補(bǔ)腎益髓方及其拆方調(diào)控實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠軸突再生抑制信號(hào)通路相關(guān)分子的實(shí)驗(yàn)研究

王 蕾 安 辰 趙 暉 薛 冰 齊 放 李君玲 金良韻 張 楠 樊永平

(1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中醫(yī)臨床方藥學(xué)系 中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100069；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院中醫(yī)科，北京 100070)

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的炎性神經(jīng)退行性病變[1-2]，研究[3]顯示，軸突缺損是MS患者持續(xù)性神經(jīng)功能障礙的主要原因。因此，促進(jìn)軸突再生也是治療MS的重要環(huán)節(jié)[4]。目前西醫(yī)采用免疫治療(如激素、干擾素等)以控制其炎性反應(yīng)，減輕軸突損傷，但長(zhǎng)期大量使用，不良反應(yīng)明顯[5]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)神經(jīng)再生修復(fù)方面仍無(wú)安全有效的方法。補(bǔ)腎益髓方(Bushen Yisui formula，BSYSF)是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院中醫(yī)科樊永平教授研發(fā)的一首治療MS的有效方劑，并開(kāi)發(fā)為膠囊制劑。本方具有補(bǔ)腎兼化痰活血之功，前期研究[6-8]顯示，BSYSF能顯著改善MS患者的臨床癥狀，提高患者的生活質(zhì)量。本方對(duì)MS的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠也具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，并能促進(jìn)神經(jīng)再生[9-12]，但其促進(jìn)軸突再生的作用機(jī)制仍不清楚。大量的研究表明，軸突損傷后神經(jīng)再生抑制因子增多是阻礙軸突再生的重要因素之一[13]，NogoA是具有較強(qiáng)抑制作用的因子，含有66個(gè)氨基酸殘基組成的胞外結(jié)構(gòu)域[14-15]，NgR是Nogo-66的主要受體，表達(dá)于軸突和神經(jīng)元表面[16]，并且能與p75/TROY-LINGO-1形成受體復(fù)合物，將信號(hào)傳入細(xì)胞，從而導(dǎo)致RhoA及其下游分子Rho相關(guān)激酶(Rho-associated kinase, ROCK)的活化[17]。其中ROCKⅡ主要在腦及脊髓中表達(dá)，這些分子激活后引起肌球蛋白解聚、微絲等細(xì)胞骨架重排，從而導(dǎo)致神經(jīng)突起回縮及生長(zhǎng)錐塌陷[18-19]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，利用EAE小鼠模型，采用實(shí)時(shí)熒光定量-PCR(quantitative real time-PCR，qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)小鼠腦和脊髓中神經(jīng)再生抑制因子NogoA/NgR及其信號(hào)通路RhoA/ROCK mRNA表達(dá)，同時(shí)結(jié)合免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)及蛋白質(zhì)印跡(Western blotting, WB)法測(cè)定上述因子蛋白表達(dá)，深入探討B(tài)SYSF及其拆方補(bǔ)腎方(Bushen formula，BSF)和化痰活血方(Huatan Huoxue formula，HTHXF)促進(jìn)軸突再生的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡SPF級(jí)C57BL/6雌性小鼠，體質(zhì)量15～17 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK(京)2012-0001，在首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。小鼠飼置于恒溫(18 ℃～22 ℃)恒濕(40%～60%)的單籠獨(dú)立通風(fēng)系統(tǒng)中，自由飲食喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。所有實(shí)驗(yàn)步驟均經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 藥物及試劑

BSYSF(生地黃、熟地黃、制何首烏、浙貝母、益母草、全蝎、水蛭、天麻、連翹、酒大黃)及其拆方BSF(生地黃、熟地黃、制何首烏)和HTHXF(浙貝母、益母草、全蝎、水蛭、天麻、連翹、酒大黃)均由中國(guó)北京亞?wèn)|生物制藥有限公司制備，其簡(jiǎn)要的制備方法為：以上除浙貝母外的9味中藥煎煮濃縮成稠膏，再將浙貝母研粉加入到膏中混勻備用。醋酸潑尼松片(prednisone acetate，PA)由中國(guó)天津力生制藥有限公司生產(chǎn)；梓醇(catapol，CA)購(gòu)于中國(guó)杭州康木科技有限公司。

髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55(myelin oligodendrocyte glycoprotein35-55，MOG35-55)純度>98%，由中國(guó)北京旭和源生物科技有限公司合成；百日咳毒素(pertussis toxin，PTX)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(貨號(hào)：P7208)；結(jié)核分枝桿菌(tuberculosis mycobacterium, TB)購(gòu)自美國(guó)Difco公司(貨號(hào)：231141)；完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(貨號(hào)：F5881)；NogoA抗體(貨號(hào)：ab62024)、NgR抗體(貨號(hào)：ab26291)、ROCKⅡ抗體(貨號(hào)：ab125025)均購(gòu)自于英國(guó)Abcam公司；RhoA抗體(貨號(hào)：2117S)購(gòu)自德國(guó)CST公司。

1.3 EAE小鼠模型制備

將MOG35-55、CFA和TB混合，在20 mL注射器內(nèi)反復(fù)抽推1 h，制成油包水乳劑，MOG為50 μg/只，TB為0.4 mg/只，用0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液配制。分別于第0天及第7天給每只造模小鼠背部四點(diǎn)皮下注射0.2 mL抗原乳劑，在第0及第2天分別腹腔注射500 ng PTX。

1.4 分組及給藥

將小鼠按照數(shù)字表法隨機(jī)分為7組：正常對(duì)照(normal control，NC)、模型(model，MO)、PA、CA、BSYSF、BSF和HTHXF組,每組16只。免疫當(dāng)天開(kāi)始給予小鼠相應(yīng)藥物灌胃，PA劑量為6 mg/kg，CA為40 mg/kg，BSYSF、BSF和HTHXF分別為生藥3.02、1.44和1.57 g /kg。NC及MO組小鼠以等量蒸餾水替代。1次/d，連續(xù)40 d。

1.5 取材及處理

在發(fā)病第25天(急性期)和第40天(緩解期)，選取4只小鼠10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水合氯醛(190 mg/kg)腹腔注射麻醉，4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛心臟灌流，取腦和脊髓，并置于4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛中固定1周。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，以2 μm厚度連續(xù)切片用于IHC測(cè)定；選取4只小鼠快速取出大腦及脊髓，置于液氮中，之后放置于-80 ℃冰箱保存，用于qRT-PCR和WB檢測(cè)。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 qRT-PCR測(cè)定小鼠腦和脊髓中NogoA/NgR/RhoA/ROCKⅡmRNA的表達(dá)

取小鼠大腦及脊髓30～50 mg，根據(jù)RNA Prep Pure動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(貨號(hào)：DP431，中國(guó)天根生化科技有限公司)的說(shuō)明提取總RNA。用Molecular Devices酶標(biāo)儀(型號(hào)：SpectraMax Plus 384型，美國(guó) Molecular Devices公司)檢測(cè)總RNA的濃度和純度，取A260/A280在1.8～2.2的RNA樣品做下一步實(shí)驗(yàn)，RNA的完整性通過(guò)凝膠電泳來(lái)確定。根據(jù)TIAN Script cDNA第一鏈合成試劑盒(貨號(hào)：KR104，中國(guó)天根生化科技有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。引物由TaKaRa公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列詳見(jiàn)表1。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，54 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共循環(huán)40次，4 ℃保存。以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參對(duì)照，用2-△△Ct表示基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 各指標(biāo)引物序列

1.6.2 IHC法測(cè)定小鼠腦和脊髓中NogoA/NgR/RhoA/ROCKⅡ蛋白的表達(dá)

小鼠腦和脊髓切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇洗脫至水，磷酸鹽緩沖液沖洗，微波抗原修復(fù)后，用3%(體積分?jǐn)?shù))H3O3室溫孵育10 min。滴加一抗稀釋液NogoA(腦1∶200，脊髓1∶350)、NgR(腦1∶300，脊髓1∶350)、RhoA(1∶300)和ROCKⅡ(腦1∶100，脊髓1∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜，37 ℃復(fù)溫1 h，依次加入二抗試劑，置于37 ℃下孵育，DAB顯色，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡(型號(hào)：CX23型，中國(guó)北京銳馳恒業(yè)儀器有限公司)每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不重疊視野觀察照相，并通過(guò)NIS-Elements BR 3.2軟件測(cè)定積分吸光度(absorbance，A)值。

1.6.3 WB法測(cè)定小鼠腦和脊髓中NogoA/NgR/RhoA/ROCKⅡ蛋白的表達(dá)

提取小鼠大腦及脊髓組織蛋白，按BCA法進(jìn)行蛋白定量，取21 μg蛋白樣品進(jìn)行10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，300 mA電轉(zhuǎn)60 min，麗春紅染色，5 % (質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉封閉1 h，加入NogoA(1∶20 000)、NgR(1∶5 000)、RhoA(腦1∶20 000，脊髓1∶5 000)、ROCKⅡ(1∶5 000)和GAPDH(1∶20 000)一抗稀釋液4 ℃孵育過(guò)夜，洗滌后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶20 000)，搖床室溫孵育90 min，于暗室進(jìn)行膠片曝光、顯影和定影。通過(guò)Image J圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH條帶比值表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 BSYSF及其拆方BSF和HTHXF對(duì)小鼠腦和脊髓中NogoA/NgR/RhoA/ROCKⅡmRNA的調(diào)節(jié)作用

qRT-PCR測(cè)定結(jié)果顯示，小鼠免疫第25天和第40天，與NC組比較，MO組小鼠腦和脊髓組織中NogoA 和NgR mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05，P<0.01)，而各治療組小鼠腦和脊髓NogoA和NgR mRNA 表達(dá)較MO組明顯下調(diào)(P<0.05，P<0.01)。詳見(jiàn)表2，3。

表2 各組小鼠腦及脊髓中NogoA mRNA的表達(dá)變化

GroupNumber of caseBrainSpinal cordDay 25Day 40Day 25Day 40NC40.84±0.170.83±0.130.64±0.200.64±0.26MO41.60±0.12*1.87±0.10*1.58±0.28*1.60±0.28*PA40.95±0.13#0.88±0.27#0.72±0.27#0.68±0.25#CA40.96±0.19#0.84±0.15#0.74±0.27#0.71±0.26#BSYSF40.87±0.12#0.84±0.26#0.73±0.25#0.65±0.18#BSF40.88±0.11#0.85±0.08#0.74±0.22#0.73±0.22#HTHXF40.96±0.18#0.86±0.25#0.73±0.21#0.71±0.25# NC: normal control; MO:model; PA:prednisone acetate; CA:catapol; BSYSF:Bushen Yisui Formula; BSF:Bushen formula; HTHXF:Huatan Huoxue formula; *P<0.05 vs NC group;#P<0.05 vs MO group.

表3 各組小鼠腦及脊髓中NgR mRNA的表達(dá)變化

GroupNumber of caseBrainSpinal cordDay 25Day 40Day 25Day 40NC40.44±0.100.44±0.110.79±0.060.79±0.03MO41.34±0.30**1.85±0.57*1.14±0.10*1.15±0.10*PA40.48±0.07#0.67±0.21#0.86±0.05#0.81±0.01#CA40.61±0.08#0.73±0.28#0.84±0.06#0.80±0.05#BSYSF40.45±0.03##0.50±0.10#0.87±0.04#0.80±0.09#BSF40.59±0.02#0.50±0.08#0.85±0.11#0.82±0.09#HTHXF40.63±0.11#0.65±0.24#0.86±0.03#0.82±0.09# NC: normal control; MO: model; PA: prednisone acetate; CA: catapol; BSYSF: Bushen Yisui formula; BSF: Bushen formula; HTHXF: Huatan Huoxue formula; *P<0.05, **P<0.01 vs NC group;#P<0.05, ##P<0.01 vs MO group.

如表4所示，MO組小鼠腦中RhoA和ROCKⅡ mRNA表達(dá)也明顯上調(diào)(P<0.05，P<0.01)。各治療組小鼠腦RhoA mRNA表達(dá)較MO組均有不同程度的下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。但在小鼠脊髓中，與MO組比較，只有PA與BSYSF組小鼠RhoA mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)。免疫第25天和第40天，與NC組比較，MO組小鼠腦與脊髓中ROCK Ⅱ mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05，P<0.01)。各治療組ROCK Ⅱ mRNA表達(dá)較MO組均有不同程度的明顯下調(diào)(P<0.05，P<0.01)。詳見(jiàn)表5。

表4 各組小鼠腦及脊髓中RhoA mRNA的表達(dá)變化

GroupNumber of caseBrainSpinal cordDay 25Day 40Day 25Day 40NC40.81±0.030.81±0.090.83±0.100.83±0.12MO41.32±0.06*1.31±0.15*1.01±0.101.08±0.16PA40.81±0.02#0.81±0.13#0.27±0.01##0.32±0.11##CA40.86±0.03#0.87±0.05#0.62±0.150.56±0.01BSYSF40.82±0.15#0.84±0.01#0.29±0.03##0.30±0.05##BSF40.85±0.11#0.85±0.02#0.55±0.160.78±0.18HTHXF40.88±0.04#0.85±0.08#0.59±0.150.78±0.16 NC: normal control; MO: model; PA: prednisone acetate; CA: catapol; BSYSF: Bushen Yisui formula; BSF: Bushen formula; HTHXF: Huatan Huoxue formula;*P<0.05 vs NC group;#P<0.05, ##P<0.01 vs MO group.

表5 各組小鼠腦及脊髓中ROCKⅡ mRNA的表達(dá)變化

GroupNumber of caseBrainSpinal cordDay 25Day 40Day 25Day 40NC40.87±0.060.87±0.100.87±0.070.87±0.05MO41.24±0.12**1.22±0.11*1.23±0.09*1.25±0.10**PA40.93±0.03#0.88±0.07##0.80±0.08##0.89±0.01#CA40.95±0.04#0.95±0.04#0.93±0.10#0.91±0.09#BSYSF40.87±0.02##0.88±0.02##0.76±0.08##0.85±0.05##BSF40.97±0.04#0.95±0.04#0.92±0.02#0.91±0.08#HTHXF40.99±0.07#0.96±0.07#0.94±0.02#0.91±0.05# NC: normal control; MO: model; PA: prednisone acetate; CA: catapol; BSYSF: Bushen Yisui formula; BSF: Bushen formula; HTHXF: Huatan Huoxue formula; *P<0.05, **P<0.01 vs NC group;#P<0.05, ##P<0.01 vs MO group.

2.2 BSYSF及其拆方BSF和HTHXF對(duì)小鼠腦和脊髓中NogoA/NgR/RhoA/ROCK Ⅱ免疫病理的調(diào)節(jié)作用

IHC測(cè)定結(jié)果顯示，發(fā)病第25天和第40天，MO組小鼠腦和脊髓中NogoA、NgR、RhoA和ROCK Ⅱ表達(dá)較NC組明顯升高(P<0.01，P<0.001)，各治療組小鼠腦和脊髓中上述指標(biāo)的蛋白表達(dá)與MO組相比均有明顯下降(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。詳見(jiàn)圖1～8及表6～9。

圖1 各組小鼠腦中NogoA表達(dá)變化

圖2 各組小鼠脊髓中NogoA的表達(dá)變化

圖3 各組小鼠腦中NgR的表達(dá)變化

圖4 各組小鼠脊髓中NgR的表達(dá)變化

圖5 各組小鼠腦中RhoA的表達(dá)變化

圖6 各組小鼠脊髓中RhoA的表達(dá)變化

圖7 各組小鼠腦中ROCK Ⅱ的表達(dá)變化

圖8 各組小鼠脊髓中ROCKⅡ的表達(dá)變化

表6 各組小鼠腦及脊髓中NogoA的表達(dá)變化

表7 各組小鼠腦及脊髓中NgR的表達(dá)變化

GroupNumber of caseBrainSpinal cordDay 25Day 40Day 25Day 40NC415.07±1.9516.40±1.0721.20±0.9722.70±1.36MO432.98±1.76***24.06±1.48**30.06±1.18***27.79±1.31**PA423.89±1.75##18.29±1.05#24.06±1.51#23.13±1.83#CA424.21±1.85##18.34±1.59#24.06±1.28#23.59±1.49#BSYSF416.17±1.31###17.98±1.66##21.13±1.45###22.11±1.26##BSF426.58±1.60#18.03±1.26#24.51±1.45#22.99±1.14#HTHXF426.02±1.66#18.54±1.57#25.30±1.47#23.27±1.44# NC: normal control; MO: model; PA: prednisone acetate; CA: catapol; BSYSF: Bushen Yisui formula; BSF: Bushen formula; HTHXF: Huatan Huoxue formula; **P<0.01, ***P<0.001 vs NC group;#P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs MO group.

表8 各組小鼠腦及脊髓中RhoA的表達(dá)變化

GroupNumber of caseBrainSpinal cordDay 25Day 40Day 25Day 40NC421.47±2.3225.07±1.5626.29±3.1720.31±1.97MO444.36±3.59***34.38±1.80***41.93±2.76**28.82±2.02**PA432.85±3.05#28.42±1.87#31.00±3.09#23.52±1.72#CA434.89±2.73#26.18±2.01#30.57±3.72#23.21±1.89#BSYSF425.27±3.68###25.12±1.47##26.53±2.15##20.32±1.76##BSF427.76±3.82##26.15±1.55#26.56±3.75##22.00±1.66#HTHXF435.03±3.13#27.86±1.74#30.56±1.80#22.83±1.53# NC: normal control; MO: model; PA: prednisone acetate; CA: catapol; BSYSF: Bushen Yisui formula; BSF: Bushen formula; HTHXF: Huatan Huoxue formula;**P<0.01, ***P<0.001 vs NC group;#P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs MO group.

表9 各組小鼠腦及脊髓中ROCKⅡ的表達(dá)變化

GroupNumber of caseBrainSpinal cordDay 25Day 40Day 25Day 40NC421.27±1.6822.07±1.6421.28±2.3921.61±1.20MO439.14±1.25**31.49±1.42*39.44±3.83*34.81±2.648*PA426.90±1.75###25.05±2.20#21.55±3.67##22.16±2.73##CA431.02±1.77##23.55±1.24#27.06±2.92#26.65±2.79#BSYSF427.76±1.56###23.09±2.70#22.78±2.02##24.52±2.63#BSF427.78±1.27###24.03±2.29#22.81±3.52##24.69±2.76#HTHXF434.22±1.59#25.19±1.76#28.94±3.63#27.06±2.32# NC: normal control; MO: model; PA: prednisone acetate; CA: catapol; BSYSF: Bushen Yisui formula; BSF: Bushen formula; HTHXF: Huatan Huoxue formula; *P<0.05, **P<0.01 vs NC group;#P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs MO group.

2.3 BSYSF及其拆方BSF和HTHXF對(duì)小鼠腦和脊髓中NogoA/NgR/RhoA/ROCKⅡ蛋白的調(diào)節(jié)作用

WB測(cè)定結(jié)果顯示，免疫第25天和第40天，MO組小鼠腦和脊髓NogoA和NgR表達(dá)較NC組明顯升高(P<0.01)，各治療組NogoA和NgR表達(dá)與MO組相比，均有明顯下調(diào)(P<0.05、P<0.01),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)圖9，10。

圖9 各組小鼠腦和脊髓中NogoA蛋白的表達(dá)變化

圖10 各組小鼠腦和脊髓中NgR蛋白的表達(dá)變化

圖11，12所示，免疫第25天和第40天，MO組小鼠腦和脊髓RhoA和ROCKⅡ蛋白表達(dá)較NC組明顯升高(P<0.05，P<0.01)，BSYSF降低RhoA明顯(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；BSF在第25天下調(diào)小鼠腦RhoA明顯(P<0.05)在第25天和40天下調(diào)小鼠脊髓RhoA明顯(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其他差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)各組藥物治療后，ROCKⅡ蛋白均有明顯降低(P<0.05，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖11 各組小鼠腦和脊髓中RhoA蛋白的表達(dá)變化

圖12 各組小鼠腦和脊髓中ROCKⅡ蛋白的表達(dá)變化

3 討論

前期研究[9-10]證實(shí)，補(bǔ)腎益髓方對(duì)EAE動(dòng)物具有明顯的防治作用。本方能夠明顯降低EAE小鼠發(fā)病率，減輕腦和脊髓炎性反應(yīng)，降低EAE小鼠的神經(jīng)評(píng)分，對(duì)神經(jīng)具有保護(hù)作用。為了進(jìn)一步研究補(bǔ)腎益髓方中補(bǔ)腎和化痰活血兩大治法的不同配伍作用，將其拆方為補(bǔ)腎方及化痰活血方進(jìn)行分析。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[20]顯示，補(bǔ)腎益髓方及拆方補(bǔ)腎和化痰活血含藥血清能升高低血清培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞生存率，促進(jìn)其軸突生長(zhǎng)，尤以補(bǔ)腎益髓方作用明顯。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果[11-12]顯示，補(bǔ)腎益髓方及其拆方補(bǔ)腎和化痰活血方能夠通過(guò)下調(diào)β-淀粉樣前體蛋白和硫酸軟骨素蛋白多糖，上調(diào)神經(jīng)絲蛋白200和微管相關(guān)蛋白-2以減輕軸突損傷和促進(jìn)軸突再生。但其作用機(jī)制有待深入探討。由于醋酸潑尼松是目前治療MS的一線藥物[5]，梓醇是本方中君藥生地黃中有代表性的活性成分,具有促進(jìn)神經(jīng)再生等作用[21-22]。因此，本實(shí)驗(yàn)以醋酸潑尼松和梓醇為陽(yáng)性對(duì)照，利用EAE小鼠模型，從調(diào)節(jié)軸突再生抑制因子信號(hào)通路方面深入探討補(bǔ)腎益髓方及其拆方的作用機(jī)制。

研究[23]顯示，NogoA/NgR及其軸突生長(zhǎng)抑制通路與MS/EAE密切相關(guān)，如MS患者脫髓鞘病變慢性活動(dòng)區(qū)可見(jiàn)NogoA和NgR表達(dá)的升高。用抗NogoA特異性抗體接種動(dòng)物可以有效阻斷NogoA表達(dá)，有利于保護(hù)并修復(fù)神經(jīng)元損傷[24]。NgR阻滯劑可以明顯減輕EAE模型動(dòng)物的軸突損傷程度[25]。MS/EAE病程中RhoA/ROCK信號(hào)通路的激活，啟動(dòng)了磷酸化/去磷酸化效應(yīng)，使細(xì)胞骨架出現(xiàn)重排，從而影響神經(jīng)突起的形成。大量研究[26]顯示，RhoA、ROCK在MS和EAE模型動(dòng)物腦和脊髓組織中RhoA和ROCK呈現(xiàn)高表達(dá)。在體和離體實(shí)驗(yàn)均顯示，用ROCK抑制劑能阻滯Rho/ROCK信號(hào)通路活化，可明顯改善EAE模型動(dòng)物神經(jīng)功能缺損癥狀，延緩病程，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞軸突再生[27]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EAE小鼠腦和脊髓抑制因子NogoA/NgR及其信號(hào)通路分子RhoA/ROCKⅡmRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高，推測(cè)其原因主要與軸突、髓鞘損傷后NogoA、NgR等抑制因子大量產(chǎn)生，進(jìn)而啟動(dòng)抑制信號(hào)通路有關(guān)。而經(jīng)補(bǔ)腎益髓方及其拆方補(bǔ)腎和化痰活血方處理后，急性期和緩解期EAE小鼠腦和脊髓中的上述因子具有不同程度的降低，說(shuō)明補(bǔ)腎益髓方及其拆方均可通過(guò)抑制NogoA/NgR/RhoA/ROCK起到促進(jìn)軸突再生的作用，且在趨勢(shì)上以補(bǔ)腎益髓方最為顯著，而補(bǔ)腎和化痰活血方在下調(diào)脊髓RhoA mRNA表達(dá)方面的作用不明顯；另外，補(bǔ)腎方在降低緩解期EAE小鼠腦脊髓RhoA蛋白(WB法)作用不明顯，同時(shí)，化痰活血方對(duì)急性期、緩解期EAE小鼠腦和脊髓的RhoA蛋白(WB法)均無(wú)顯著的調(diào)節(jié)作用，提示拆方單獨(dú)使用對(duì)上述因子起到部分調(diào)節(jié)作用，但二者配伍所成補(bǔ)腎益髓方全方集相輔相成之功，能夠顯著抑制上述因子表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)軸突再生的作用明顯。

上述結(jié)果表明降低神經(jīng)抑制因子NogoA/NgR及其相關(guān)信號(hào)通路RhoA/ROCK的表達(dá)，可能是補(bǔ)腎益髓方及其拆方治療MS的機(jī)制之一。以補(bǔ)腎益髓方顯著，補(bǔ)腎方次之，化痰活血方不及前兩方，提示補(bǔ)腎配伍化痰活血法可加強(qiáng)對(duì)信號(hào)通路分子的調(diào)節(jié)作用，從而明顯促進(jìn)軸突修復(fù)。