禽肉中利巴韋林殘留量的不確定度評(píng)定

孫麗香

(廈門泓益檢測有限公司，福建 廈門 361100)

利巴韋林是嘌呤核苷類似物，是廣譜類強(qiáng)效抗病毒藥物，對(duì)DNA病毒和RNA病毒均有抑制復(fù)制的作用[1]，臨床上主要用于病毒感染、單純皰疹、麻疹、腮腺炎、水痘、帶狀皰疹等疾病的治療。同時(shí)曾廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，用于預(yù)防和治療禽畜類的病毒性疾病[2]。但是利巴韋林具有一定的毒副作用，長期違規(guī)使用可使病毒產(chǎn)生耐藥，誘導(dǎo)耐藥病毒的出現(xiàn)，影響人類病毒疾病的防治。并且利巴韋林具有遺傳毒性、生殖毒性和致癌性等，可引起人體變態(tài)反應(yīng)和造血系統(tǒng)功能障礙[3]。美國食品藥物管理局(Food and Drug Administation，F(xiàn)DA)早于2005年就禁止將人類抗病毒藥物用于畜禽類[4]；而我國農(nóng)業(yè)部公告第560號(hào)中也明確規(guī)定抗病毒類藥物為禁用獸藥[5]。但是仍有部分獸藥企業(yè)違規(guī)生產(chǎn)，養(yǎng)殖業(yè)過量添加，從而導(dǎo)致利巴韋林藥物在動(dòng)源性食品中殘留，危害人類健康[6]。如2012年“速成雞”事件，養(yǎng)殖企業(yè)非法使用利巴韋林等違禁藥物帶來的食品安全問題，引起人們的普遍關(guān)注[7]。

目前國內(nèi)外，檢測利巴韋林的方法主要有免疫放射法[8]，氣相色譜-質(zhì)譜法[9]、液相色譜法[10-14]、液相色譜-質(zhì)譜法[15-20]等。關(guān)于發(fā)布的利巴韋林殘留量的測定方法只有兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：SN/T 4519-2016 和DB32/T 1165-2007。本文分析了用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法測定禽肉中利巴韋林測量結(jié)果的不確定度來源，對(duì)其進(jìn)行分析和評(píng)定，從而給出利巴韋林測量結(jié)果的不確定度，以評(píng)估液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法測定利巴韋林方法的可靠性及測定結(jié)果的可信度。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

甲醇(色譜純)，美國天地；乙腈(色譜純)，美國天地；乙酸銨(優(yōu)級(jí)純)，上海安譜；甲酸(優(yōu)級(jí)純)，上海安譜；三氯乙酸(分析純)，國藥集團(tuán)；氨水(分析純)，國藥集團(tuán)；PBA苯硼酸固相萃取小柱(100 mg/3 mL)，上海安譜；酸性磷酸酯酶，上海安譜；利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品(純度97.5%)，上海安譜；利巴韋林-13C5標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)，TRC；實(shí)驗(yàn)室超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源)，賽默飛世爾科技公司；渦旋混勻器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；高速冷凍離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司；pH計(jì)，賽多利斯；固相萃取裝置、上海安譜氮吹儀，上海安譜；MS204S 電子天平，梅特勒托利多； XS105 電子天平，梅特勒托利多。

1.3 方 法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1.1 標(biāo)曲的配制

準(zhǔn)確稱量利巴韋林和利巴韋林-13C5標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.01 mg)配制成濃度分別為1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL的工作液，內(nèi)標(biāo)利巴韋林-13C5濃度為10.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.1.2 樣品的制備

稱取雞肉樣品5 g(精確至0.01 g)于50 mL具塞離心管中，加入1 μg/mL利巴韋林-13C5內(nèi)標(biāo)工作液50 μL，再加入12 mL三氯乙酸溶液和2.5 mL乙腈，超聲10 min，離心后提取上清液。再加入10 mL三氯乙酸溶液重復(fù)提取一次，離心后合并上清液定容至25 mL。準(zhǔn)確移取5 mL上清液，加入1.0 mL乙酸銨溶液和100 μL酸性磷酸脂酶于37 ℃恒溫干燥箱中酶解2 h。取出后冷卻至室溫，用氨水調(diào)pH值至8.5±0.1，混勻離心，取上清液經(jīng)PBA固相萃取柱中凈化，在45 ℃氮?dú)獯蹈桑詈笥? mL乙腈-水溶液(體積比90:10)溶解殘?jiān)?，過0.22 μm濾膜，供液質(zhì)聯(lián)用儀測定。

1.3.1.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq柱(3.0×100 mm，1.8 μm)或相當(dāng)者；

流動(dòng)相：A：0.2%甲酸水溶液(3.18)；B：乙腈(3.1)，洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序Table 1 Liquid chromatography gradient elution procedure

流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

ESI正離子模式；多反應(yīng)檢測(SRM)；毛細(xì)管電壓：3800 kV；離子傳輸管溫度：300 ℃。

表2 利巴韋林保留時(shí)間、定性定量離子對(duì)及碰撞能量Table 2 Retention time, qualitative and quantitative ion pairs and collision energy of the Ribavirin

2 數(shù)學(xué)模型建立

樣品中利巴韋林含量計(jì)算公式如下：

式中：X——樣品中利巴韋林含量，μg/kg

A——樣品中利巴韋林的峰面積

c——標(biāo)準(zhǔn)溶液中利巴韋林的濃度，ng/mL

ci——樣品中內(nèi)標(biāo)物利巴韋林-13C5的濃度，ng/mL

Asi——標(biāo)準(zhǔn)溶液中利巴韋林-13C5的峰面積

csi——標(biāo)準(zhǔn)溶液中內(nèi)標(biāo)物利巴韋林-13C5的濃度，ng/mL

Ai———樣品中內(nèi)標(biāo)物利巴韋林-13C5的峰面積

As———標(biāo)準(zhǔn)溶液中利巴韋林的峰面積

V———樣品的最終定容體積，mL

m———最終樣品測定液中代表的試樣質(zhì)量，g

df———稀釋倍數(shù)

采用內(nèi)標(biāo)法實(shí)驗(yàn)，可將上述公式簡化為:

3 分析不確定度來源

通過測試方法及數(shù)學(xué)模型，其不確定度的主要來源有：配制標(biāo)準(zhǔn)曲線過程產(chǎn)生的不確定度μrel(C)，樣品稱量產(chǎn)生的不確定度μrel(m)，校準(zhǔn)曲線擬合過程產(chǎn)生的不確定度μrel(X0)，前處理過程中定容體積產(chǎn)生的不確定度μrel(V)，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀定量校準(zhǔn)引入的不確定度μrel(Y)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)性產(chǎn)生的不確定度μrel(frep)。各參數(shù)間影響相互獨(dú)立，因此其相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel(X)為：

4 不確定度各分量的計(jì)算

4.1 試樣測試過程中由重復(fù)性引入的不確定度

在雞肉樣品中加標(biāo)，按同一前處理?xiàng)l件重復(fù)測定6次，測定結(jié)果見表3。

表3 樣品中利巴韋林測定結(jié)果Table 3 Results of determination of ribavirin in samples

因此，由測量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.2 試樣稱量時(shí)產(chǎn)生的不確定度

準(zhǔn)確稱量雞肉樣品5.00 g(精確至0.01 g)，按均勻分布考慮，則稱量試樣產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.3 前處理過程中定容體積引入的不確定度

4.4 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀定量校準(zhǔn)引入的不確定度

根據(jù)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀的校準(zhǔn)報(bào)告給出的擴(kuò)展不確定度μrel=7%，K=2，因此，其產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

μrel(Y)=0.07/2=0.035

4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程產(chǎn)生的不確定度

4.5.1 配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

(1)利巴韋林和利巴韋林-13C5標(biāo)準(zhǔn)品證書給出純度分別為99.9%和98.9%，由標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度為：

(2)稱取標(biāo)準(zhǔn)品利巴韋林和利巴韋林-13C5均是10.00 mg，天平允許的最大誤差為±0.01 mg，取矩形分布，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(4)合成的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

=0.00649

4.5.2 配制標(biāo)準(zhǔn)中間稀釋液所產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

=0.00476

4.5.3 由標(biāo)準(zhǔn)中間液稀釋配制標(biāo)準(zhǔn)工作液所產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

配制標(biāo)準(zhǔn)工作液的過程中主要是由移液器和玻璃量器帶入的不確定度，假設(shè)移液槍和容量瓶分別符合均勻分布和三角分布，則10、20、50、100、200 μL移液槍和10 mL A級(jí)容量瓶所產(chǎn)生的不確定度如表4所示。

表4 標(biāo)準(zhǔn)工作液所產(chǎn)生的不確定度Table 4 The uncertainty of the produces standard working solution preparation

由于配制利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)溶液使用 10 mL容量瓶在配制過程中使用了5次，10、20、50、100、200 μL移液槍在各使用了1次，并且配制利巴韋林-13C5溶液使用100 μL移液槍使用了5次，因此配制工作液產(chǎn)生的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

=0.0620

利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程所產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.6 利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過程產(chǎn)生的不確定度

本實(shí)驗(yàn)中，分別配制了利巴韋林1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中內(nèi)標(biāo)物利巴韋林-13C5濃度均為10 ng/mL，用最小二乘法擬合，可得標(biāo)曲的曲線方程為Y=aC+b，見表5。

表5 利巴韋林的測定結(jié)果及擬合方程Table 5 Ribavirin determination results and fitting equations

其中，a=0.1025，b=0.0026，R2=0.999。

并且對(duì)于同一試樣，平行測定6次，其試樣的平均濃度為4.997 μg/mL(轉(zhuǎn)化為5.00 μg/kg)，則校準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel(C0)可由以下公式計(jì)算得到：

式中：a——擬合曲線斜率

p——樣液測定的次數(shù)

m——利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度測定的次數(shù)

n——利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度點(diǎn)數(shù)

SY——擬合曲線標(biāo)準(zhǔn)偏差

Sc——擬合曲線各濃度的離均差平方和

Yij——各濃度點(diǎn)的響應(yīng)值

Yi——由擬合曲線計(jì)算所得的響應(yīng)值

Ci——標(biāo)準(zhǔn)曲線中利巴韋林各點(diǎn)濃度值

C0——樣液中利巴韋林的平均濃度

由以上公式計(jì)算的結(jié)果見表6。

表6 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel(C0)Table 6 The unicertaintyμrel(C0) of least square curve fitting

5 樣品合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度、擴(kuò)展不確定度

樣品中利巴韋林的經(jīng)各個(gè)不確定分度合成，即可得到其相對(duì)不確定：

=0.0749

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：μ(X)=μrel(X)×X=0.0749×4.997 μg/kg=0.374 μg/kg，取包含因子k=2，置信概率95%，則擴(kuò)展不確定度為：U(X)=2×0.374 μg/kg=0.748 μg/kg。

6 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉樣品中的利巴韋林，得出當(dāng)k=2(置信度是95%)時(shí)，利巴韋林的不確定度可表示為(5.00±0.748)μg/kg，k=2。根據(jù)各個(gè)不確定的數(shù)值大小，可知此方法的主要不確定來源于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及校準(zhǔn)曲線的擬合。因此，在做該項(xiàng)目的測試工作中，可以從以下幾個(gè)方面降低其不確定度：(1)儀器需定期維護(hù)保養(yǎng)及校準(zhǔn)；(2)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制過程，操作要規(guī)范，或者盡可能采用精度更高的分度吸量管來配制溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線；(3)提高樣品的均勻性及增加樣品的測定次數(shù)。