核桃餅粕蛋白提取、多肽制備條件優(yōu)化及其酶解液的抗氧化性研究

馬雅鴿,張 希,楊婧娟,舒云鵬,趙聲蘭

(云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,云南昆明 650500)

核桃仁系胡桃科(Juglandaceae)植物胡桃(JuglansregiaL.)的干燥成熟種子,收載于《中國藥典》2015版第279頁[1],用于腎陽不足、腰膝酸軟、陽痿遺精、虛寒喘嗽、腸燥便秘等癥,廣泛用于治療神經(jīng)衰弱、高血壓、冠心病、降血脂等癥,有“木本油料之王”的美稱[2]。鑒于核桃優(yōu)異的生態(tài)效益、豐富的營養(yǎng)保健功能及我國糧油安全戰(zhàn)略需求,我國核桃產(chǎn)業(yè)近年出現(xiàn)了強(qiáng)勁的發(fā)展勢頭,已成為許多地方的支柱產(chǎn)業(yè),目前我國核桃種植面積和產(chǎn)量均居世界之首,云南又居全國第一,截至2017年底,云南省核桃種植面積達(dá)288×104hm2,總產(chǎn)量102×104t,綜合產(chǎn)值305億元,核桃主產(chǎn)區(qū)農(nóng)民人均核桃收入超過1500元[3]。加強(qiáng)核桃和核桃副產(chǎn)物的深度開發(fā)研究對核桃產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展具有重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)意義。

但是目前國內(nèi)對核桃資源的利用仍然處于初級階段,主要是榨取核桃油,而榨油后的核桃餅粕被當(dāng)做廢棄物處理,常用作飼料、肥料,或直接丟棄,不僅造成資源的嚴(yán)重浪費(fèi),還污染環(huán)境[4-8],同時(shí)有研究表明核桃餅粕中蛋白質(zhì)含量高達(dá)40%以上[9-10],因此,對核桃餅粕蛋白進(jìn)行精深加工,提高核桃資源綜合利用效率,成為核桃資源利用的焦點(diǎn)。目前對核桃粕蛋白的研究思路主要集中在以核桃粕為原料提取蛋白,再以此為原料進(jìn)行水解,獲得核桃粕蛋白源活性肽,進(jìn)而研究其生物活性,有研究發(fā)現(xiàn)核桃源蛋白肽具有改善記憶力、抑制ACE、降尿酸、抗氧化、抗癌、降血糖、抗疲勞等生物活性[11-15]。然而,目前制備核桃蛋白肽的方法主要是使用單一的不同蛋白酶進(jìn)行酶解,不符合蛋白質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化過程,也缺乏不同酶解體系制備的酶解液活性的對比研究。因此,本研究采用逐層遞進(jìn)的更接近動(dòng)物體內(nèi)消化過程的3種酶解體系,對核桃粕蛋白進(jìn)行酶解,以期獲得生物活性更強(qiáng)、更安全的核桃粕源的生物活性肽。

由于蛋白質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)的消化過程需要先經(jīng)過胃蛋白酶酶解,再經(jīng)過胰蛋白酶酶解,因此,本研究采用的第一種酶解體系是先胃蛋白酶再胰蛋白酶酶解的雙酶解體系;同時(shí)蛋白質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)消化還受不同離子體系、pH、氧及膜通透性的影響,因此,本研究采用的第二種酶解體系是體外模擬胃腸道消化體系;進(jìn)一步考慮腸道微生物對體內(nèi)蛋白質(zhì)消化的影響,本研究采用的第三種酶解體系是體外模擬胃腸道消化+混合乳酸菌體系。

本研究以去除多酚的核桃粕為原料,利用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化核桃粕堿溶性蛋白提取條件;利用二次通用組合旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化雙酶法(先胃蛋白酶后胰蛋白酶分段酶解)制備核桃粕堿溶性蛋白肽工藝;對比三種不同酶解體系制備的酶解液的抗氧化性活性,期望找到生物活性更強(qiáng)、更安全的核桃粕多肽,為核桃餅粕綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃餅粕 迪慶香格里拉舒達(dá)有機(jī)食品有限公司,除多酚,曬干,打粉備用;10種混合乳酸菌 課題組張希老師贈(zèng)送;胃蛋白酶(酶活力單位≥1200.0 U/g) 生化試劑BR,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;胰蛋白酶(酶活力單位≥2500 U/mg) 生化試劑BR,中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;考馬斯亮藍(lán)G-250試劑 分析純,BioFoxx公司;鐵氰化鉀、三氯化鐵 分析純,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;三氯乙酸 分析純,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;DPPH 優(yōu)級純,源葉生物科技有限公司;TPTZ、ABTS 分析純,Solarbio公司;其他試劑 市售國產(chǎn)分析純。

L5S紫外分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;CP214電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;ST3100 pH計(jì) 奧豪斯儀器(常州)有限公司;SC-3614低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;INFINITEM200 PRO酶標(biāo)儀 瑞士TECAN;BSD-WX3350臥式智能精密型恒溫式搖床培養(yǎng)箱 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同溶解性核桃粕蛋白提取 參照趙見軍等[7,16-17]的方法,并做適當(dāng)修改,操作流程如下:核桃餅粕→加入不同溶劑→調(diào)pH→超聲波清洗機(jī)超聲處理5次→恒溫水浴提取→離心→收集上清液。

稱取10 g核桃粕,加不同溶劑定容至250 mL,用超聲波清洗機(jī)超聲處理5次(每次超聲1 min后停1 min再超聲,如此超聲處理5次),在40 ℃恒溫水浴鍋中提取60 min后 3500 r/min離心20 min,收集上清液。核桃粕水溶性蛋白提取加雙蒸水,核桃粕鹽溶性蛋白提取加入0.6 mol/L的氯化鈉溶液,核桃粕醇溶蛋白提取加75%的乙醇溶液,核桃粕酸溶蛋白提取加入1 mol/L的鹽酸溶液,調(diào)節(jié)pH至3,核桃粕堿溶蛋白提取加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液,調(diào)pH至8.5。

1.2.2 均勻試驗(yàn)優(yōu)化核桃粕堿溶性蛋白提取條件 試驗(yàn)以蛋白質(zhì)含量為指標(biāo),采用DPS軟件中均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)方法,對核桃餅粕中蛋白質(zhì)的提取條件進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳的提取溶液pH、溫度、時(shí)間、料液比及提取次數(shù)。各因素的考察水平如下:溶液的pH選擇6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11,10個(gè)水平;溫度(℃)選擇20、25、30、35、40、45、50、55、60、65,10個(gè)水平;時(shí)間(min)選擇30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 10個(gè)水平;料液比(g/mL)選擇1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55,10個(gè)水平;提取次數(shù)選擇1、2兩個(gè)水平。

1.2.3 雙酶法制備核桃粕堿溶性蛋白肽工藝優(yōu)化

1.2.3.1 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化胃蛋白酶酶解條件 試驗(yàn)選取選底物質(zhì)量濃度(g/100 mL)、加酶量(U/g)、溫度(℃)、pH、時(shí)間(min)5個(gè)因素,利用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)對胃蛋白酶酶解核桃粕蛋白條件進(jìn)行優(yōu)化,胃蛋白酶酶解核桃粕堿溶性蛋白的因素水平編碼見表1。

表1 胃蛋白酶酶解核桃粕蛋白因素水平編碼表Table 1 Factor level coding table of enzymatic hydrolysis of walnut meal protein by pepsin

1.2.3.2 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化胰蛋白酶酶解條件 試驗(yàn)選取加酶量(U/g)、溫度(℃)、pH、時(shí)間(min)4個(gè)因素,利用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì),對胰蛋白酶酶解經(jīng)胃蛋白酶酶解的核桃粕多肽條件進(jìn)行優(yōu)化,胰蛋白酶解核桃粕多肽的因素水平編碼見表2。

表2 胰蛋白酶解核桃粕多肽因素水平編碼表Table 2 Factor level coding table of enzymatichydrolysis of walnut meal peptide by trypsin

1.2.3.3 雙酶體系制備核桃粕堿溶蛋白酶解液 按照1.2.2優(yōu)化結(jié)果提取核桃粕堿溶性蛋白,按照上述1.2.3.1及1.2.3.2優(yōu)化的酶解條件,采用雙酶體系制備核桃粕堿溶蛋白酶解液,測定其抗氧化性能。

表3 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線各試劑添加量表Table 3 Reagent addition scale in standard curve of bovine serum albumin

1.2.4 體外模擬胃腸道消化體系制備核桃粕堿溶蛋白酶解液

1.2.4.1 模擬胃消化 取提前配制好的胃液17 mL和3.0091 g核桃粕堿溶性蛋白粉裝于透析袋中,置于盛有75 mL胃電解質(zhì)溶液的100/150 mL燒杯中,用錫箔紙密封好存放溶液的燒杯,放在37 ℃的恒溫式搖床振蕩培養(yǎng)箱中消化4 h后,向消化液加入0.168 mol/L Na2CO33.0 mL終止胃消化。

1.2.4.2 模擬腸消化 取配制好的腸液28 mL、已終止胃反應(yīng)階段的核桃粕蛋白胃消化產(chǎn)物2 mL裝于透析袋中,置于盛有125 mL腸電解質(zhì)溶液的250 mL燒杯中,用錫箔紙將存放溶液的燒杯密封包好以達(dá)到避光的目的,然后在37 ℃的恒溫式搖床振蕩培養(yǎng)箱中消化6 h。將消化液置于90 ℃水浴10 min,冷卻后3500 r/min離心10 min,收集上清液4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ蒙锨逡簻y定其抗氧化性能。

1.2.5 體外模擬胃腸道消化+混合乳酸菌體系制備核桃粕堿溶蛋白酶解液 取10 mL經(jīng)過體外模擬胃腸道消化后的核桃粕堿溶蛋白水解液,加入1 mL含有10種混合乳酸菌溶液后置于37 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,然后置于90 ℃水浴10 min,冷卻后3500 r/min離心10 min,收集上清液4 ℃保存?zhèn)溆?并測定其抗氧化活性。

1.2.6 核桃粕蛋白含量測定 以考馬斯亮藍(lán)法(參照柳蔭等[18]的方法,并做適當(dāng)修改)測定各提取液中蛋白質(zhì)含量,按下式計(jì)算提取液中的蛋白含量:

式中:X為在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)含量,mg/mL;V為提取液總體積,mL;n樣品測定時(shí)的系數(shù)倍數(shù);m提取時(shí)稱的核桃粕總質(zhì)量,g。

以牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液中的蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.0055x+0.0839,決定系數(shù)R2=0.9996,此標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)性良好,此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用來測定蛋白質(zhì)含量在20～200 μg的提取液。

1.2.7 核桃粕蛋白水解度測定 參照顏小捷等[19-21]的茚三酮比色法,略做修改。

1.2.7.1 制備完全水解核桃蛋白液的方法 稱量0.1731 g(蛋白含量約為50 mg)核桃粕蛋白粉,加入50 mL 6 mol/L的鹽酸,置沸水浴中冷凝回流水解4 h,冷卻后過濾,將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1～5 mL左右,加蒸餾水9 mL,滴加1滴酚酞指示劑,用3 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)至微紅,用去離子水定容至50 mL,搖勻后離心,收集上清液備用。

1.2.7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取完全水解液0.1～1.0 mL(每隔0.1 mL取一個(gè)樣)于25 mL比色管中,用蒸餾水補(bǔ)足至4.0 mL,然后加入1.0 mL pH約為6.0的磷酸緩沖溶液和1.0 mL 2%的茚三酮溶液,充分混勻后沸水浴加熱15 min,待冷卻后用蒸餾水稀釋至25.00 mL,同時(shí)以水做空白調(diào)零,用紫外分光光度計(jì)在570 nm波長下測定各管的吸光度,然后以蛋白質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得水解度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.0629x-0.2273,決定系數(shù)R2=0.9933,這說明此標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)性較好,該標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于核桃蛋白含量在4～40 μg/mL的樣品測定。

1.2.7.3 酶解液水解度的測定 取經(jīng)水解滅酶的水解液1.0 mL,用蒸餾水稀釋至50或25 mL(使測定值在工作曲線的線性部分),取稀釋后的水解液4.0 mL,加入1.0 mL pH約為6.0的磷酸緩沖溶液,1.0 mL 2%的茚三酮溶液,沸水浴加熱15 min,冷卻,蒸餾水稀釋至25.0 mL,同時(shí)以水做空白實(shí)驗(yàn),用紫外分光光度計(jì)在570 nm波長下測定吸光度,并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣品中蛋白質(zhì)含量。再按下式計(jì)算水解度:

式中:A-查表得蛋白質(zhì)的質(zhì)量,mg;B-水解液稀釋倍數(shù);m-水解樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量,μg;V1-水解液的總體積 mL;V2-顯色時(shí)所用稀釋液的體積 mL。

1.2.8 核桃粕多肽體外抗氧化活性測定 參照羅燕等[4-5,11,22]的測定方法略作修改測定核桃粕多肽液的抗氧化性。

1.2.8.1 DPPH自由基清除率的測定 取樣品液0.3 mL加入6.0 mL 6.25×10-5mol/L的DPPH溶液中,避光反應(yīng)20 min,以空氣調(diào)零,在波長517 nm處測定吸光度值記為Ai;同上操作測定0.3 mL甲醇加入6.0 mL DPPH溶液反應(yīng)的吸光度記為AC,測定0.3 mL樣液與6.0 mL甲醇反應(yīng)的吸光度記為Aj。按公式計(jì)算清除率,以不同濃度的VC同法做標(biāo)準(zhǔn)曲線,依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算樣品每毫升提取液的抗氧化能力相當(dāng)于多少mg VC。DPPH自由基清除法測定核桃蛋白多肽抗氧化的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=9.2503x+0.0308,決定系數(shù)為R2=0.9976,說明此標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)性較好,根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線測定清除率在3.74%～94%的樣品。

1.2.8.2 鐵離子還原力的測定 取樣液1 mL,加入0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH6.6)2.5 mL和1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL,50 ℃水浴20 min后迅速冷卻,加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL,3000 r/min離心10 min,取2.5 mL上清液于試管,再加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液,充分混勻,靜置反應(yīng)10 min,在波長700 nm處測定吸光度,以試劑空白(蒸餾水做對照)。以不同濃度的VC同法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,方程為:y=6.0715x+0.0736,決定系數(shù)為R2=0.9944,說明此標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)性較好,根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每毫升提取液的抗氧化能力相當(dāng)于多少mg VC。

1.2.8.3 FRAP法測定樣品抗氧化性能 取0.1 mL樣品溶液于10 mL離心管中,加入1.9 mL FRAP試劑,37 ℃水浴10 min,以蒸餾水做空白調(diào)零,在波長593 nm處測吸光度值。以不同濃度的VC同法制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=12.476x+0.0084,決定系數(shù)R2=0.9993,說明該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)性良好,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品每毫升提取液的抗氧化能力相當(dāng)于多少mg VC。

1.2.8.4 ABTS法測定樣品抗氧化性能 取0.025 mL的樣品溶液于試管中,加入2 mL ABTS+工作溶液,充分混合,6 min后在波長734 nm處測定吸光度(Ai)。測定2 mL ABTS+溶液與0.025 mL甲醇混合后在波長734 nm處的吸光度(A0);在波長734 nm處測定2 mL甲醇溶液與0.025 mL樣品溶液的吸光度(Aj)。按下式計(jì)算自由基清除率:

以不同濃度的VC同法制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=3.4804x-0.0162,決定系數(shù)R2=0.9948,說明該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)性良好,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品每毫升提取液的抗氧化能力相當(dāng)于多少mg VC。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)采用DPS 9.50軟件多所有數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,擬合出變量之間的方程,用于最優(yōu)條件的選擇。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶解性核桃粕蛋白提取結(jié)果

不同溶解性核桃粕蛋白提取液的蛋白質(zhì)含量如圖1所示。由圖1可知,根據(jù)蛋白質(zhì)含量從高到低依次為核桃粕堿溶性蛋白、核桃粕鹽溶蛋白、核桃粕水溶蛋白、核桃粕酸溶蛋白、核桃粕醇溶蛋白。基本符合Li等[23]的結(jié)果:谷蛋白70.1%,醇蛋白5.5%,球蛋白17.6%,清蛋白6.8%,且其研究表明,水溶性和堿性蛋白具有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用,因此,本研究以含量高、活性強(qiáng)的核桃粕堿溶性蛋白為原料進(jìn)行下一步酶解實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同溶解性核桃粕蛋白總提取液蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果Fig.1 Determination of protein content in total extract ofdifferent soluble walnut meal protein

2.2 堿溶性核桃粕蛋白提取工藝優(yōu)化

表4 核桃餅粕中蛋白質(zhì)提取均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 4 Design scheme and results of protein extraction uniformity test in walnut meal

回歸方程相關(guān)系數(shù)為r=0.9999,F值=470.3223(P=0.0356<0.05),說明此回歸方程顯著,能代表變量之間的關(guān)系。對該回歸方程的各因素進(jìn)行通徑分析,得到?jīng)Q定系數(shù)為0.99973、剩余回歸系數(shù)為0.01630,說明此試驗(yàn)誤差較小,失擬不顯著,由以上分析可知此回歸分析有效。

通過回歸方程模擬分析得,堿法提取核桃粕蛋白的最佳提取條件為:X1=11、X2=64.96、X3=20.81、X4=69.14、X5=2,在此工藝條件下,用方程預(yù)測核桃粕堿溶性蛋白提取量219.59 mg/g。

為驗(yàn)證最佳理論條件的有效性,結(jié)合實(shí)際情況,將條件設(shè)定為提取溶液pH11,提取溫度65 ℃,提取時(shí)間70 min,料液比為1∶21 (g/mL),提取次數(shù)2次,在此條件下,提取核桃粕中的蛋白,重復(fù)3次試驗(yàn),三次實(shí)驗(yàn)的平均值為221.6233 mg/g,略高于回歸方程預(yù)測結(jié)果,這說明本法獲得的最佳提取條件可以應(yīng)用于堿法提取核桃粕中的蛋白質(zhì)。但是與崔莉等[24]的核桃粕蛋白提取量相比,此法提取的蛋白質(zhì)量偏低,其原因主要是測定蛋白質(zhì)含量的方法不同,崔莉等的測定方法是凱氏半微量定氮法,此法測定時(shí)將樣品中的所有含氮物質(zhì)都計(jì)為蛋白質(zhì),會(huì)使得蛋白質(zhì)含量比實(shí)際偏高,而本實(shí)驗(yàn)的測定方法-考馬斯亮藍(lán)法是染料與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合,在595 nm下測定的吸光度值,其吸光度值與蛋白質(zhì)濃度成正比,不同于凱氏半微量定氮法以氮含量計(jì)算蛋白質(zhì)含量,考馬斯亮藍(lán)法與凱氏半微量定氮法相比,測定出來的蛋白質(zhì)含量更接近于實(shí)際。

2.3 雙酶法制備核桃粕多肽的工藝優(yōu)化

表5 胃蛋白酶酶解核桃粕蛋白試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 5 Experimental design and results ofenzymatic hydrolysis of walnut meal protein by pepsin

回歸方程的相關(guān)系數(shù)為r=0.9139,F值=3.2004(P=0.0218<0.05),說明此回歸方程較顯著,能代表變量之間的關(guān)系。對該回歸方程的各因素進(jìn)行通徑分析,得到?jīng)Q定系數(shù)為0.8352,剩余通徑系數(shù)為0.40598,這說明通徑分析成立。由以上分析可說明該回歸分析有效。

通過回歸方程分析得到胃蛋白酶酶解核桃粕蛋白的最佳條件為:底物質(zhì)量濃度為1 g/100 mL、加酶量為133.5258 U/g、溫度為39.41 ℃、pH2.35、時(shí)間138.5 min,在此工藝條件下酶解,方程預(yù)測核桃粕多肽液水解度為21.67%。

為驗(yàn)證最佳組合的有效性,結(jié)合實(shí)際情況,最終在底物質(zhì)量濃度為1 g/100 mL、加酶量為133.53 U/g、溫度為40 ℃、pH2.4、時(shí)間139 min,在此條件下,用胃蛋白酶酶解核桃粕蛋白,重復(fù)3次試驗(yàn),三次試驗(yàn)的水解度為25.90%±1.00%,略大于回歸方程預(yù)計(jì)結(jié)果,且略高于二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)各組合,同時(shí)也遠(yuǎn)高于羅燕等[4,19]測定的水解度,本實(shí)驗(yàn)所獲得的最佳條件可以于胃蛋白酶酶解核桃粕堿溶性蛋白。

表6 胰蛋白酶酶解核桃粕蛋白試驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)施方案Table 6 Experimental design and implementation scheme ofenzymatic hydrolysis of walnut meal protein by trypsin

回歸方程的相關(guān)系數(shù)為r=0.8338,F值=2.6061(P=0.0346<0.05),說明此回歸方程顯著,能代表變量之間的關(guān)系。對回歸方程的各因素進(jìn)行通徑分析得到?jīng)Q定系數(shù)為0.6952、剩余通徑系數(shù)為0.5521,說明此通徑分析成立。綜合分析結(jié)果證明此回歸分析有效。

通過回歸方程模擬分析得到胰蛋白酶酶解核桃粕多肽的最佳組合為加酶量為800 U/g、溫度為20 ℃、pH為6、酶解時(shí)間為240 min,在此條件下酶解,預(yù)測核桃粕多肽液的水解度為45.40%。為驗(yàn)證最佳組合的有效性,完全采用模擬得到的工藝參數(shù)進(jìn)行控制,用胰蛋白酶酶解核桃粕多肽,重復(fù)3次試驗(yàn),三次試驗(yàn)的水解度平均值為35.57%±3.00%,比回歸方程計(jì)算結(jié)果略小,原因是酶解前需要調(diào)節(jié)核桃粕多肽液的pH導(dǎo)致底物濃度降低,且略高于二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)各組合,同時(shí)也高于使用單一胃蛋白酶和胰蛋白酶進(jìn)行酶解的水解度,這說明由二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)的結(jié)果經(jīng)二次多項(xiàng)式逐步回歸分析獲得的最佳組合可以應(yīng)用于胰蛋白酶酶解核桃粕多肽。

2.4 體外抗氧化活性測定結(jié)果

測定三種不同方式制備的核桃粕蛋白酶解液的DPPH自由基清除率、鐵離子總還原力、總抗氧化能力(FRAP法)和ABTS自由基清除率,并根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每毫升提取液的抗氧化能力相當(dāng)于多少mg VC,結(jié)果見表7。

由表7實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,三種酶解液抗氧化能力整體由強(qiáng)到弱為雙酶法酶解液、體外模擬胃腸道+混合乳酸菌酶解液、體外模擬胃腸酶解液;雙酶體系蛋白的底物濃度為0.01003 g/mL,體外模擬胃腸體系蛋白的底物濃度為0.01003 g/mL,體外模擬胃腸道+混合乳酸菌體系蛋白的底物濃度為0.00919 g/mL,底物濃度基本在同一水平,體外模擬胃腸酶解液的抗氧化能力低于雙酶法酶解液,體外模擬胃腸酶解與雙酶法酶解相比,區(qū)別在于控制的兩個(gè)酶解的條件不同,提示用本實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)化的酶解條件更有利于酶解,可能試驗(yàn)優(yōu)化的酶解條件增加了水解度,從而提升了抗氧化能力;體外模擬胃腸道+混合乳酸菌酶解液的底物為體外模擬胃腸酶解液,其抗氧化性較單純體外模擬胃腸酶解液均有較大提升,說明腸道有益菌會(huì)增加核桃粕堿溶蛋白酶解液抗氧化活性,提示其抗氧化活性的增強(qiáng)主要與蛋白多肽變化有關(guān),而這種變化是蛋白水解度增加引起多肽含量增加引起的,還是由于不同的多肽結(jié)構(gòu)引起的,需要后續(xù)進(jìn)一步研究,也有可能兩者都有。本試驗(yàn)優(yōu)化的雙酶解法及混合乳酸菌均能增加核桃粕堿溶蛋白酶解液的抗氧化活性,因此,如果采用雙酶解法+混合乳酸菌酶解體系處理核桃粕蛋白,有望得到活性更強(qiáng)的核桃粕多肽,此內(nèi)容需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

表7 不同酶解液的抗氧化能力Table 7 Antioxidant capacity of different enzymatic hydrolysates

3 結(jié)論

核桃粕蛋白質(zhì)最佳提取條件為:提取溶液的pH11、提取溫度65 ℃、提取時(shí)間70 min、料液比為1∶21 (g/mL),提取2次,在此條件下提取液蛋白含量為221.6233 mg/g。雙酶法制備核桃粕多肽工藝條件分為兩個(gè)階段,第一階段胃蛋白酶酶解階段,其最佳條件為:底物質(zhì)量濃度為1 g/100 mL、加酶量為133.53 U/g、溫度為40 ℃、pH2.4、時(shí)間139 min,在此條件下酶解,核桃粕多肽酶解液水解度25.90%;第二階段胰蛋白酶酶解階段,其最佳條件為:加酶量800 U/g、溫度20 ℃、pH為6、酶解時(shí)間240 min,在此條件下酶解,核桃粕多肽酶解液的水解度為35.57%。三種酶解液的總抗氧化能力VC當(dāng)量值分別為:雙酶酶解液0.0516 mg/mL,體外模擬胃腸道消化酶解液0.0634 mg/mL,體外模擬胃腸道消化+混合乳酸菌酶解液0.0411 mg/mL,用雙酶、體外模擬胃腸道消化、體外模擬胃腸道消化+混合乳酸菌三種體系制備的核桃粕蛋白酶解液均具有抗氧化性活性,而雙酶法制備的核桃粕酶解液具有較強(qiáng)的抗氧化活性。