外源酶制劑在傳統(tǒng)臘肉現(xiàn)代化工藝改造中的應用

孔曉雪， 樓宵瑋， 李新福， 韓衍青， 徐寶才*，4

（1．南京師范大學 食品與制藥工程學院，江蘇 南京 210097；2．江蘇雨潤肉類產(chǎn)業(yè)集團有限公司 肉品加工與質量控制國家重點實驗室，江蘇 南京 211806；3．江蘇省生產(chǎn)力促進中心，江蘇 南京 210042；4．合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院，安徽 合肥230009）

臘肉是中國的一種傳統(tǒng)腌臘肉制品，作為一類原料肉腌制后經(jīng)烘烤或日曬風干后的生肉制品，它集發(fā)酵煙熏產(chǎn)品特點于一身，制作工藝簡單，色鮮味醇，食用方便，儲藏長久，長期流行于我國中西部一帶特別是南方地區(qū)[1]。由于臘肉腌制及成熟過程有微生物和內源酶的復合作用，降解其蛋白質和脂肪等大分子營養(yǎng)物質生成多肽、氨基酸、脂肪酸等[2]，形成的獨特腌臘風味，廣受消費者喜愛。隨著中國肉制品加工業(yè)的快速發(fā)展，臘肉制品逐漸突破地域限制，被各地消費者所接受，成為家常宴會上不可或缺的食材。

傳統(tǒng)臘肉多為作坊生產(chǎn)，加工工藝落后，加工設備簡陋，衛(wèi)生條件約束力弱，并且受到季節(jié)與地區(qū)的制約，生產(chǎn)周期長且微生物污染嚴重[3]，在制作過程中要依靠添加高濃度的食鹽（一般添加量高達10%左右）來保障長周期的成熟環(huán)節(jié)和食用的安全性。為改進臘肉加工工藝，縮短生產(chǎn)周期，進一步實現(xiàn)標準化管理，傳統(tǒng)臘肉現(xiàn)代化工藝改造成為現(xiàn)代工廠加工方式轉型升級的重要內容。通過添加外源酶制劑替代臘肉自然成熟[4-5]，并采用高溫烘干脫水工藝替代自然風干[6]，現(xiàn)代化工藝改造的臘肉加工周期可大大縮短，其食鹽添加量也能夠降低到正常肉制品水平（2%左右），現(xiàn)代化工藝大大提高了工廠加工效率，并有效保障產(chǎn)品食用品質和安全性。為解決臘肉生產(chǎn)過程中的實際問題，研究人員一般從加工設備的改進、微生物和酶調控、腌制工藝改良、紫外輻射殺菌等多方面促進和改善臘肉制品加工，提高產(chǎn)品風味[7-8]，縮短生產(chǎn)周期[9]。然而外源酶添加和高溫脫水工藝引發(fā)的臘肉風味不穩(wěn)定、脂肪和蛋白質加速氧化問題[7]一直是制約傳統(tǒng)臘肉現(xiàn)代化工藝改造的瓶頸問題。

臘肉制品的風味形成與脂肪和蛋白質的分解有著密不可分的關系。蛋白質的分解產(chǎn)物小肽和游離氨基酸是臘肉重要的風味前體物質[10]。脂肪的分解產(chǎn)物游離脂肪酸等不僅是形成風味的前體物質，還是區(qū)分不同種類肉制品的重要風味成分[2，5]，此外，脂肪酸發(fā)生氧化產(chǎn)生的醛酮酸等揮發(fā)性羰基化合物對臘肉風味形成也有重要作用[5]。與腌臘肉制品風味形成有關的酶類包括內源酶和外源酶。其中以組織蛋白酶和脂蛋白酯酶為主的內源酶對肉制品的成熟和風味形成有著至關重要的作用，國內外學者也對其進行了大量研究[1，8-10]。國內閆文杰等學者[9]將提取自肌肉中的組織蛋白酶B和脂肪酶添加到快速成熟臘肉中，對產(chǎn)品風味變化情況進行了深入研究。但內源酶由于從細胞內部提取，酶系成分復雜，作用效果緩慢，實驗過程中影響因素較多[1，9]，近年來工業(yè)化領域逐漸從外源酶研究入手，探究外源酶的添加對腌臘制品快速腌制過程以及終產(chǎn)品風味形成的影響。朱建軍等[11]將木瓜蛋白酶和中性蛋白酶應用于臘肉中，發(fā)現(xiàn)外源酶有效提高了蛋白質的分解速度，增加風味物質的含量，F(xiàn)ernandez[12]等將胰脂酶添加到發(fā)酵香腸中，可以短時間內提升產(chǎn)品風味。

通過添加適量的中性蛋白酶和脂肪酶，對臘肉快速成熟工藝進行研究，采用均勻設計方法對腌制工藝進行優(yōu)化，對比分析了傳統(tǒng)加工工藝與外源酶制劑添加工藝對產(chǎn)品品質及風味的影響，以實現(xiàn)快速腌制加工，縮短產(chǎn)品生產(chǎn)周期，為臘肉產(chǎn)品標準化和規(guī)范化生產(chǎn)提供參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬五花肉 （單因素實驗取自同一頭豬胴體，均勻實驗取自同一批次屠宰豬胴體）：南京雨潤食品有限公司；中性蛋白酶（2×105U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；脂肪酶（4×105U/g）：深圳市綠微康生物工程有限公司；煙熏液：美國紅箭國際公司；三氯乙酸：上海凌峰化學試劑有限公司；硫代巴比妥酸（TBA）：國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

ESK125型真空滾揉機：德國VAKONA CmbH公司產(chǎn)品；DC800-FB-E型真空包裝機：希悅爾（中國）有限公司產(chǎn)品；V-5000可見分光光度計：上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；L8900全自動氨基酸分析儀：日本日立公司產(chǎn)品；Fox4000型電子鼻：法國AlphaMOS公司產(chǎn)品；JA2103N型精密天平：上海民橋精密科學儀器有限公司產(chǎn)品；電熱烤箱：德國CONVOTHERM公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 均勻設計 采用4因素6水平均勻設計試驗對中性蛋白酶和脂肪酶添加量、滾揉和腌制時間等快速成熟工藝指標進行優(yōu)化，因素水平設計見表1。

表1 臘肉現(xiàn)代化生產(chǎn)工藝均勻設計因素水平表Table 1 Factors and levels of uniform design for the production of Chinese bacon using exogenous enzymes

1.3.2 臘肉加工工藝 在工廠傳統(tǒng)加工工藝基礎上作相關調整，將外源酶制劑按照設定比例混合后制成水溶液，在滾揉工藝操作時與腌制料同步添加，具體制作工藝如下：

原料五花肉→切條修整稱重→添加外源酶和腌制料→滾揉→靜腌→干燥→煙熏烘烤→冷卻→整形稱重→包裝→成品

1.3.3 取樣 臘肉成品包裝后，于-4℃冷庫冷藏，選取臘肉中部肥瘦均勻處采樣，進行相關理化指標分析。其中蛋白質水解指標測定均選取臘肉中瘦肉部位采樣，脂肪氧化和風味指標測定選取臘肉肥瘦均勻部位采樣，平行試驗具體操作時每塊臘肉取樣部位保持一致，以盡可能減少取樣環(huán)節(jié)對實驗結果造成的誤差。

1.3.4 總氮和非蛋白氮測定 總氮測定（total nitrogen，TN）：參照GB 5009.5—2010《食品安全國家標準：食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法進行；非蛋白氮的測定（non-protein nitrogen，NPN）：參照趙改名等[13]方法進行。

1.3.5 游離氨基酸測定 游離氨基酸總量測定參考Maja等人方法[14]進行；游離氨基酸組成測定參照朱建軍等方法[11]并作適當修改進行。具體操作如下：稱取樣品1.00 g，加入10 mL 5%的三氯乙酸，振蕩混勻，超聲30 min，取出后雙層濾紙過濾，10 000 r/min離心25 min，取一定體積的上清液調至pH 2左右，用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液上機用自動氨基酸分析儀測定。其中色譜條件為離子交換柱：2.6 mm×150 mm；可見光檢測器：波長570 nm和440 nm；流動相：檸檬酸和檸檬酸鈉緩沖液；流速：0.225 mL/min；進樣量：50 μL。

1.3.6 脂肪氧化指標的測定 樣品酸價、過氧化值和丙二醛質量分數(shù)的測定分別按照GB5009.229-2016食品中酸價的測定冷溶劑滴定法、GB5009.227-2016食品中過氧化值的測定滴定法以及GB5009.181-2016食品中丙二醛的測定分光光度法進行。

1.3.7 電子鼻分析 參照劉強[15]等人的方法并略作修改，稱取傳統(tǒng)工藝臘肉和現(xiàn)代化工藝臘肉樣品各1.0 g，分別置于10 mL頂空瓶中，每組各取3個樣品。電子鼻頂空測定參數(shù)：溫度45℃，加熱時間240 s。頂空注射參數(shù)：自動進樣，注射體積1 500 μL，注射速度500 μL/s，注射針溫度65℃。獲取參數(shù)：獲取時間120 s，延滯時間300 s。Fox4000型電子鼻的各傳感器名稱及其性能特點見表2。

1.3.8 感官評定 由實驗室10人組成的感官評定小組進行。以色澤（表面、內部以及整體）、口感（硬度、彈性）、滋味（咸度、甜度等）和氣味（煙熏味及臘香味）作為感官評定的指標。得分按照1～10分共3個等級，評價標準參照表3執(zhí)行。

1.3.9 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SAS8.12進行ANOVA單因素方差分析及Ducan’s多重檢驗 （p＜0.05），數(shù)據(jù)以均值±標準差表示。電子鼻數(shù)據(jù)分析運用Fox4000型電子鼻配套軟件Alpha soft進行數(shù)據(jù)處理。

表2 Fox4000電子鼻的各傳感器名稱及性能特點Table 2 Each sensor’s name and performance characteristics of Fox4000 electronic nose

表3 感官評價標準Table 3 Sensory evaluation standard

2 結果與討論

2.1 蛋白酶對臘肉蛋白質的水解作用

表4列出了不同蛋白酶添加量對臘肉制品蛋白質總量（TN）、非蛋白氮溶出（NPN）、游離氨基酸（FAA）質量分數(shù)等蛋白質降解指標的影響。隨蛋白酶添加量的增加，產(chǎn)品中非蛋白氮和游離氨基酸質量分數(shù)顯著升高，蛋白質水解程度增大。非蛋白氮包括除蛋白質以外的多肽、小肽及游離氨基酸，是臘肉重要的風味前體物質[11]，外源蛋白酶在50～300 mg/kg添加范圍內，產(chǎn)品非蛋白氮質量分數(shù)呈現(xiàn)四級階段差異，與蛋白質水解程度成對應關系。蛋白酶添加量越高，與臘肉風味相關的降解產(chǎn)物質量分數(shù)也越高，這一結果與穆建穩(wěn)等人[16]在臘牛肉中添加蛋白酶的研究相同。

2.2 脂肪酶對臘肉脂肪氧化的影響

表5為不同脂肪酶添加量對臘肉脂肪氧化的影響?？梢钥闯?，隨外源脂肪酶的添加量增加，臘肉酸價有顯著上升的趨勢。當脂肪酶添加量為600 mg/kg時，酸價達到最高1.52 mg/g。臘肉脂肪氧化程度隨脂肪酶添加量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當添加量為400 mg/kg時，TBA值達到最高。表示脂肪酶對臘肉有加速脂肪氧化的作用，當脂肪酶添加量超過400 mg/kg時，TBA值逐漸降低，其可能的原因是丙二醛在臘肉干燥過程中揮發(fā)[5]。脂肪酶的添加對臘肉過氧化值的影響趨勢不明顯。

在脂肪氧化的初期油脂酸價升高，油脂中氫過氧化物增加，油脂繼續(xù)氧化，產(chǎn)生一些揮發(fā)性次級產(chǎn)物和羰基化合物，羰基化合物與硫代巴比妥酸在酸性條件下生成紅色熒光復合物，以丙二醛毫克當量數(shù)表征油脂次級氧化的程度。脂質對臘肉風味貢獻一方面來源于脂肪水解產(chǎn)物作為肉制品風味前體物質，另一方面是脂肪氧化產(chǎn)生的揮發(fā)性物質。磷脂水解的游離脂肪酸是重要的臘肉風味前體物質，并且水解過程將促進脂肪氧化。TBA值通常用作檢驗脂肪氧化的指標[17]，近年來也作為重要指標廣泛應用于脂肪氧化研究中。添加適當?shù)闹久笇⒋龠M脂質降解和氧化，加速臘肉成熟。但是過度降解則會導致臘肉氧化過度，產(chǎn)生哈敗味。TBA值的檢測可以反映脂肪降解氧化的程度，一定程度上體現(xiàn)脂肪酶對臘肉風味的貢獻。

表4 中性蛋白酶對臘肉蛋白質水解的影響Table 4 Effects of neutral protease on proteolysis of Chinese bacon

表5 脂肪酶對臘肉脂肪氧化的影響Table 5 Effects of lipase on fat oxidation of Chinese bacon

2.3 外源酶快速成熟加工工藝參數(shù)的確定

均勻設計實驗方案見表6，借助回歸分析進行數(shù)據(jù)擬合。將蛋白酶質量分數(shù)作為限制因素，以感官評分為目標函數(shù)建立二次回歸方程：

式中，Y為感官評分；X1為蛋白酶添加量；X2為脂肪酶添加量；X3為滾揉時間；X4為靜腌時間。

該回歸方程決定系數(shù)R=0.999 90，顯著水平p=0.015 1＜0.05，剩余標準差S=0.118 4，F(xiàn)值=2 457.730 3，回歸方程模型顯著，可進一步對試驗結果進行分析預測。

表6 均勻設計試驗結果Table 6 Uniform design and results

回歸系數(shù)檢驗結果見表7?；貧w方程中被引入的4項因素對臘肉品質有顯著影響（p＜0.05），相關交互作用對感官評分影響的順序為：X1（蛋白酶）和X2（脂肪酶）＞X2（脂肪酶）和X3（滾揉時間）＞X2（脂肪酶）和X4（腌制時間）。方程中X3（滾揉時間）有二次項，且其偏相關系數(shù)為正值，說明在一定范圍內使用滾揉工藝對臘肉感官品質有促進作用，對其影響呈曲線關系。X1（蛋白酶）和X2（脂肪酶）、X2（脂肪酶）和X3（滾揉時間）的交互作用與結果呈負相關，說明其效果越強，感官指標越低。蛋白酶和脂肪酶可以促進蛋白質和脂肪的分解，對臘肉風味形成產(chǎn)生一定的貢獻，但是過量的酶尤其是蛋白酶會使臘肉分解過度，產(chǎn)生苦澀味[8]，本實驗分析結果也證明了這一點。

表7 回歸系數(shù)檢驗Table 7 Test of regression coefficient

由于蛋白酶添加量對臘肉的外觀及口感等感官指標影響較大，現(xiàn)將蛋白酶添加量設為限制因素，對上述回歸方程尋求最大值，得Y=42.30，此時對應的各因素最佳值為：X1=50.00 mg/kg，X2=166.21 mg/kg，X3=1.09 h，X4=17.39 h。

2.4 外源酶快速成熟工藝與傳統(tǒng)工藝加工產(chǎn)品品質對比研究

按照預測的最佳工藝參數(shù)再次進行試驗，得到感官評分結果為41.26，誤差為-2.52%。產(chǎn)品非蛋白氮、游離氨基酸、TBA均較傳統(tǒng)工藝產(chǎn)品增高。最佳配比產(chǎn)品的NPN和FAA含量數(shù)值處于蛋白酶添加量50～100 mg/kg之間，見表8。說明除蛋白酶外，其他因素的相互作用有利于蛋白質的降解。最佳配比產(chǎn)品的TBA值大于傳統(tǒng)產(chǎn)品測試結果，說明該質量分數(shù)下脂肪酶對脂肪氧化有促進作用。

表8 傳統(tǒng)工藝與外源酶快速成熟工藝產(chǎn)品總氮，非蛋白氮，游離氨基酸總量，TBA值結果Table 8 TN，NPN，F(xiàn)AA and TBA values for the traditional process and the best process products

臘肉中的多肽和小肽進一步降解成游離氨基酸，游離氨基酸能轉化成NH3、醛、氨基酮等中間產(chǎn)物，最終轉化成臘肉風味成分，因此游離氨基酸質量分數(shù)能夠一定程度上反映臘肉風味特征。由表9可知，最佳工藝產(chǎn)品總游離氨基酸質量分數(shù)為1 241.02 mg/hg，比傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的樣品的總游離氨基酸質量分數(shù)高88.65%。測定中17種游離氨基酸質量分數(shù)都有所增加，其中以亮氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、纈氨酸增量最多。據(jù)報道，蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、賴氨酸與腌制肉制品的風味密切相關，其中亮氨酸與苦味相關，異亮氨酸對酸味有作用，半胱氨酸兼具甜味和苦味，賴氨酸與臘肉熟化滋味密切相關[18-19]。

2.5 臘肉電子鼻風味輪廓對比分析

經(jīng)Fox4000型電子鼻測定外源酶快速成熟臘肉與傳統(tǒng)工藝臘肉風味輪廓基本吻合，配套軟件Alpha soft分析兩款臘肉風味相似度為90.20%，與感官評定結果基本一致，見圖1。從整體上看，18個傳感器中有5個傳感器對傳統(tǒng)工藝臘肉的風味響應強度更強一些，其中信號強度最高的是傳感器LY2/LG，這組傳感器主要對氯、氟、氮氧化合物、硫化物等物質高度敏感； 其次傳感器P30/2、P40/2、P30/1、T30/1也有較高的響應值，這幾組傳感器主要對極性化合物、氯化氫、硫化氫等物質敏感。這一結果說明，傳統(tǒng)工藝臘肉在這幾類風味物質的累積上要比外源酶快速成熟臘肉更好。有3個傳感器對外源酶快速成熟臘肉響應強度更高，特別是LY2/AA傳感器，這組傳感器主要是對乙醇、丙酮、氨等物質敏感。其他10個傳感器對兩者的響應均表現(xiàn)出高度一致性。

表9 傳統(tǒng)工藝與外源酶快速成熟工藝產(chǎn)品游離氨基酸質量分數(shù)測定結果Table 9 FAA contests of the traditional process and the best process products

2.6 感官分析

感官評分包括色澤、口感、氣味、滋味和總體可接受度5項指標，對傳統(tǒng)工藝臘肉和外源酶快速成熟臘肉評分結果見表10。兩組臘肉感官評定沒有顯著差異，外源酶快速成熟臘肉具有傳統(tǒng)工藝臘肉的特征風味。

圖1 臘肉風味雷達指紋圖譜對比圖Fig.1 Radar fingerprint analysis for different Chinese bacons

表10 傳統(tǒng)工藝臘肉和外源酶快速成熟臘肉感官評定結果對照表Table 10 Sensory evaluation results for traditional and new bacons

3 結 語

1）外源酶制劑作為一種高效專一溫和的催化加工助劑，能夠適度加速臘肉腌制成熟過程，在降低食鹽添加量的同時進一步促進臘肉風味前體物質的形成和累積。添加適量中性蛋白酶可以促進臘肉中蛋白質降解，提高游離氨基酸含量，加快其風味形成；過量的蛋白酶添加會造成蛋白質過度水解產(chǎn)生苦味。添加脂肪酶能夠加速脂肪氧化，適量脂肪酶的添加能夠促進風味前體物質的累積。

2）應用均勻設計方法對臘肉生產(chǎn)工藝進行優(yōu)化，獲得的最優(yōu)組合為：中性蛋白酶50.00 mg/kg，脂肪酶166.21 mg/kg，滾揉時間1.09 h，腌制時間17.39 h。調整工藝參數(shù)為：中性蛋白酶50 mg/kg，脂肪酶166 mg/kg，滾揉時間1 h，腌制時間18 h。在實際生產(chǎn)過程中應嚴格控制蛋白酶與脂肪酶添加量，保證風味形成同時防止其過度分解臘肉成分。

3）外源酶快速成熟臘肉非蛋白氮質量分數(shù)為3.25%，比傳統(tǒng)工藝臘肉高146.21%；總游離氨基酸質量分數(shù)為1.24%，比傳統(tǒng)工藝臘肉高88.65%。外源酶快速成熟臘肉風味物質比傳統(tǒng)工藝產(chǎn)品豐富，且整體加工工藝周期縮短至50～55 h。