原肌球蛋白1與膠質(zhì)瘤放射敏感性的體外研究

王冉冉，杜華情，楊坤，王臻，趙夢潔，李泰平，錢春發(fā)，劉宏毅，肖紅

腦膠質(zhì)瘤是成年人最常見的原發(fā)性腦腫瘤之一，占所有發(fā)生于大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤中的74.6%[1]。雖然腦膠質(zhì)瘤在所有癌癥中所占的比例不到1%[2]，但其死亡率和發(fā)病率卻很高。膠質(zhì)瘤患者2年生存率約為15%，中位總生存期為14 ～17個月[3-4]。目前臨床治療膠質(zhì)瘤的方法主要是手術(shù)治療、化療和放療。放射治療是治療惡性腫瘤有效的非手術(shù)治療方法之一，大約50%的癌癥患者在治療過程中會接受放射治療[5]；但由于膠質(zhì)瘤細胞的放射抵抗性，導(dǎo)致放射治療效率較低。因此，尋找提高膠質(zhì)瘤的放射敏感性的可能靶點具有重要臨床意義。原肌球蛋白(tropomyosin,TM)是一種由100% α-螺旋纖維蛋白構(gòu)成的螺旋狀二聚體，廣泛分布于真核細胞中。在脊椎動物中，TM主要分成兩類：含248～291個氨基酸殘基的高分量組(high molecular weight，HMW) 和含 245～251個氨基酸殘基的低分量組(low molecular weight，LMW)。在哺乳動物中，TM家族含有4種基因，即原肌球蛋白1(tropomyosin-1,TPM1)(α基因)、 TPM2(β基因)、 TPM3(γ基因)、TPM4(δ基因)，可以產(chǎn)生20種以上的同源異構(gòu)體[6]；影響細胞活力、細胞粘附和細胞外的相互作用，通過細胞增殖、遷移和侵襲參與癌細胞轉(zhuǎn)移[7-8]。TPM1是TM家族中的一員，是多種細胞中的一種與肌動蛋白結(jié)合的細胞骨架蛋白。在肌肉細胞中，TPM1通過與肌動蛋白和肌鈣蛋白直接作用來調(diào)節(jié)肌肉的收縮[9]。在非肌肉細胞中，TPM1主要作為肌動蛋白絲來穩(wěn)定細胞骨架[10]，也作為細胞形態(tài)轉(zhuǎn)化抑制劑在非肌肉細胞中發(fā)揮作用[11]。在正常細胞中，TPM1在細胞間傳導(dǎo)生長刺激信號，維持細胞正常骨架形態(tài)，抑制細胞惡性轉(zhuǎn)化[12]。一旦 TPM1缺失或突變，將導(dǎo)致細胞惡性轉(zhuǎn)化。雖有研究報道TPM1在膠質(zhì)母細胞瘤中的表達有下降趨勢，并發(fā)揮抑癌基因的功能[13]，但其與放射敏感性的關(guān)系仍不清楚。

本研究采用人腦膠質(zhì)瘤U251細胞株進行體外實驗，沉默和過表達TPM1來研究其與膠質(zhì)瘤U251細胞放射抵抗性之間的關(guān)系，進一步探討其對膠質(zhì)細胞瘤的影響，為尋找提高膠質(zhì)瘤放射敏感性的可能靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株U251(南京凱基生物技術(shù)公司)，人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251放射抵抗細胞株(RR-U251)[14]，DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，雙抗(Gibco)，RIPA蛋白提取液、兔源性TPM1多克隆抗體，鼠抗β-tubulin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(南京生興生物有限公司)，BD基質(zhì)膠(Invitrogen)，LipotamineTM2000(Invitrogen)，全自動酶標(biāo)儀(Labsystems Multiskan Ascent)，熒光倒置顯微鏡(Carl Ziess Axiovert)，流式細胞分選儀(BD FACScan)，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(CLINX BIO-RAD)，流式細胞分析儀(BD Calibur)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人腦膠質(zhì)瘤U251細胞株用10%胎牛血清和1%雙抗配制的DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃、飽和濕度、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，每隔24 h更換1次培養(yǎng)液；隨后視細胞生長情況及培養(yǎng)液顏色更換培養(yǎng)液。處于對數(shù)生長期的細胞可用于傳代或相關(guān)實驗。

1.2.2 建立沉默和過表達TPM1細胞 采用上海吉瑪公司合成shRNAs-TPM1和pcDNA3.1-TPM1質(zhì)粒。用Western blot法檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后TPM1蛋白的表達水平。將shRNAs-TPM1(pcDNA3.1-TPM1)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入細胞中，建立沉默(過表達)TPM1細胞。將U251和RR-U251細胞，分別以1×105個/mL的密度接種于6孔板中，無雙抗培養(yǎng)液培養(yǎng)。待細胞匯合度約為80%時按試劑說明書的步驟進行轉(zhuǎn)染，在熒光倒置顯微鏡下觀察熒光強度及細胞數(shù)量，計算轉(zhuǎn)染效率。繼續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染成功的細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 細胞增殖能力檢測 用MTT法檢測細胞增殖活力。各組細胞進行放射治療，收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸浮濃度，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，100 μL/孔。每組細胞設(shè)6個復(fù)孔，置于5% CO2、37 ℃孵育箱培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，37 ℃孵育。4 h后，棄去孔中培養(yǎng)液，拍干，每孔加入150 μL DMSO，小心震搖，使紫藍色甲瓚結(jié)晶完全溶解；在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的OD值，檢測波長570 nm，計算細胞增殖活力[15]。

1.2.4 細胞遷移能力檢測 采用劃痕實驗檢測細胞的遷移能力。預(yù)先在6孔板背后用marker筆均勻劃4條直線；將放射治療后的處于對數(shù)期的各組細胞接種到6孔板中，每孔約為5×105個細胞。用無菌10 μL移液器吸頭從匯合度約為80%～90%的細胞層上劃過，劃痕區(qū)域約為1～2 mm寬。D-Hanks液洗去懸浮細胞，清洗3次后，用無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。劃痕0 h及24 h后在倒置顯微鏡下分別觀察拍照，用ImageJ軟件計算各組細胞 24 h內(nèi)遷移面積的變化率。

1.2.5 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell小室法檢測細胞的侵襲能力。用無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)液將Matrigel按1∶8比例稀釋，吸取50 μL的Matrigel稀釋液于Transwell的上室中，在37 ℃培養(yǎng)箱中放置2 h。收集經(jīng)放射治療后的各組細胞，用無血清DMEM培養(yǎng)液清洗3次，配制成密度為5×105個/mL的細胞懸液。用無血清DMEM培養(yǎng)液清洗Matrigel 1次。吸取100 μL的細胞懸液于Transwell上室中；吸取500 μL含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于Transwell下室中；在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出Transwell上室后用D-Hanks液清洗2遍，脫水醇固定30 min；用0.1%結(jié)晶紫染色上室30 min，D-Hanks液清洗2次，棉簽擦去上室內(nèi)細胞，在倒置熒光顯微鏡下觀察，細胞計數(shù)。

1.2.6 細胞凋亡率檢測 用流式細胞儀檢測細胞的凋亡。收集對數(shù)期的各組細胞鋪于25 mL的細胞培養(yǎng)瓶，1×106個/mL；用60Co γ射線照射10 min，劑量率和劑量分別為0.5 Gy、5 Gy。D-Hanks液清洗細胞2次后收集細胞；用D-Hanks液重懸細胞，調(diào)整為單細胞懸液，用75%冰乙醇固定。4℃過夜后，離心，棄上清液，重懸細胞，加入100 μL的PI及RnaseA混合液，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.7 TPM1蛋白表達檢測 采用Western blot法。總蛋白的提取按照RIPA蛋白提取液說明書操作。用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度，將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度(1～3 μg/μL)；灌制10%的SDS-PAGE膠，恒壓100 V電泳分離蛋白樣品。電泳后除去凝膠，將其浸入轉(zhuǎn)移溶液中10 min，量取面積稍大于膠的PVDF膜，用甲醇浸濕，并浸入轉(zhuǎn)移液中10 min。將膜和膠夾在上下3層濾紙之間，形成三明治夾心；壓緊后置于半干轉(zhuǎn)移槽中，1.25 mA/cm2恒流轉(zhuǎn)移55 min。目的蛋白條帶出現(xiàn)后，漂洗PVDF膜數(shù)次。轉(zhuǎn)移后的PVDF膜置于5%脫脂奶粉中搖床上封閉2 h[16]，加入一抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶10 000)孵育2 h。用ECL發(fā)光液試劑檢測條帶，化學(xué)發(fā)光成像儀和Gel Analysis軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 U251與RR-U251細胞的TPM1蛋白水平比較 與U251細胞相比，RR-U251細胞的TPM1蛋白水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖1)。結(jié)果表明TPM1與U251細胞的放射敏感性有關(guān)，放射抵抗細胞的TPM1蛋白表達水平明顯下降。

2.2 沉默及過表達TPM1細胞系的建立 Western blot測定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的TPM1蛋白表達水平顯示，轉(zhuǎn)染12 h后轉(zhuǎn)染效率達到約55%(圖2A)；shRNA-TPM1-Homo-614對TPM1表達的抑制效果好(圖2B)，且在48 h抑制效果最好(圖2C)，抑制率達到43.7%。轉(zhuǎn)染shRNA-TPM1質(zhì)粒(pcDNA3.1-TPM1質(zhì)粒)48 h后明顯降低(提高)U251細胞或RR-U251細胞的TPM1蛋白表達水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05-0.01)(圖2D、E)。

2.3 TPM1聯(lián)合放射治療對細胞增殖能力的影響 放射治療后，沉默TPM1的U251細胞的增殖能力升高21.02%，放射敏感性降低；過表達TPM1的U251細胞的增殖能力降低11.76%，放射敏感性增高；與U251細胞比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(圖3A)。同樣放射治療后，過表達TPM1的RR-U251細胞的增殖能力下降17.34%，沉默TPM1的RR-U251細胞的增殖能力升高22.28%；與RR-U251細胞比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(圖3B)。表明放射治療后，TPM1可以抑制U251及RR-U251細胞的增殖，提高膠質(zhì)瘤細胞的放射敏感性。

2.4 TPM1聯(lián)合放射治療對細胞遷移能力的影響 劃痕的實驗結(jié)果顯示，放射治療后，沉默TPM1的U251細胞的遷移能力增強33.66%，過表達TMP1的U251細胞的遷移能力減弱43.99%；與正常U251細胞比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.001)(圖4A)。放射治療后，沉默TPM1的RR-U251細胞的遷移率與RR-U251細胞相比增強38.57%，過表達TPM1的RR-U251細胞的遷移能力降低54.42%；與RR-U251細胞相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05-0.001)(圖 4B)。表明放射治療后，TPM1抑制U251和RR-U251細胞的遷移能力，TPM1能提高膠質(zhì)瘤細胞的放射敏感性。

2.5 TPM1聯(lián)合放射治療對細胞侵襲能力的影響放射治療后，沉默TPM1的U251細胞的侵襲能力增強42.86%，TPM1過表達的U251細胞的侵襲能力降低63.81%；與正常U251細胞比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05-0.01)。同樣放射治療后，沉默TPM1的RR-U251細胞侵襲能力增強32.12%，過表達TPM1的RR-U251細胞的侵襲能力降低65.75%；與RR-U251細胞比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05-0.01)(圖5)。表明放射治療后，過表達TPM1的U251及RR-U251細胞的侵襲力均下降，細胞的放射敏感性增加。

2.6 TPM1聯(lián)合放射治療對細胞凋亡能力的影響 放射治療后，沉默TPM1的U251細胞的凋亡率下降48.67%(P<0.01)，過表達TPM1的U251細胞的凋亡率升高19.16%(P<0.05)；與正常U251細胞比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。放射治療后，沉默TPM1的RR-U251細胞的凋亡率下降48.86%(P<0.01)；過表達TPM1的RR-U251細胞的凋亡率升高22.04%(P<0.05)；與RR-U251相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(圖6)。表明放射治療后，TPM1可以促進U251細胞與RR-U251細胞的凋亡，提高細胞的放射敏感性。

3 討 論

近年來，腦腫瘤的發(fā)病率呈上升趨勢，而腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤。放射治療是腫瘤患者確診后的主要治療方式，與化療相比全身的不良反應(yīng)相對較少，具有局部控制腫瘤的優(yōu)勢。雖然放療可以提高膠質(zhì)瘤患者的生存率，但是由于膠質(zhì)瘤細胞產(chǎn)生獲得性的放射抵抗導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，使得放療的療效受到限制。放射線會直接造成細胞的DNA損傷，包括雙鏈斷裂、單鏈斷裂以及DNA分子的交聯(lián)等。DNA損傷后，DNA損傷應(yīng)答(DNA-damage response，DDR)通過啟動和協(xié)調(diào)DNA修復(fù)機制和激活細胞周期檢驗點，暫時阻滯細胞周期進展，修復(fù)損傷后的DNA，維持基因組的穩(wěn)定性[16]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶活化產(chǎn)生的NADPH和Ru-5-P，可促進DNA損傷的修復(fù)；導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細胞產(chǎn)生放療抵抗[17]。而抑制PTEN磷酸化可阻斷DNA損傷修復(fù)，增強膠質(zhì)瘤的放射敏感性[18]。如果在細胞周期停滯期間嚴(yán)重的DNA損傷不能被修復(fù)，就會激活與凋亡相關(guān)的信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡。而Notch通路[19]、Wnt/β-catenin通路[20]、ATM/Chk2/p53通路[21]、STAT3通路[22]等與膠質(zhì)瘤放射抵抗相關(guān)的信號通路被激活后，會抑制細胞的凋亡，促進膠質(zhì)瘤細胞產(chǎn)生放射抵抗。

TPM1是一種與肌動蛋白結(jié)合的細胞骨架蛋白，在正常細胞的極性的維持、運動、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著作用。研究表明，TPM1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要的作用。在細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，來自TPM1和TPM2的HMW異構(gòu)體經(jīng)常被下調(diào)或丟失，使得HMW的TPM受到持續(xù)的抑制。Prasad等首先報道了TPM1的表達在乳腺癌中下調(diào)，并作為腫瘤抑癌基因發(fā)揮作用[12]。隨后的研究表明，在肝內(nèi)膽管癌[23]、膀胱尿路上皮癌[24]、胃癌[25]、膠質(zhì)瘤[14]中，TPM1的表達水平也呈下降趨勢。以TPM1為代表的細胞關(guān)鍵骨架蛋白的下調(diào)，會促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。如miRNA-183-5p.1通過下調(diào)TPM1表達使Bcl-2/P53信號通路失活，促進胃癌細胞的遷移和侵襲[25]；丹參酮ⅡA通過下調(diào)由miR-21-5p介導(dǎo)的TPM1，來抑制血管平滑肌細胞的遷移[26]；在腎癌中TPM1可以抑制OSRC-2和786-O兩種腎癌細胞系的遷移和侵襲[27]。本研究結(jié)果表明，與U251細胞相比，RR-U251細胞的TPM1蛋白表達水平顯著降低。TPM1表達水平的改變會重塑細胞骨架，并影響肌動蛋白絲的穩(wěn)定性及其組裝動力學(xué)[28]。穩(wěn)定聚合的肌動蛋白絲也被稱為應(yīng)力纖維，應(yīng)力纖維對于細胞產(chǎn)生向前移動和向后收縮的力都是至關(guān)重要的。TPM1可誘導(dǎo)應(yīng)力纖維產(chǎn)生，TPM1的N末端結(jié)構(gòu)修飾會破壞應(yīng)力纖維組織，從而影響細胞的形態(tài)、運動性和穩(wěn)定性，消除TPM1的抑癌作用，導(dǎo)致細胞惡性轉(zhuǎn)化[29]。然而，對TPM1介導(dǎo)的細胞骨架功能和腫瘤抑制的分子機制仍知之甚少。本研究首次探討了TPM1與放射敏感性的關(guān)系。放射治療后，沉默TPM1的U251細胞和RR-U251細胞的遷移和侵襲能力均顯著提高。反之，過表達TPM1的U251細胞和RR-U251細胞的遷移和侵襲能力顯著下降。結(jié)果表明，TPM1作為抑癌基因與膠質(zhì)瘤的放射抵抗密切相關(guān)。

TPM1在細胞增殖和凋亡中也起著重要作用。正常膀胱尿路上皮細胞含有大量的TPM1和TPM2的HMW TPM異構(gòu)體。如果DNA受損，TPM1通過與長鏈非編碼RNA母系印記基因3(maternally expressed genes 3,MEG3)的協(xié)同作用，導(dǎo)致大部分細胞停滯在G0/G1期，處于G2/M期的細胞數(shù)量下降，促進細胞凋亡，抑制膀胱尿路上皮癌細胞的增殖[24]。也有文獻報道，TPM1通過p53介導(dǎo)的線粒體途徑抑制腎癌細胞的增殖，促進腎癌細胞凋亡[30-31]。TPM1的過表達也與口腔鱗狀細胞癌[32]、膽管癌[23]凋亡率增高有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，放射治療后上調(diào)TPM1可以抑制RR-U251和U251細胞的增殖，促進RR-U251和U251細胞的凋亡；而在沉默TPM1的細胞中，細胞的增殖率增高、凋亡率降低。因此，TPM1在膠質(zhì)瘤的增殖和凋亡進程中起著重要的調(diào)控作用，與放射抵抗密切相關(guān)。

綜上所述，放射治療后，沉默TPM1基因可誘導(dǎo)人膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡，間接影響其對放射的敏感性；而過表達TPM1基因則可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。本研究結(jié)果初步揭示了TPM1在人膠質(zhì)母細胞瘤細胞放射治療中的重要作用；TPM1可能是改善膠質(zhì)瘤放射敏感性的潛在靶點。但TPM1與放射抵抗的確切機制還有待進一步的研究證實。