較示，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)處，4組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)合數(shù)據(jù)分析：在相同作用時(shí)間下，C-33A細(xì)胞抑制率隨著FBXO31濃度的增加而增加，呈現(xiàn)濃度依賴性；組內(nèi)兩兩時(shí)間點(diǎn)比較示，各組的不同時(shí)間點(diǎn)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)合數(shù)據(jù)分析：在相同濃度下，抑制率隨著FBXO31作用時(shí)間的延長(zhǎng)亦增加，呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，見(jiàn)表1。

2.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)宮頸癌組織及癌旁組織中FBXO31的表達(dá) 光鏡下示FBXO31在宮頸癌組織中主要表達(dá)于細(xì)胞核，呈棕黃色或棕褐色，陽(yáng)性表達(dá)率為24.29%（17/70），而癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為85.71%（60/70），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.093，P=0.004），見(jiàn)表 2、圖 1（見(jiàn)封三）。

表1 不同濃度及時(shí)間作用下FBXO31對(duì)人宮頸癌C-33A細(xì)胞增殖抑制率的影響 （%，±s）

表1 不同濃度及時(shí)間作用下FBXO31對(duì)人宮頸癌C-33A細(xì)胞增殖抑制率的影響 （%，±s）

注：F 濃度=7 850.278，P=0.000；F 時(shí)間=4 837.539，P=0.000；F 交互=110.592，P=0.000；組內(nèi)比較時(shí)，兩兩時(shí)間點(diǎn)為配對(duì)t檢驗(yàn)，調(diào)整顯著性水準(zhǔn)α′=0.05/3=0.029，其他各次比較的顯著性水準(zhǔn) α′=0.05。

濃度組 n 24 h 48 h 72 h 50 μmol/L 50 3.85±0.13 9.09±0.95 16.33±0.83 75 μmol/L 50 7.42±0.56 16.85±1.21 30.12±1.66 100 μmol/L 50 17.99±1.07 30.11±2.19 39.41±2.99 200 μmol/L 50 30.38±1.85 44.99±3.04 54.28±4.02

表2 宮頸癌組織及癌旁組織中FBXO31的表達(dá)情況 （n=70）

圖1 FBXO31在宮頸癌及癌旁組織中的表達(dá)情況（免疫酶標(biāo)法×200）

圖2 Western blotting法檢測(cè)FBXO31在宮頸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況

2.3 Western blotting法檢測(cè)宮頸癌組織及癌旁組織中FBXO31的表達(dá) 人宮頸癌組織中FBXO31的相對(duì)表達(dá)量（0.4±0.2）低于癌旁組織（2.8±0.4），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=70，t=36.784，P=0.000），見(jiàn)圖2。

2.4 FBXO31的表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的相關(guān)性分析 FBXO31在宮頸癌組織中的表達(dá)與年齡、腫瘤大小及病理學(xué)類(lèi)型無(wú)關(guān)，但與腫瘤國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)（均P＜0.05）。其中，F(xiàn)BXO31在FIGO分期較晚、腫瘤分化程度較低、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和（或）遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者中表達(dá)量顯著低于FIGO分期早、腫瘤分化程度高、無(wú)淋巴結(jié)和（或）無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），呈現(xiàn)明顯相關(guān)性，見(jiàn)表3。

3 討論

作為常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，宮頸癌具有發(fā)病率高、死亡率高的特點(diǎn)。高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）持續(xù)性感染是其發(fā)病的主要原因[7]。盡管目前宮頸癌的整體診治水平已有較大提升，但其治療效果及預(yù)后仍不滿意。分子靶向藥物的出現(xiàn)提高了宮頸癌的治療效果，但由于腫瘤基因突變的多樣性及異質(zhì)性，易產(chǎn)生耐藥性，進(jìn)而影響治療效果[8]。因此，不斷尋求新的潛在分子靶點(diǎn)就顯得尤為重要。

表3 FBXO31蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)與宮頸癌臨床病理因素間的關(guān)系（例）

FBXO31是F-box蛋白家族成員之一，可與骨架蛋白Cullin 1及S期激酶相關(guān)蛋白（S phase kinase associated proptein 1，SKP1） 構(gòu)成泛素連接酶合體[9]。FBXO31通過(guò)蛋白酶泛素化降解途徑廣泛參與了細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、DNA損傷修復(fù)、神經(jīng)元分化等重要進(jìn)程[10]。與此同時(shí)，F(xiàn)BXO31與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也密切相關(guān)。相關(guān)報(bào)道顯示，在不同類(lèi)型的腫瘤中，F(xiàn)BXO31發(fā)揮不同的作用，如在肝癌、胃癌及乳腺癌中FBXO31在癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織，且上調(diào)FBXO31的表達(dá)水平可明顯抑制癌細(xì)胞的增殖，說(shuō)明FBXO31在此類(lèi)腫瘤中是一種抑癌基因[11-13]。但在食管鱗狀細(xì)胞癌、肺癌及肝門(mén)部膽管癌組織中FBXO31卻是一種癌基因，且與腫瘤的分期及侵襲程度明顯相關(guān)[14-16]。FBXO31的這些作用提示其可能是一個(gè)潛在的分子治療靶點(diǎn)。目前，F(xiàn)BXO31在宮頸癌中的作用機(jī)制研究尚少，基于以上因素，筆者通過(guò)探討FBXO31在宮頸癌中的作用機(jī)制，以期為宮頸癌的分子靶向治療尋求新靶點(diǎn)，提供新思路。

MTT法檢測(cè)示，F(xiàn)BXO31可明顯抑制人宮頸癌C-33A細(xì)胞增殖，且呈現(xiàn)時(shí)間及濃度依賴性。免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXO31在宮頸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為24.29%（17/70），顯著低于癌旁宮頸組織的85.71%（60/70）。而 Western blotting法示，人宮頸癌組織中FBXO31的蛋白表達(dá)量顯著低于癌旁組織。細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)與組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果相符合，提示FBXO31可能是一種抑癌基因而抑制了宮頸癌C-33A細(xì)胞的增殖，這與楊蕾等[17]的研究結(jié)果一致，參考其研究結(jié)果，可能是FBXO31抑制了腫瘤發(fā)生的Wnt/βcatenin通路從而發(fā)揮了抑癌基因的作用[18]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXO31在宮頸癌組織中的表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小及病理學(xué)類(lèi)型無(wú)明顯關(guān)系，但與腫瘤FIGO分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。且FIGO分期越晚、腫瘤分化程度越低、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和（或）遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，F(xiàn)BXO31的表達(dá)量越低。本文筆者分析，作為抑癌基因的FBXO31，其表達(dá)量越低，對(duì)癌細(xì)胞抑制作用越弱，因此腫瘤更易發(fā)展及轉(zhuǎn)移。

綜上所述，F(xiàn)BXO31可能作為一種抑癌基因參與了宮頸癌的發(fā)展進(jìn)程，對(duì)宮頸癌的臨床診治有一定的參考意義，有可能成為宮頸癌分子靶向藥物治療潛在的新靶點(diǎn)。但本研究周期短，樣本量小，具體分子作用機(jī)制仍需后續(xù)更加深入的研究。