胰高血糖素樣肽1通過類血管生成因子4調(diào)節(jié)糖尿病db小鼠棕色脂肪活性的機制

顏 岑 羅小敏 馮英梅

(首都醫(yī)科大學附屬北京潞河醫(yī)院中心實驗室，北京 101149)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一組以慢性血糖升高，伴有代謝紊亂的臨床代謝癥候群，白色脂肪堆積形成的肥胖現(xiàn)已成為T2DM的主要危險因素。相反地，棕色脂肪能夠攝取葡萄糖和三酰甘油將其轉(zhuǎn)化成能量，從而維持血糖血脂的穩(wěn)態(tài)，在T2DM中具有重要作用[1]。然而，在T2DM患者和肥胖的糖尿病db/db小鼠體內(nèi)，棕色脂肪(brown adipose tissue，BAT)功能下降[2]。研究[3]顯示，降糖藥胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)由小腸內(nèi)分泌細胞-L細胞分泌入血，它通過腦室胰高血糖素樣肽1受體(glucagon-like peptide 1 receptor，GLP-1r)刺激交感神經(jīng)，釋放去甲腎上腺素，增加 BAT活性。

游離脂肪酸為棕色脂肪細胞活化提供能量來源，它是由三酰甘油分解而成，而類血管生成因子4(angiopoietin-like protein 4，ANGPTL4)通過調(diào)控脂蛋白酯酶，對三酰甘油分解成游離脂肪酸起到重要作用。ANGPTL4屬于類血管緊張素家族，它在脂肪、肝臟組織表達，釋放入血[4]。研究[5]顯示，在T2DM患者外周血中ANGPTL4升高。那么ANGPTL4是否、如何參與小鼠棕色脂肪活性的調(diào)節(jié)，這個并不清楚。本課題通過db/db小鼠給予GLP-1類似物Exendin-4(Ex-4)促進BAT活性的模型和ANGPTL4缺失小鼠模型，探討ANGPTL4調(diào)控BAT功能的機制。

1 材料與方法

1.1 動物實驗

本研究采用雄性8周齡糖尿病模型db/db雄性小鼠和8周齡ANGPTL4-/-雄性小鼠，本研究所用的敲除小鼠都是以C57BL/6小鼠為背景進行基因敲除的。將db/db小鼠分為兩組，以皮下植入滲透微泵的方式分別給予0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液或GLP-1類似物Ex-4(20 nmol·kg-1·d-1)(美國Abcam公司)，干預6周。取材前空腹過夜，取空腹血、肝臟和脂肪組織保存。整個動物實驗得到首都醫(yī)科大學附屬北京潞河醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 葡萄糖耐量實驗

小鼠禁食過夜，腹腔注射10%(質(zhì)量分數(shù))葡萄糖溶液(10 μL/g)，檢測時間點為0、15、30、60、90、120 min的血糖值。

1.3 外周血、肝臟和BAT總膽固醇、三酰甘油定量

剪取適量db/db小鼠的肝臟和棕色脂肪組織稱質(zhì)量后加入到組織細胞裂解液(中國普利萊公司)中，經(jīng)勻漿和離心提取蛋白，BCA(美國Bio-Rad公司)試劑盒進行蛋白定量。取等量肝臟、BAT蛋白、血漿，用總膽固醇和總?cè)８视蜋z測試劑盒(中國中生北控公司)進行檢測。

1.4 快速蛋白液相色譜(fast protein liquid chromatography，F(xiàn)PLC)

取db/db小鼠的空腹血漿，采用FPLC分離脂蛋白[6]。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)

取空腹血以1∶2稀釋，采用ELISA試劑盒，根據(jù)試劑盒說明書檢測ANGPTL4。

1.6 正電子發(fā)射計算機斷層顯像(pet-CT)

采用正電子發(fā)射計算機斷層顯像(pet-CT)檢測BAT活性(首都醫(yī)科大學中心平臺)。將處理好的小鼠，檢測前1 d空腹過夜，尾靜脈注射18F-FDG，采用異氟烷吸入式麻醉后，將小鼠固定在掃描床上，先進行CT掃描，再用三維采集方式采集發(fā)射數(shù)據(jù)，進行PET圖像重建和圖像融合處理。依據(jù)計算機生成的pet-CT融合圖像，對棕色脂肪組織的平均標準攝取值(standerdized uptake value,SUV)進行定量分析。

1.7 總RNA提取和實時熒光定量PCR

為了檢測BAT標志物的表達情況，采用Trizol(美國Invitrogen公司)法提取了小鼠BAT組織的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，反應(yīng)條件為42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min，使用β-actin作為內(nèi)參，在 Light Cycler 96儀器(美國Roche公司)上檢測RNA 的表達情況，并進行統(tǒng)計分析。所需引物序列如下：UCP-1:正向引物5′-CTGCCAGGACAGTACCCAAG-3′,反向引物5′-TCAGCT GTTCAAAGCACACAAA-3′,PGC-1α:正向引物5′-TGTGTGCTGTGTGTCAGAGT-3′,反向引物5′-TGGTCGCTACACCACTTCAA-3′。

1.8 Western blotting法檢測

剪取脂肪組織加入到適量組織細胞裂解液中[含1%(質(zhì)量分數(shù))蛋白酶抑制劑]，勻漿后離心取上清，用BCA定量試劑盒測定蛋白濃度，用10%(質(zhì)量分數(shù))的SDS凝膠分離等量蛋白，再轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，用5%(質(zhì)量分數(shù))脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗4 ℃過夜，洗膜后再室溫孵育二抗1 h，再次洗膜，最后用凝膠成像系統(tǒng)曝光(美國自然基因科技有限公司，F(xiàn)lour Chem)，Image J軟件分析結(jié)果。其中一抗UCP-1(美國CST公司)、PGC1-α(美國CST公司)、Oxphos(美國Abcam公司)、ANGPTL4(美國CST公司)、β-actin(美國CST公司)的濃度是1∶1 000。

1.9 轉(zhuǎn)錄組測序RNA序列

取同齡野生、ANGPTL4 -/-小鼠同側(cè)BAT，Trizol法提取總RNA，取等量RNA(1 μg)建立 cDNA庫，進行RNA測序。采用參考文獻[7]方法，以偽發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)≤0.05為起點，篩選出戶差異表達基因再進行富集分析(R package edgeR)。

1.10 統(tǒng)計學方法

采用 GraphPad Prism統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤(mean±SE)表示，組間比較采用Student’sttest。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GLP-1類似物Ex-4對糖尿病db/db小鼠血糖血脂的作用

將8周齡的db/db小鼠皮下埋泵給藥Ex-4或者0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液，6周后，葡萄糖耐量實驗顯示，與埋泵0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液組相比，埋泵Ex-4組的小鼠血糖濃度在0、15、30、60、90、120 min 這6個時間點均降低，差異有統(tǒng)計學意義(圖1A)(P<0.05)。以FPLC分離空腹血脂蛋白，發(fā)現(xiàn)Ex-4降低了極低密度脂蛋白的三酰甘油，但對脂蛋白的膽固醇沒有影響(圖1B、C)。Ex-4組與0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液組比較，三酰甘油顯著降低[(1.36±0.21) mmol/Lvs(0.82±0.10) mmol/L，P=0.028)]，而膽固醇差異無統(tǒng)計學意義[(4.68±0.52) mmol/Lvs(3.58±0.37) mmol/L，P=0.110, 圖1D]。

圖1 GLP-1類似物Ex-4對糖尿病db/db小鼠血糖血脂的作用

將等量的肝臟和BAT進行三酰甘油和膽固醇定量，Ex-4處理降低了BAT三酰甘油的濃度[(10.45±2.64) mmol/μgvs(4.86±1.15) mmol/μg，P=0.044]，但肝臟三酰甘油濃度沒有變化[(1.68±0.12) mmol/μg 蛋白vs(1.50±0.17) mmol/μg，P=0.600](圖1E)，此外，與0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液組比較，Ex-4組肝臟和BAT的膽固醇濃度沒有顯著改變[肝臟：(2.31±0.12) mmol/μgvs(2.14±0.23) mmol/μg，P=0.620；BAT：(2.94±0.58) mmol/μgvs(3.45±0.49) mmol/μg，P=0.610]。

2.2 db/db小鼠的棕色脂肪活性

將Ex-4、0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液處理的db/db小鼠進行pet-CT分析BAT活性。與對照組相比，Ex-4處理有增加BAT活性的趨勢(2.23±0.10)% ID/gvs(2.50±0.09)% ID/g，P=0.056)(圖2A、B)。Western blotting法驗證了pet-CT的結(jié)果，Ex-4組BAT的UCP-1的表達是0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液組的1.5倍(P=0.041)(圖2C)。Ex-4組BAT的Oxphos組分ATP5A、MTCO1、SDHB的表達分別是0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液組的2.1倍(P=0.032)，1.8倍(P=0.350)，和2.3倍(P=0.090)(圖2E、F)。

圖2 Ex-4對db/db小鼠的棕色脂肪活性作用

2.3 棕色脂肪組織中ANGPTL4表達

檢測了db小鼠外周血和BAT中ANGPTL4的表達。與0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液組比較，Ex-4組ANGPTL4在外周血中濃度沒有變化[(7.61±0.97) ng/mLvs(7.57±1.05) ng/mL，P=0.980](圖3A)，但在BAT中表達增加了1.66倍(ANGPTL4/β-actin：0.89±0.12vs1.47±0.13，P=0.005)(圖3B、C)。

圖3 Ex-4對棕色脂肪組織中ANGPTL4作用

2.4 ANGPTL4-/-小鼠棕色脂肪活性

與野生對照組比較，ANGPTL4-/-小鼠表現(xiàn)為外周血低膽固醇和低三酰甘油[總膽固醇：(2.29±0.15) mmol/Lvs(1.42±0.14) mmol/L，P=0.001；總?cè)８视停?0.73±0.16) mmol/Lvs(0.33±0.03) mmol/L，P=0.015](圖4A)。ANGPTL4-/-小鼠空腹血糖和糖耐量與野生小鼠相似(圖4B)。當從BAT提取RNA，qPCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)ANGPTL4-/-小鼠UCP-1的表達濃度明顯低于正常野生組(圖4C)。與之相應(yīng)，與野生對照小鼠相比，ANGPTL4-/-小鼠BAT中ATP5A、MTCO1、SDHB和UCP-1的蛋白表達濃度分別降低了66%、57%、47%、53%(P<0.01)(圖4D、 E)。

圖4 ANGPTL4缺失棕色脂肪活性

2.5 ANGPTL4調(diào)節(jié)BAT活性分析

將野生、ANGPTL4-/-小鼠BAT進行RNA序列分析。與野生BAT相比，ANGPTL4-/-小鼠BAT有267個基因增加1.5倍及以上，有220個基因降低了1.5倍及以上(圖5A、 B)。富集分析結(jié)果顯示差異基因表達的前20個通路中,凋亡通路位居前5位，與野生小鼠相比，ANGPTL4-/-小鼠BAT細胞凋亡可能增加(圖5C)。

圖5 ANGPTL4調(diào)節(jié)BAT活性的機制

3 討論

迄今為止，眾多研究發(fā)現(xiàn)棕色脂肪細胞對能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用。其機制是，棕色脂肪細胞含有大量的脂滴和線粒體，通過線粒體UCP-1將大量質(zhì)子勢能轉(zhuǎn)化成能量；相反，白色脂肪細胞里線粒體數(shù)量很少，它是儲存能量的脂肪[8]。BAT位于肩胛骨區(qū)、頸部鎖骨上區(qū)、脊柱兩側(cè)，周圍富含毛細血管，細胞表面遍布交感神經(jīng)纖維，而交感神經(jīng)系統(tǒng)釋放的去甲腎上腺素正是活化BAT的經(jīng)典激活劑。隨著年齡的增長，BAT活性下降[9]。如何增加BAT活性，進而控制糖尿病代謝紊亂，正是目前研究熱點之一。

GLP-1類似物，即GLP-1受體激動劑，空腹下GLP-1分泌濃度很低，隨著進食，K細胞迅速分泌大量的GLP-1，它通過胰島β細胞表達GLP-1r，促進胰島素釋放[10]；抑制胰島α細胞釋放胰高血糖素[11]；它通過門靜脈的葡萄糖感受器上的GLP-1r，啟動迷走神經(jīng)反射回路，將信號傳導到下丘腦，調(diào)控進食和延遲胃排空[12]。研究[10]顯示，給野生小鼠腦室注射GLP-1類似物Ex-4，可以刺激胰島素釋放，而對GLP-1r-/-小鼠沒有刺激作用，這提示在腦室中有GLP-1r的表達。因為空腹下GLP-1濃度很低，并不刺激胰島素釋放，這一優(yōu)點大大降低了糖尿病患者治療時出現(xiàn)低血糖的概率。此外，GLP-1能有效降低血糖、減重，對心肌細胞[13-14]、血管內(nèi)皮細胞[13，15]、腎臟[16]等具有保護作用，還降低高脂飲食下VLDL生成，對脂肪肝有抑制作用[17-18]?？傊珿LP-1具有調(diào)控血脂代謝，對胰島、心臟、腎臟等器官具有保護作用。

GLP-1對脂肪組織具有重要調(diào)控作用：GLP-1受體在腦室和脂肪組織表達[3，19]，在白色脂肪方面，GLP-1促進葡萄糖的攝取和脂肪分解[16]，給高脂小鼠注射GLP-1，可以增加白色脂肪UCP-1的表達，提示GLP-1增加米色脂肪活性[20]；在棕色脂肪方面，GLP-1促進BAT的產(chǎn)熱：給野生和GLP-1r-/-小鼠喂飼高脂飲食，室溫下能量消耗相似，但低溫下GLP-1r-/-小鼠產(chǎn)能明顯下降，提示GLP-1r-/-小鼠BAT功能下降[19]。目前研究[21-22]報道的GLP-1調(diào)節(jié)BAT的機制是：GLP-1通過腦室GLP-1r刺激交感神經(jīng)，釋放去甲腎上腺素，增加BAT活性。

糖尿病合并非乙醇性脂肪肝患者高達糖尿病患者群體的70%～75%[23]。對NASH患者研究[24]發(fā)現(xiàn)，GLP-1可降低脂肪合成，以及脂肪分解成游離脂肪酸，改善了肝臟對胰島素的敏感性。在本研究中，GLP-1受體激動劑Ex-4降低了糖尿病db/db小鼠外周血和BAT中三酰甘油濃度，但不影響肝臟三酰甘油濃度。因此，GLP-1受體激動劑對血脂和組織器官內(nèi)膽固醇和三酰甘油的代謝作用，有待進一步研究。

三酰甘油為棕色脂肪細胞提供能量來源，而ANGPTL4對三酰甘油代謝具有重要調(diào)控作用。ANGPTL4屬于類血管生成家族成員，它從多種細胞分泌。當ANGPTL4分泌入血后，它被分解為N-末端片段(含有抑制脂蛋白酯酶活性區(qū)，可形成低聚物)和C-末端片段(含有纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)，保持單聚體狀態(tài))[25-26]。ANGPTL4的表達受胰島素調(diào)節(jié)：在正常人做葡萄糖鉗夾測試表明，胰島素降低脂肪組織ANGPTL4的表達和外周血的ANGPTL4濃度[27]；當外周血中游離脂肪酸的增加，可以增加過氧化物酶體增生物激活受體γ的活性，促進其靶基因ANGPTL4的表達[28]；炎性反應(yīng)刺激巨噬細胞分泌ANGPTL4[5]。本研究結(jié)果提示ANGPTL4參與調(diào)控BAT活性，擴展了對該蛋白生理病理功能的認識。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示GLP-1促進棕色脂肪活性伴有ANGPTL4表達濃度的升高，ANGPTL4的缺失降低了棕色脂肪活性和功能，可能成為棕色脂肪活性調(diào)控的治療靶點，在ANGPTL4缺失小鼠中，Ex-4是否還能促進BAT活性尚不明確，還有待進一步的研究。