鹽酸氫嗎啡酮和嗎啡用于大鼠肝癌術(shù)后鎮(zhèn)痛對(duì)外周血Tregs 及NK 細(xì)胞的影響*

郭 朵 彭艷華 楊洪敏 楊金鳳

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，長(zhǎng)沙410013）

原發(fā)性肝癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，病人生存期短，死亡率高居所有腫瘤的第三位，且其發(fā)病率和死亡率均有繼續(xù)上升的趨勢(shì)[1]。目前，原發(fā)性肝癌的最主要治療手段是手術(shù)切除。而在惡性腫瘤切除圍術(shù)期，可能影響腫瘤病人預(yù)后的因素不僅有手術(shù)操作導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞的直接播散，還包括手術(shù)應(yīng)激導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)功能改變[2]，以及麻醉鎮(zhèn)痛的方式和藥物選擇對(duì)惡性腫瘤病人預(yù)后帶來(lái)的顯著影響[3,4]。以往研究表明，阿片類(lèi)藥物具有免疫抑制作用，如經(jīng)典阿片類(lèi)藥物嗎啡能通過(guò)降低機(jī)體免疫力，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移[5～7]，Hassan 等[8]發(fā)現(xiàn)，阿片類(lèi)拮抗劑納洛酮可以減少脾臟Tregs 細(xì)胞數(shù)量以加強(qiáng)小鼠的抗腫瘤免疫。但同時(shí)，疼痛抑制免疫[9]，阿片藥物通過(guò)緩解疼痛，解除或降低疼痛對(duì)免疫功能的抑制，有利于腫瘤病人的預(yù)后。這些表明，無(wú)論是鎮(zhèn)痛藥物還是疼痛本身都可以影響腫瘤病人的預(yù)后。那么，腫瘤病人術(shù)后是否應(yīng)該鎮(zhèn)痛，選用何種藥物鎮(zhèn)痛，至今仍是困擾臨床醫(yī)師的問(wèn)題。

鹽酸氫嗎啡酮是一種半合成阿片類(lèi)麻醉藥，在理化性質(zhì)、臨床鎮(zhèn)痛等方面均優(yōu)于嗎啡，且不良反應(yīng)更少，安全性更高[10]，但是鹽酸氫嗎啡酮用于術(shù)后鎮(zhèn)痛對(duì)腫瘤病人免疫功能的影響卻鮮有報(bào)道。以往文獻(xiàn)表明，外周血調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(regulatory T cells, Tregs) 及自然殺傷細(xì)胞 (natural killer cells, NK)均與腫瘤免疫有密切的關(guān)系[11～15]。為此，本實(shí)驗(yàn)在二乙基亞硝胺(DENA)誘導(dǎo)的肝癌大鼠中，檢測(cè)鹽酸氫嗎啡酮或嗎啡腹腔持續(xù)鎮(zhèn)痛對(duì)其外周血Tregs和NK 細(xì)胞水平的影響，以期評(píng)價(jià)在腫瘤個(gè)體中鎮(zhèn)痛藥物對(duì)其免疫功能的影響。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD 大鼠，體重100～120 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，采用24℃、12 h/12 h 照明周期環(huán)境，自由攝食飲水。

2.肝癌動(dòng)物模型制備

SD 大鼠共90 只，予以50 mg/kg 0.19%二乙基亞硝胺（DENA，sigma，美國(guó)）腹腔注射，頻率每周2 次，注射周期為12 周[16]。每4 周隨機(jī)抽取2 只大鼠行肝臟病理學(xué)檢查，直至肝癌大鼠造模成功。大鼠最終用HE 染色驗(yàn)證肝癌模型是否誘導(dǎo)成功。

3. 大鼠行肝葉切除手術(shù)并分組行術(shù)后鎮(zhèn)痛

成功建立肝癌大鼠模型后，隨機(jī)取45 只大鼠分為3 組：氫嗎啡酮組（H 組）、嗎啡組（M組）和生理鹽水組（NS 組），每組15 只。大鼠經(jīng)100%氧氣及5%異氟醚（上海恒瑞醫(yī)藥，中國(guó)）誘導(dǎo)至夾尾無(wú)體動(dòng)后，用2%異氟醚維持麻醉。在麻醉狀態(tài)下，大鼠經(jīng)腹部備皮、消毒后，在上腹部正中部依次切開(kāi)皮膚、皮下組織、腹膜，暴露肝臟左外葉并用棉線(xiàn)根部結(jié)扎后切除該葉。清理腹腔后，將微量給藥滲透壓泵（容積2 ml，泵速10 μl/h，Alzet，美國(guó)）置入腹腔，用于術(shù)后鎮(zhèn)痛。

微量給藥滲透壓泵的配方如下：H 組：鹽酸氫嗎啡酮（宜昌人福藥業(yè)，中國(guó)）0.025 mg·kg-1h-1稀釋至720 μl，以10 μl/h 速度勻速泵注3 天； M 組：?jiǎn)岱龋|北制藥，中國(guó)）0.25 mg·kg-1h-1[17]加生理鹽水稀釋至720 μl，以10 μl/h速度勻速泵注3天。NS組：0.9%生理鹽水720 μl，以10 μl/h 速度勻速泵注3 天。確認(rèn)無(wú)出血后關(guān)腹，4-0 無(wú)菌縫線(xiàn)閉合創(chuàng)口。

4.疼痛行為學(xué)測(cè)試：機(jī)械性痛覺(jué)閾值 (mechanical pain threshold, MPT)

參照Offiah 等[18]報(bào)道的方法用標(biāo)準(zhǔn)的von Frey單纖維行腹部切口旁機(jī)械性痛覺(jué)閾值檢測(cè)，具體如下：實(shí)驗(yàn)前大鼠置于測(cè)試籠中，使其充分適應(yīng)環(huán)境3 h。用0.1～12 g 的單纖維測(cè)試針垂直于皮膚表面刺激大鼠腹部切口正中點(diǎn)向左旁開(kāi)0.5 cm 處位置，直至纖維絲彎曲稍成S 形，持續(xù)5～6 s。若大鼠在刺激時(shí)間內(nèi)或移開(kāi)von Frey 纖維絲瞬間出現(xiàn)舔舐或抓撓受刺激區(qū)域，或出現(xiàn)突然退縮、跳躍，則記為陽(yáng)性反應(yīng)。使用Chaplan 等[19]的up-down 法測(cè)量，用Dixon[20]的方法計(jì)算該區(qū)域的MPT。每組大鼠檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)包括術(shù)前(d0)，術(shù)后第1、3、7 天 (d1、d3、d7)。

5. 流式細(xì)胞學(xué)法檢測(cè)Tregs 及NK 細(xì)胞占外周血單個(gè)核細(xì)胞百分比

大鼠在麻醉狀態(tài)下，開(kāi)胸，從右心耳用肝素濕潤(rùn)的5 ml 注射器取血4.5 ml。用生理鹽水1:1稀釋后，加入等量的細(xì)胞分離液。2 000 r/min 離心20 min，收集第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層（即PBMCs）。 收集的細(xì)胞經(jīng)DPBS 洗滌、重懸，并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml。在CD4+FoxP3+Tregs 細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，細(xì)胞懸液依次0.5 μg anti-Rat CD4 FITC (0.5 mg/ml, eBioscience)避光孵育15 min、PBS 洗3 次、2 ml 破膜緩沖液、PBS 洗3 次、5 μg anti-Rat FoxP3 PE (0.2 mg/ml, eBioscience)避光孵育30 min、PBS 洗3 次后重懸。在CD3-CD161+NK 細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，細(xì)胞懸液依次1 μg anti-Rat CD161 Alexa Fluor(0.2 mg/ml, BioLegend)避光孵育15 min、PBS 洗3 次、2 ml 破 膜 緩 沖 液、PBS 洗3 次、1 μg anti-Rat CD3 PE (0.2 mg/ml, eBioscience)避光孵育15 min、PBS洗3次并重懸。最后用流式細(xì)胞檢測(cè)儀（FACSCalibur, BD Bioscience,美國(guó)）檢測(cè)，利用FlowJo 軟件分析CD4+FoxP3+Tregs 細(xì)胞和CD3-CD161+NK 細(xì)胞在PBMCs 中的百分比。

6. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(±SD) 表示。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，三組間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，其后三組間進(jìn)行兩兩比較，方差齊性時(shí)采用LSD-t 檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)，采用Dunnett's T3 檢驗(yàn) 。P ＜ 0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.肝癌模型的鑒定

本實(shí)驗(yàn)采用DENA 腹腔注射的方法成功建立肝癌大鼠模型，最終死亡率為26.7% (24/90)，16 周后仍存活的大鼠荷瘤率為100%。正常肝臟中，肝小葉結(jié)構(gòu)規(guī)則，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細(xì)胞無(wú)水腫變形（見(jiàn)圖1A）。大鼠予DENA 注射4 周后，無(wú)大鼠死亡，病理切片可見(jiàn)部分肝細(xì)胞水腫（見(jiàn)圖1B）；DENA 注射8 周后，大鼠死亡3 只(3/90)，光鏡下觀(guān)察見(jiàn)肝細(xì)胞明顯腫脹、局灶性肝壞死、伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并出現(xiàn)纖維組織增生 （見(jiàn)圖1C）；DENA 注射12 周后，大鼠新增死亡8 只(8/87)，光鏡下見(jiàn)臟臟組織顯著纖維化、大量假小葉生成、匯管區(qū)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)癌細(xì)胞 （見(jiàn)圖1D）；16 周后，大鼠新增死亡13 只(13/79) 光鏡下見(jiàn)肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞排列成大小不等的實(shí)性細(xì)胞團(tuán)，大量異常核分裂象，肝癌形成 （見(jiàn)圖1E）。

2. 疼痛行為學(xué)測(cè)試結(jié)果

在NS 組中，和術(shù)前相比，術(shù)后1、3、7 天的MPT 評(píng)分顯著降低（P ＜ 0.05，見(jiàn)表1）。在M 組中，和術(shù)前相比，術(shù)后1、3 天的MPT 評(píng)分顯著降低。在H 組中，和術(shù)前相比，術(shù)后1、3天的MPT 評(píng)分顯著降低。和NS 組相比，H 組和M 組在術(shù)后1、3、7 天的MPT 評(píng)分顯著增加(P ＜ 0.05)； 但H 組和M 組之間無(wú)顯著差別（P ＞ 0.05，見(jiàn)表1）。

3. 肝癌大鼠外周血Tregs 和NK 細(xì)胞水平變化

與術(shù)前相比，三組大鼠在術(shù)后第3、7 天 Tregs細(xì)胞百分比均升高(P ＜ 0.05)，NK 細(xì)胞百分比均降低(P ＜ 0.05)。和NS 組相比，H 組和M 組在術(shù)后3、7 天 Tregs 細(xì)胞百分比更低(P ＜ 0.05)，而NK 細(xì)胞占比更高(P ＜ 0.05)。在術(shù)后第7 天時(shí)，和M 組比，H 組Tregs 細(xì)胞百分比更低(P ＜ 0.05)，NK 細(xì)胞占比更高（P ＜ 0.05，見(jiàn)圖2）。

討 論

影響腫瘤手術(shù)病人預(yù)后的最主要因素是免疫因素。而Tregs 和NK 細(xì)胞是評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)。自然殺傷細(xì)胞是機(jī)體自然免疫的主要承擔(dān)者，在對(duì)抗腫瘤的第一道防線(xiàn)中扮演關(guān)鍵角色，既往研究顯示：肝癌病人外周血及肝臟組織中的NK細(xì)胞數(shù)量顯著低于正常人，且NK 細(xì)胞水平與肝癌病人的預(yù)后呈正相關(guān)[21]。肝癌病人外周血中Tregs細(xì)胞占比顯著高于正常人群[22]，Tregs 細(xì)胞占比升高程度與腫瘤的分期相關(guān)，Tregs 細(xì)胞水平的升高被認(rèn)為是預(yù)后的不利因素[23]；阻滯Tregs 細(xì)胞相關(guān)通路或直接去除Tregs 細(xì)胞能促進(jìn)機(jī)體抗腫瘤免疫[24]。

圖1 肝癌大鼠肝臟病理學(xué)變化 (A)大鼠正常肝臟組織；(B) DENA 注射4 周后大鼠的肝臟組織，箭頭所示位置為細(xì)胞水腫；(C) DENA 注射8 周后大鼠的肝臟組織，箭頭所示位置為浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞；(D) DENA 注射12 周后大鼠的肝臟組織，大量假小葉形成，箭頭所示位置為纖維增生伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；(E) 16周后大鼠的肝臟組織，肝小葉結(jié)構(gòu)消失，肝細(xì)胞異行增生，呈巢團(tuán)狀排列Fig. 1 Pathological changes of liver in rats with hepatocellular carcinoma (A) Liver tissue from healthy rats; (B) Liver tissue from rats injected with DENA for 4 weeks. At the arrow are the edematous hepatocytes; (C) Liver tissue from rats injected with DENA for 8 weeks. The arrows indicate infiltrating inflammatory cells; (D) Liver tissue from rats injected with DENA for 12 weeks. Numerous pseudolobules are formed, with fibrous proliferation at the arrow and extensive inflammatory cell infiltration; (E) Liver tissue of rats after 16 weeks. The hepatic lobule structure disappeared and the hepatocytes proliferated in a nest-like arrangement.

表1 腹部切口旁機(jī)械性痛覺(jué)閾值(g, n = 5, ±SD)Table 1 MPT beside abdominal incision (g, n = 5, ±SD)

表1 腹部切口旁機(jī)械性痛覺(jué)閾值(g, n = 5, ±SD)Table 1 MPT beside abdominal incision (g, n = 5, ±SD)

組別Groups NS M H術(shù)前(d0) 3.96±1.05 4.11±1.53 3.38±0.67術(shù)后1 天(d1) 0.56±0.14# 1.66±0.27*# 1.83±0.31*#術(shù)后3 天(d3) 1.04±0.16# 2.15±0.61*# 2.16±0.52*#術(shù)后7 天(d7) 1.81±0.61# 2.90±0.35* 3.12±0.47*

術(shù)后疼痛可抑制機(jī)體免疫功能，Page 等[25]發(fā)現(xiàn)，未能良好控制的術(shù)后疼痛會(huì)導(dǎo)致NK 細(xì)胞活性的下降，增加術(shù)后腫瘤擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)中采用肝癌大鼠肝葉切除模型，并采用鹽酸氫嗎啡酮或*P ＜ 0.05，與N 組相比；#P ＜ 0.05，與d0 相比；*P ＜ 0.05, compared with group NS;#P ＜ 0.05, compared with d0.嗎啡腹腔持續(xù)給藥術(shù)后鎮(zhèn)痛，與生理鹽水對(duì)照觀(guān)察不同時(shí)間段外周血中Tregs 和NK 細(xì)胞的變化，發(fā)現(xiàn)三組大鼠術(shù)后均出現(xiàn)Tregs 細(xì)胞比例增加和NK細(xì)胞比例下降，尤其是未采用術(shù)后鎮(zhèn)痛的生理鹽水組更為明顯，充分證明手術(shù)應(yīng)激和術(shù)后疼痛影響了肝癌大鼠細(xì)胞免疫功能。

加強(qiáng)腫瘤病人術(shù)后鎮(zhèn)痛可能能改善其預(yù)后。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鹽酸氫嗎啡酮和嗎啡都可以為肝癌大鼠肝葉切除術(shù)后提供滿(mǎn)意的鎮(zhèn)痛效果，較生理鹽水組相比，鹽酸氫嗎啡酮和嗎啡可以顯著減少外周血Tregs 細(xì)胞占PBMCs 的百分比并增加NK 細(xì)胞占PBMCs 的百分比，充分證明術(shù)后疼痛控制能顯著改善肝癌大鼠細(xì)胞免疫功能，而且術(shù)后第7 天，鹽酸氫嗎啡酮組大鼠較嗎啡組大鼠相比，Tregs 細(xì)胞占PBMCs 的百分比更低，NK 細(xì)胞占PBMCs 的百分比更高，說(shuō)明鹽酸氫嗎啡酮較嗎啡相比更能使肝癌大鼠術(shù)后細(xì)胞免疫功能快速恢復(fù)。

鹽酸氫嗎啡酮與嗎啡都屬于μ 受體激動(dòng)劑，鹽酸氫嗎啡酮的鎮(zhèn)痛強(qiáng)度為嗎啡的8～10 倍，且鹽酸氫嗎啡酮靜脈使用較嗎啡不良反應(yīng)少，成癮率低，有助于改善病人不良情緒[26]。而Osborne 等[27]發(fā)現(xiàn)孕期的情緒對(duì)Tregs 細(xì)胞有顯著影響。鹽酸氫嗎啡酮和嗎啡對(duì)外周免疫的差異調(diào)節(jié)機(jī)理是否與其情緒調(diào)節(jié)有關(guān)仍需進(jìn)一步探索。

圖2 肝癌大鼠外周血Tregs 和NK 細(xì)胞水平變化(A) Tregs 細(xì)胞占PBMCs 的百分比(n = 5, ±SD) *P ＜ 0.05，與d0 相比；#P ＜ 0.05，與NS 組相比；△P ＜ 0.05，與M 組相比； (B) NK 細(xì)胞占PBMCs 的百分比 *P ＜ 0.05，與d0 相比；#P ＜ 0.05，與NS 組相比；△P ＜ 0.05，與M 組相比； (C) 流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測(cè)NS 組、M 組、H 組大鼠在術(shù)前、術(shù)后第3 天、7 天外周血中CD4+ FoxP3+ Tregs 細(xì)胞占PBMCs 的百分比 (D) 流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測(cè)NS 組、M 組、H 組大鼠在術(shù)前、術(shù)后第3 天、7 天外周血中CD3-CD161+ NK 細(xì)胞占PBMCs 的百分比Fig. 2 Tregs and NK cells levels in peripheral blood of HCC rats (A) The percentage of Tregs cells in PBMCs (n = 5, ±SD) *P ＜ 0.05, compared with d0; #P ＜ 0.05, compared with group NS; ?P ＜ 0.05, compared with group M. (B) The percentage of NK cells in PBMCs *P ＜ 0.05, compared with d0; #P ＜ 0.05, compared with group NS; ?P ＜ 0.05, compared with group M. (C) Flow cytometric analysis of the percentage of CD4+ FoxP3+ Tregs cells of PBMCs in normal saline group，morphine group and hydromorphone group of rats before surgery, d3 and d7 after surgery. (D) Flow cytometric analysis of the percentage of CD3-CD161+ NK cells of PBMCs in normal saline group, morphine group and hydromorphone group of rats before surgery, d3 and d7 after surgery.

細(xì)胞免疫功能的影響是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)的缺陷在于：沒(méi)有持續(xù)觀(guān)察大鼠肝癌模型期間細(xì)胞免疫功能的動(dòng)態(tài)變化；術(shù)后7 天，三組大鼠細(xì)胞免疫功能未完全恢復(fù)正常，未觀(guān)察細(xì)胞免疫功能恢復(fù)的時(shí)間；大鼠術(shù)后生存時(shí)間未進(jìn)一步觀(guān)察。