LED可見光與有機酸的協(xié)同抗菌性能

俞建峰 ， 夏曉露 ， 陳 健 ， 張楚唯 ， 榮家偉

（1.江南大學(xué) 機械工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江蘇省食品先進制造裝備技術(shù)重點實驗室，江蘇 無錫214122）

在食品工業(yè)生中，生鮮水果、蔬菜、魚類和肉類的保存十分重要。一方面是因為這些食物是人們?nèi)粘ｏ嬍车闹匾M成部分，其需求量巨大；另一方面是其含有大量的營養(yǎng)元素和水分，因而容易受到微生物的污染[1-2]。在目前市場上的生鮮食品最常用的保存方式是冷藏或者冷凍，該方式能夠降低微生物的細(xì)胞活性、抑制其生長速率，但并不能夠達(dá)到殺死微生物[3]。此外，一些嗜冷菌在冷藏或冷凍的低溫下仍然可以生長，最終導(dǎo)致食品被污染，嚴(yán)重威脅公眾安全[4]。因此，應(yīng)采用新型抗菌技術(shù)與冷藏相結(jié)合，有效控制生鮮食品上的食源性微生物，同時保證其營養(yǎng)和品質(zhì)不被破壞。

可見光發(fā)光二極管（LED）技術(shù)由于其具備良好的抗菌作用，在食品加工行業(yè)備受關(guān)注，且有望成為新型食品保鮮技術(shù)。Srimagal[5]等研究了藍(lán)色發(fā)光二極管（LED）光照處理對于牛奶中大腸桿菌的滅活影響，結(jié)果表明經(jīng)LED藍(lán)光照射處理后的牛奶，與未接受藍(lán)光照射的牛奶相比，其物理性質(zhì)沒有顯著變化，但保質(zhì)期延長了兩倍。Karen[6]等研究了在高鹽度環(huán)境和強酸環(huán)境下，405 nm發(fā)光二極管（LED）對于大腸桿菌和單核細(xì)胞李斯特菌的滅活影響，結(jié)果表明高質(zhì)量分?jǐn)?shù)鹽環(huán)境（15%NaCl）能夠顯著增強大腸桿菌和單核細(xì)胞李斯特菌對于405 nm LED的敏感性。在強酸環(huán)境（pH 3）下，使所有大腸桿菌和單核細(xì)胞李斯特菌完全滅活所需的光照劑量僅為對照組（pH 7）的50%。Vinayak[7]等研究了在不同的輻照強度和溫度下，460 nm發(fā)光二極管（LED）對于鮮切菠蘿片表面沙門氏菌的滅活影響，結(jié)果表明溫度對于沙門氏菌的光照滅活影響顯著，而輻照強度的變化對其影響不大。但不同波長的LED可見光與不同質(zhì)量濃度有機酸相結(jié)合，對于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的滅活影響尚未見報道。作者研究了3種波長的LED光源（紅光、綠光、藍(lán)光）在不同溫度下對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的滅活影響；檸檬酸、乳酸、蘋果酸3種有機酸在不同溫度下對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的滅活影響以及藍(lán)光與有機酸相結(jié)合，在不同溫度下對于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的滅活影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌（Escherichia coli）菌株和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌株：江南大學(xué)生物工程學(xué)院微生物實驗室提供；檸檬酸、乳酸：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；蘋果酸：生物試劑，國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉浸出粉3 g，氯化鈉5 g，pH 7.2，溶于1 000 mL去離子水中，121℃高壓蒸汽滅菌15 min，備用；平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：葡萄糖1 g，瓊脂15 g，胰蛋白胨5 g，酵母浸出粉2.5 g，pH 7.2，溶于1 000 mL去離子水中，121℃高壓蒸汽滅菌15 min，備用；精密電子分析天平：AR1140型，奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司產(chǎn)品；恒溫鼓風(fēng)烘干干燥箱：DHG-9076A型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺：SJCJ-2FD型，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；手提式壓力蒸汽滅菌鍋：XFS-280型，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；恒溫生化培養(yǎng)箱：SPX-200型，上海躍進醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；紅光LED燈：TDR-9型，深圳市我的照明燈飾有限公司產(chǎn)品；綠光LED燈：TDG-9型，深圳市我的照明燈飾有限公司產(chǎn)品；藍(lán)光LED燈：TDB-9型，深圳市我的照明燈飾有限公司產(chǎn)品；光生物輻射安全評價系統(tǒng)：WT210型，杭州浙大三色儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化及菌液制備 在超凈工作臺中，將實驗室保藏的菌種采用平板劃線法接種到瓊脂培養(yǎng)基上，37℃靜置培養(yǎng)24～48 h，取生命力旺盛的單菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，大腸桿菌37℃振蕩培養(yǎng)8～12 h，枯草芽孢桿菌37℃振蕩培養(yǎng)12～24 h。將活化后的菌液用無菌去離子水稀釋，使懸菌液的濃度達(dá)到107CFU/mL，備用[8-9]。

圖1 LED光源相對光譜功率密度分布圖Fig.1 Distribution of relative spectral power density of LED light sources

圖2 LED光照系統(tǒng)截面示意圖Fig.2 Cross sectional diagram of the LED illumination system

1.2.2 LED光源與光照系統(tǒng) 紅光（630 nm）、綠光（525 nm）、藍(lán)光（455 nm）3種波長的LED光源，功率均為9 W，光照直徑90 mm，經(jīng)光生物輻射安全評價系統(tǒng)測得光源的相對光譜功率密度分布圖見圖1。LED光源固定于燈架上，置于恒溫生化培養(yǎng)箱中，由恒溫生化培養(yǎng)箱中的內(nèi)接電源供電，含有懸菌液的培養(yǎng)皿 （D=60 mm）放置在光源的下方55 mm距離處，光照系統(tǒng)的截面示意圖見圖2。

1.2.3 不同波長的LED可見光抗菌試驗 在超凈工作臺上，取預(yù)先制備濃度為107CFU/mL的懸菌液1mL，于9 mL的營養(yǎng)肉湯中，將這10 mL懸菌液盛放在無菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿位于LED光源正下方55 mm處。整個組件放在恒溫生化培養(yǎng)箱內(nèi)，以確保能夠調(diào)節(jié)試驗溫度 （12、25℃），12℃是模擬超市貨架低溫環(huán)境，25℃是模擬室溫環(huán)境。在試驗過程中，采用黑紙板覆蓋培養(yǎng)箱的玻璃窗口，以最大化減少試驗誤差。實驗組采用不同波長的LED光源（紅光、綠光、藍(lán)光），對照組去除LED光源，其他試驗環(huán)境與實驗組相同。在試驗過程中，每間隔1小時取樣一次。

1.2.4 不同有機酸的抗菌試驗 根據(jù)GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中的相關(guān)規(guī)定，本試驗中乳酸、檸檬酸、蘋果酸的最大添加量為1 g/kg。實驗組取預(yù)先制備的濃度為107CFU/mL的懸菌液1 mL，于9 mL的營養(yǎng)肉湯中，將這10 mL懸菌液盛放在無菌培養(yǎng)皿中，再分別添加乳酸、檸檬酸、蘋果酸使其最終質(zhì)量濃度均為1 g/kg，對照組加入等量的無菌去離子水。培養(yǎng)皿置于無光源的試驗環(huán)境，分別在環(huán)境溫度為12℃和25℃的條件下，靜置8 h，每間隔1小時取樣一次。

1.2.5 LED藍(lán)光與有機酸的協(xié)同抗菌試驗 選擇LED藍(lán)光與3種有機酸進行協(xié)同抗菌試驗。取預(yù)先制備的濃度為107CFU/mL的懸菌液1 mL，于9 mL的營養(yǎng)肉湯中，將這10 mL懸菌液盛放在無菌培養(yǎng)皿中，再分別添加檸檬酸、乳酸、蘋果酸使其最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1 g/kg，對照組加入等量的無菌去離子水。培養(yǎng)皿置于藍(lán)光光源正下方55 mm處，分別在環(huán)境溫度為12℃和25℃下光照處理8 h，每間隔1小時取樣1次。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 每個取樣點的活菌數(shù)量由平板計數(shù)法檢測得到3次獨立實驗的實驗數(shù)據(jù)，計算平均值。采用SAS 8.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，計算平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差及顯著性分析。以試驗時間為橫坐標(biāo)，以lg（CFU/mL）為縱坐標(biāo)繪制時間—菌落總數(shù)曲線[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同波長的LED可見光抗菌結(jié)果

由圖3可知，在12℃的條件下，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌在對照組中，活菌數(shù)始終在初始值附近上下波動，變化不大，同時在接受LED光照處理后的變化趨勢也基本一致。對于大腸桿菌，在使用LED紅光、綠光、藍(lán)光照射8 h后，與對照組相比，活菌數(shù)分別降低了（0.08±0.03）lg（CFU/mL）、（0.35±0.06）lg（CFU/mL）、（0.94±0.04）lg（CFU/mL）。 對于枯草芽孢桿菌，在使用LED紅光、綠光、藍(lán)光照射8 h后，與對照組相比， 菌落數(shù)分別降低了 （0.02±0.01）lg（CFU/mL）、（0.25±0.05）lg（CFU/mL）、（0.46±0.05）lg（CFU/mL）。

由圖4可觀察到，在25℃試驗環(huán)境下，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的生長活性較旺盛，在對照組中試驗8 h后，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的數(shù)量分別達(dá)到（8.15±0.11）lg （CFU/mL）、（7.06±0.04）lg（CFU/mL）。就大腸桿菌而言，在接受LED紅光、綠光、藍(lán)光照射8 h后，與對照組相比，活菌數(shù)分別降低了（0.29±0.06）lg（CFU/mL）、（1.14±0.06）lg（CFU/mL）、（1.81±0.07）lg（CFU/mL）。就枯草芽孢桿菌而言，在使用LED紅光、綠光、藍(lán)光光照處理8 h后，與對照組相比，菌落數(shù)分別降低了（0.09±0.03）lg（CFU/mL）、（0.31±0.05）lg（CFU/mL）、（0.72±0.04）lg（CFU/mL）。

圖3 12℃下不同波長LED可見光的抗菌效果Fig.3 Effects of visible light wavelength on antimicrobial activity at 12℃

圖4 25℃下不同波長LED可見光的抗菌效果Fig.4 Effects of visible light wavelength on antimicrobial activity at 25℃

細(xì)菌細(xì)胞光動力滅活的機理是：細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的光敏性物質(zhì)，在接受特定光譜照射之后，即可產(chǎn)生活性氧（ROS）。這些活性氧能夠引起細(xì)胞壁天然結(jié)構(gòu)的快速破壞，同時能夠與細(xì)胞中的重要成分如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA發(fā)生反應(yīng)，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11-12]。結(jié)合圖3-4可得出：一方面是無論在何種溫度環(huán)境下，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌對藍(lán)光的敏感性最強，綠光次之，紅光最弱。這可能的原因是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)源性光敏物質(zhì)主要吸收的是400～500 nm之間的可見光光譜，尤其是400～420 nm之間的區(qū)域更為顯著[13]。而本研究中藍(lán)光的波長值為455 nm，最符合吸收條件，故細(xì)菌細(xì)胞對藍(lán)光最為敏感。另一方面是在兩種試驗溫度下，大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）對于LED光照處理的敏感性均大于枯草芽孢桿菌（革蘭氏陽性菌），這可能是由于革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁較厚，由肽聚糖和磷壁酸形成脂多糖層，形成一個天然的保護屏障，可阻止細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)等物質(zhì)的損失，因此細(xì)胞的光滅活反應(yīng)也得到了削弱[14-15]。蘇冰梅、王婷[16]等使用喹諾酮類與磺胺類藥物對枯草芽孢桿菌與大腸桿菌的聯(lián)合毒性研究中也得到相似的結(jié)果。

2.2 不同有機酸的抗菌結(jié)果

從圖5可以發(fā)現(xiàn)，12℃下3種有機酸對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均有抗菌效果。由圖5（a）可知，乳酸在12℃下對大腸桿菌的抗菌效果最強，在試驗8 h后，與對照組相比，活菌數(shù)降低了 （0.58±0.05）lg（CFU/mL）。而檸檬酸和蘋果酸的抗菌效果較弱，與對照組相比，活菌數(shù)分別降低了（0.24±0.02）lg（CFU/mL）、（0.17±0.03）lg（CFU/mL）。由圖5（b）可知，在12℃下試驗8 h后，乳酸、檸檬酸、蘋果酸的實驗組與對照組相比，枯草芽孢桿菌的減少量分別為 （0.27±0.02）lg（CFU/mL）、（0.10±0.02）lg（CFU/mL）、（0.03±0.01）lg（CFU/mL）。

圖5 12℃下不同有機酸的抗菌效果Fig.5 Effect of different organic acids on antibacterial activity at 12℃

由圖6可知，25℃下大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的生長速率較快。而3種有機酸對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌分別有不同效果的抑制作用。與空白對照組相比，檸檬酸、乳酸、蘋果酸使大腸桿菌的活菌數(shù)分別減少了（1.80±0.06）lg（CFU/mL）、（2.01±0.04）lg（CFU/mL）、（1.32±0.05）lg（CFU/mL），而使枯草芽孢桿菌減少的活菌數(shù)分別為（0.28±0.04）lg（CFU/mL）、（0.51±0.05）lg（CFU/mL）、（0.16±0.03）lg（CFU/mL）。

綜合圖5-6的試驗結(jié)果得到，在兩種試驗溫度下，3種有機酸對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均有明顯的抗菌效果。有機酸可解離成氫離子和酸根離子，隨著氫離子的積累會使pH降低，而大腸桿菌和枯草芽孢桿菌適宜生存在中性環(huán)境下，故其正常的代謝活動遭到破壞，因此有機酸可產(chǎn)生抗菌效果[17]。但有機酸的抗菌機理并不僅僅與氫離子的濃度有關(guān)，在本試驗的3種有機酸中，乳酸的酸性較弱，但其抗菌效果最好。這可能是乳酸對于細(xì)胞膜的親脂性最強，而蘋果酸最弱。未解離的乳酸分子與細(xì)胞膜結(jié)合，引起細(xì)胞膜中的脂多糖的釋放，損害了細(xì)胞膜的完整性，最終達(dá)到更好的抗菌效果[18-19]。

圖6 25℃下不同有機酸的抗菌效果Fig.6 Effect of different organic acids on antibacterial activity at 25℃

2.3 不同有機酸與LED藍(lán)光的共同抗菌結(jié)果

從圖7可知，在12℃下3種有機酸均可顯著提升LED藍(lán)光對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抗菌效果。與對照組相比，在LED藍(lán)光與檸檬酸、乳酸、蘋果酸協(xié)同抗菌的實驗組中，大腸桿菌的活菌數(shù)分別減少了（3.30±0.11）lg（CFU/mL）、（4.17±0.04）lg（CFU/mL）、（0.75±0.10）lg（CFU/mL），而枯草芽孢桿菌減少的活菌數(shù)分別為（2.67±0.08）lg（CFU/mL）、（3.88±0.17）lg（CFU/mL）、（1.30±0.07）lg（CFU/mL）。

圖7 12℃下不同有機酸與LED藍(lán)光的協(xié)同抗菌效果Fig.7 Synergistic antimicrobial activities of LED blue light and different organic acids at 12℃

從圖8可知，在25℃下3種有機酸均可輔助LED藍(lán)光滅活大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。就大腸桿菌而言，再添加檸檬酸、乳酸、蘋果酸的實驗組中，藍(lán)光照射8 h后，與對照組相比，活菌數(shù)分別降低了（3.57±0.11）lg （CFU/mL）、（4.99±0.07）lg（CFU/mL）、（1.28±0.08）lg（CFU/mL）。 就枯草芽孢桿菌而言，在添加檸檬酸、乳酸和蘋果酸的試驗組中，與對照組相比，藍(lán)光照射8 h后菌落數(shù)分別降低了（1.73±0.06）lg（CFU/mL）、（3.12±0.09）lg（CFU/mL）、（0.63±0.05）lg（CFU/mL）。

綜合圖7-8可知，3種有機酸均可顯著增強藍(lán)光對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抗菌效果，但乳酸對細(xì)菌細(xì)胞光滅活的輔助最強，檸檬酸稍弱，蘋果酸最差。有機酸與LED藍(lán)光相結(jié)合可增強抗菌效果的原因如下：一方面有機酸分子能夠擾亂細(xì)菌細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，阻止DNA和RNA合成，改變細(xì)胞膜的通透性，削弱細(xì)胞的代謝活動[20]；另一方面是未解離的有機酸分子作用于細(xì)胞外膜導(dǎo)致磷脂和脂蛋白大量釋放，同時這些物質(zhì)是細(xì)菌細(xì)胞在光照滅活期間作用的主要目標(biāo)[21]。因此，有機酸可顯著提高LED可見光對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抗菌效果。

圖8 25℃下不同有機酸與LED藍(lán)光的協(xié)同抗菌效果Fig.8 Synergistic antimicrobial activities of LED blue light and different organic acids at 25℃

3 結(jié) 語

作者研究了LED可見光與3種常用有機酸的協(xié)同抗菌效果，在3種可見光中，藍(lán)光對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌抗菌效果最優(yōu)；而在3種有機酸中，乳酸的抗菌效果最為理想。 在LED藍(lán)光與3種有機酸協(xié)同抗菌試驗中，乳酸對細(xì)菌光滅活的輔助最大，檸檬酸次之，蘋果酸最小。大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，對于LED可見光與有機酸的協(xié)同抗菌趨勢基本一致，但大腸桿菌對光滅活更加敏感。作者探究了LED可見光波長與有機酸的種類對培養(yǎng)基懸浮狀態(tài)下大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抗菌效果，接下來將考察LED可見光與有機酸對于真實食物基質(zhì)（蔬菜、水果、牛奶等）上食源性微生物的抗菌效果，以期為食品工業(yè)中的食品保鮮和貯藏，提供新的思路與方法。