外加電壓對污泥厭氧消化產甲烷同步降解菲的影響

林超霸，李 蓮，祝佩茹，費吉東，謝欣欣，賈紅華， 雍曉雨，吳夏芫，周 俊

(1.南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211800； 2.南京工業(yè)大學 生物能源所，江蘇 南京 211800；3.南京工業(yè)大學 環(huán)境學院，江蘇 南京 211800)

隨著城市化和工業(yè)化的進一步加快，污水的排放量和處理量逐年增加，市政污泥是城市污水處理廠處理生活污水的必然產物，其處置問題引起科研工作者的關注[1-2]。一方面，污泥中含有大量的有機物，將污泥作為一種廉價能源是一種有效的處置選擇；另一方面，污泥中攜帶重金屬、病原體及其他難降解有機污染物，處置不當將對環(huán)境形成巨大的威脅[3-4]。

污泥厭氧消化是實現污泥的穩(wěn)定化、減量化、無害化和資源化的有效手段[5-6]。它是在厭氧條件下通過產甲烷菌將有機質轉化為生物能源的技術，但是污泥中高濃度的有機污染物對產甲烷菌有明顯毒害作用，這成為限制污泥厭氧消化速率的主要因素之一[7]。其中，多環(huán)芳烴(PAHs)是污泥中的一種典型有機污染物，大多數多環(huán)芳烴具有致癌性、致畸性和致突變型，在水中的溶解度低，導致其生物可利用度低，難以降解。Trably等[8]發(fā)現PAHs的去除效率與產甲烷性能密切相關，產甲烷性能成為PAHs降解菌活性的重要指標。

微生物電解池(MEC)，是一種集污染物處理與能量回收為一體的新型技術，已經被廣泛應用于工業(yè)廢水的處理中。王曉潔等[9]利用單室MEC在外加電壓為1.0 V條件下降解廢水，廢水中的化學需氧量(COD)降解率達到72.37%，H2累計產量為156.10 mL，證明了優(yōu)化外加電壓條件提高產氫性能及降解有機物的可行性。Daghio等[10]利用施加不同電壓在單室MEC中去除苯、甲苯、乙苯和二甲苯(BTEX混合物)，當外加電壓為0.8 V時，觀察到最高電流密度(200 mA/m2),并且能增加BTEX混合物的去除速率，甲苯、間二甲苯和對二甲苯的去除率常數分別達到(0.4 ± 0.1)、(0.34 ± 0.09)和(0.16 ± 0.02) /d。同時MEC可促進甲烷產生及提高沼氣中的甲烷濃度，薄濤等[11]利用不銹鋼氈電極MEC處理含乙酸的廢水，在外加電壓為1.0 V條件下，甲烷體積分數達到(96.96±1.19)%,甲烷產生速率達到(1.18±0.04)L/(d·L)，乙酸的去除率達到(100±0.05)%。Chen等[12]采用不同電壓(0.3～1.5) V電刺激促進污泥厭氧消化，在外加電壓為0.6 V時，與對照組相比，甲烷產量增加了76.2%，揮發(fā)性固體(VS)的去除率提高了26.6%。Zhang等[13]利用MEC對100 mmol萘進行生物修復，9 d后，萘被完全去除，證明了電極可充當電子受體促進芳烴的降解。然而在污泥厭氧消化中實現污染物的去除同步產甲烷卻鮮有報道。

因此，本文中，筆者旨在探討不同外加電壓對污泥厭氧消化產甲烷同步降解菲的影響，并通過微生物多樣性分析外加電壓對發(fā)酵液及電極表面的細菌和古菌群落結構的影響，發(fā)掘外加電壓對污泥厭氧消化產甲烷同步降解菲的微生物學影響機制。

1 材料與方法

1.1 材料

供試污泥來源于南京市某污水處理廠二沉池濃縮市政污泥，取回后的原始污泥放置于4 ℃冰箱待用。原始污泥的基本性質見表1。

表1 原始污泥和接種污泥的基本性質

南京工業(yè)大學生物能源研究所沼氣站沼液接種在添加菲的原始污泥體系中，馴化一個月，待甲烷產量穩(wěn)定后，作為接種污泥備用。接種污泥中微生物活性較高，并馴化出耐受菲的微生物，以縮短產甲烷的啟動時間。接種污泥的基本性質見表1。

1.2 方法

采用1 L的厭氧消化瓶為反應器，頂部橡皮塞上插有電極，以碳氈作為陽極，碳紙作為陰極，分別由直流穩(wěn)壓電源為該消化體系提供0、0.4、0.8、1.2和2.5 V的電壓，以外加電壓為0 作為對照組。消化污泥(1 L)由70%原始污泥及30%接種污泥構成，體系中按照50 mg/L的濃度添加菲，菲先溶于丙酮溶液，然后添加到反應器中搖晃均勻。向反應器中通N2排除消化瓶中的O2，保證反應器中的厭氧環(huán)境，將反應器放置于(38±1) ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行厭氧消化。實驗采用排水集氣法計算單日沼氣產量，定期取污泥樣品進行各指標的檢測，所有實驗組均設置3組平行。

甲烷產率為甲烷總產量與原始泥固體含量的比值，具體計算見式(1)。

(1)

式中：y為甲烷產率，L/kg;24表示整個消化周期的時間，d；xi為第i天沼氣產量，mL；φi為第i天甲烷體積分數，%；TS0為原始泥固體含量，kg。

1.3 檢測方法

pH使用UB-7型pH測定儀測定；TS、VS均采用質量法測定；SCOD采用重鉻酸鉀法測定；氨氮采用納氏比色法測定；總有機碳(TOC)采用TOC-LCPN型有機碳測定儀測定。甲烷含量采用SP6800A型氣相色譜儀，熱導檢測器，分析條件參照文獻[14]進行，具體為采用HP-PLOTU毛細管柱和HayeSep Qporous聚合物色譜，柱溫為120 ℃，載氣為N2，流速為50 mL/min。有機酸采用Agilent 6890A型氣相色譜儀測定，氣相色譜分析條件參照文獻[15]進行，具體為初始柱溫為100 ℃，保持5 min，然后以10 ℃/min的速率升至250 ℃并保持12 min。

1.4 菲的萃取及檢測

1)固相樣品的萃取。準確稱取0.5 g冷凍干燥后的樣品(與等量無水Na2SO4混合均勻)。用20 mL正己烷與二氯甲烷 (V∶V=1∶ 1) 超聲萃取60 min，重復3次，合并萃取液。將萃取液全部倒入硅膠柱(依次為1 g無水Na2SO4，2 g硅膠，1 g無水Na2SO4)凈化，將萃取液旋轉蒸發(fā)至近干后，加入4 mL甲醇定容，超聲30 s后過0.22 μm有機膜。

2)液相樣品的萃取。取離心(7 500 r/min、10 min)后上清液10 mL于玻璃離心管中，用10 mL二氯甲烷超聲萃取30 min后靜置10 min，重復3次，合并萃取液。將萃取液旋轉蒸發(fā)至近干后，加入4 mL甲醇定容，超聲30 s后過0.22 μm有機膜。

3)菲的檢測方法。將過膜后的樣品通過Agilent1200型高效液相色譜檢測，色譜柱為4.6 mm×250 mm的C18柱，檢測條件：流動相為甲醇，流速為0.8 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為254 nm，進樣量為10 μL；檢測時長為10 min。

1.5 菲降解的一級動力學模型

使用一級降解速率模型式(2)估算菲降解動力學。

ρt=ρ0e-kt

(2)

式中：ρt為時間t時厭氧消化過程中菲的質量濃度，mg/L；ρ0為初始菲的質量濃度，mg/L；t為消化周期，d。

1.6 DNA提取與微生物多樣性分析

在污泥厭氧消化過程穩(wěn)定期，取各個組的污泥樣品離心(7 500 r/min、15 min)，使用 Power Soil DNA提取試劑盒(MOBIO Laboratories)從污泥樣品中提取DNA。將DNA樣品進行PCR擴增與純化，PCR引物為515F(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTA-3′)和909R(5′CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3′)。使用以下程序進行PCR反應：94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s，53 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，28個循環(huán)；72 ℃ 5 min，然后將樣品交由上海美吉生物醫(yī)藥有限公司進行凝膠電泳及高通量測序，最后通過美吉i-sanger平臺進行物種多樣性指數分析和群落結構的統計分析。

2 結果與討論

2.1 外加電壓對污泥厭氧消化產氣的影響

考察不同外加電壓對污泥厭氧消化的單日沼氣、單日甲烷及其產率的影響，結果見圖1。由圖1可知：單日沼氣產量整體呈現先上升后下降的趨勢，所有實驗組均在 14 d左右到達產氣高峰。其中，單日沼氣產量最高值為外加電壓為2.5 V實驗組的945 mL。

圖1 外加電壓對污泥厭氧消化過程中單日沼氣產量、單日甲烷產量及其產率的影響Fig.1 Effects of applied voltages on production of single-day biogas and methane,yield of biogas and methane in sludge anaerobic digestion

當外加電壓為0.4、0.8、1.2 和2.5 V時,甲烷產率分別為107.66、136.36、129.26和115.51 L/kg(以1 kg總固體計)。與0 V對照組(102.1 L/kg)相比，甲烷產率分別提高了5.45%、33.56%、26.6%和13.13%，說明外加電壓能夠顯著提高污泥厭氧消化的產氣效率，其中外加電壓為0.8 V甲烷產率最高，與Choi等[16]的結果相似。這是因為外加電壓一方面能催化體系中的氧化還原反應，促進難分解有機質的水解，使厭氧微生物可利用有機質含量增加，提高甲烷產率；另一方面，碳基電極可充當產甲烷菌的電子供體，加快厭氧消化體系中電子傳遞速率，為厭氧消化產甲烷提速[17]。

厭氧消化的目的是利用污泥中有機質生產甲烷，使污泥中的固體含量減少，從而實現污泥的減量化。圖2所示為污泥厭氧消化前后各實驗組總固體TS及揮發(fā)性固體VS的含量及其去除率。

圖2 外加電壓對污泥厭氧消化過程中TS、VS的影響Fig.2 Effects of applied voltages on TS and VS during sludge anaerobic digestion process

由圖2可知，外加電壓實驗組中TS、VS去除率均明顯高于對照組。其中外加電壓為0.8 V時，TS去除率為18.1%，VS去除率為43.88%，均高于其他實驗組。這表明外加電壓提高厭氧消化體系中有機質的去除率，進而提高甲烷產量；而0.8 V外加電壓實驗組展現出了最佳的TS去除率及甲烷產率。

圖3 外加電壓對污泥厭氧消化過程中 TOC和SCOD的影響Fig.3 Effects of applied voltages on TOC and SCOD during sludge anaerobic digestion process

2.2 外加電壓對污泥厭氧消化體系中TOC、SCOD、pH、N-的影響

TOC與SCOD均是反映消化液中有機物含量的參數。圖3顯示了厭氧消化過程中的TOC和 SCOD含量變化。由圖3可知，各個實驗組的整體趨勢相近，在消化前期，TOC和SCOD含量都有略微上升，這是由于有機質的水解速率比產甲烷菌消耗的速率快，隨后，可溶性有機物的完全水解和大量微生物的消耗逐漸降低TOC與SCOD含量，并最終保持水解與消耗之間的動態(tài)平衡以維持TOC與SCOD含量穩(wěn)定。對比各實驗組消化過程中TOC與SCOD的最高值可以發(fā)現，外加電壓能促進難降解有機質的水解[18]；對比穩(wěn)定后的TOC與SCOD含量，其去除率在外加電壓實驗組中高于對照組。

pH隨消化時間的變化情況如圖4所示。由圖4可知，初始pH為6.83，在厭氧消化前期，由于有機質的水解，酸化導致厭氧消化體系的pH呈下降趨勢，在產氣高峰期，各實驗組的pH均達到最低值。隨后，產甲烷菌大量消化短鏈脂肪酸產生甲烷，pH逐漸上升。整個消化周期中pH均為6.4～7.5，表明整個消化周期比較穩(wěn)定，未出現明顯的酸化或者pH過高進而抑制產甲烷菌活性的現象。Ye等[19]研究發(fā)現，即使在極端環(huán)境下仍發(fā)現有產甲烷菌，但是大多數產甲烷菌在中性環(huán)境下活性更高。

圖4 外加電壓下污泥厭氧消化過程中pH的變化Fig.4 Effects of applied voltages on pH during sludge anaerobic digestion process

氨氮濃度是厭氧消化過程中的重要指標，其主要由含氮物質(蛋白質、氨基酸等)在微生物作用下分解產生，而氨氮濃度過高會抑制厭氧消化中微生物的活性，尤其是產甲烷菌[20]。由于不同產甲烷菌對氨氮的耐受程度不同，高氨氮體系易影響消化過程中優(yōu)勢產甲烷菌屬的相對豐度[21]。圖5為不同外加電壓下污泥厭氧消化過程中氨氮的變化。由圖5可知，各實驗組氨氮濃度均呈現先下降后上升并逐漸趨于穩(wěn)定的變化趨勢，各實驗組最終氨氮均在3 000 mg/L 左右，這表明在合理的范圍內，污泥厭氧的消化過程中均未出現嚴重的氨抑制的現象。

圖5 外加電壓對污泥厭氧消化過程中氨氮的影響Fig.5 Effects of applied voltages on during sludge anaerobic digestion process

2.3 不同外加電壓的污泥厭氧消化體系中有機酸積累量的變化

圖6為不同外加電壓的污泥厭氧消化體系中有機酸主要組成累積量隨時間的變化曲線。有機酸的主要成分為乙酸、丙酸和丁酸。

圖6 外加電壓對污泥厭氧消化過程中乙酸、 丙酸和丁酸濃度的影響Fig.6 Effects of applied voltages on acetic acid,propionic acid and butyric acid during sludge anaerobic digestion process

由圖6可知：與對照組相比，外加電壓大幅增加水解酸化階段乙酸的積累量；而在消化末期，對照組乙酸、丙酸及丁酸殘留量顯著高于其他實驗組，這表明，外加電壓實驗組對有機酸的消耗速率及對有機酸的利用效率遠高于對照組。外加電壓實驗組生物電化學系統中微生物和電化學的相互作用會增強體系的反應，因此外加電壓能夠影響微生物的活性，進而影響其對有機物的降解效果。由此可知外加電壓促進了微生物的活性，從而使有機酸的消耗速率更快。

2.4 不同外加電壓對污泥厭氧消化降解菲的影響

圖7所示為不同外加電壓下污泥厭氧消化過程中菲的降解率。

圖7 外加電壓對污泥厭氧消化過程中菲的降解率影響Fig.7 Effects of applied voltages on phenanthrene removal rate during sludge anaerobic digestion process

由圖7可知，在24 d的厭氧消化過程中，對照組中菲的質量濃度由50 mg/L降至35.83 mg/L，降解率為28.34%。然而外加電壓為0.4、0.8、1.2 及2.5 V 實驗組菲降解率分別為32.34%、43.88%、36.9%以及36.68%。這表明外加電壓能促進菲的降解，提高污泥厭氧消化過程中菲的降解率。

菲降解動力學常數及半衰期結果如表2 所示。各實驗組中與t之間的線性關系良好，表明污泥厭氧消化中菲的降解都符合一級反應動力學。在對照組中菲降解的半衰期為45.6 d，而外加電壓為0.4、0.8、1.2及2.5 V實驗組中，菲降解的半衰期分別減少為39.4、25.6、32.4及37.3 d。這表明，一方面外加電壓能促進有機物的水解，增大菲在水相中的分配系數，進而提高其生物可利用度[22]；另一方面，外加電壓可為厭氧消化體系提供還原力，催化氧化還原反應，促進菲的降解[23]。

表2 菲降解動力學常數、相關系數及半衰期

Table 2 Reaction rate constant,correlation coefficient and half-life of phenanthrene during phenanth-rene degradation

電壓/V動力學常數k相關系數(R2)半衰期/d00.015 20.976 545.60.40.017 60.978 439.40.80.027 10.961 625.61.20.021 40.965 432.42.50.018 60.977 937.3

2.5 外加電壓對污泥厭氧消化體系中污泥樣本的微生物多樣性的影響

表3為不同外加電壓下污泥厭氧消化體系中微生物菌群的Alpha 多樣性指數分析結果。

由表3可知，各實驗組中Coverage指數均在0.99左右，表明測序結果可以反映厭氧消化系統中微生物群落的真實情況。當外加電壓越高，微生物的OUT數越少，Chao1指數與Ace指數越小，表明微生物群落中物種總數隨著外加電壓增高而減少。

表3 外加電壓對污泥厭氧消化體系中污泥樣本的微生物多樣性指數的影響

注：OUT—結構分類單元；Ace、Chao 1—估計群落中物種總數的一種指數；Coverage—評估測序相對于整體樣本的覆蓋程度；Shannon、Simpson—評估樣品中微生物多樣性的指數。

Shannon 指數逐漸減小，Simpson指數逐漸增大，表明微生物群落多樣性隨著外加電壓的增高而減少，高電壓對功能微生物具有高度選擇性。

對各實驗組的污泥樣品所測到的OTUs分別進行門、科以及屬水平上的分析，結果見圖8。

由圖8可知：在不同外加電壓下，污泥厭氧消化過程中污泥樣本的微生物群落在門水平上的相對豐度，其中Bacteroidetes、Proteobacteria和Chloroflexi為原始泥中的優(yōu)勢菌門，其相對豐度分別為29.61%、38.74%和9.51%。Chen等[12]研究發(fā)現，Bacteroidetes在厭氧消化后，各實驗組中Proteobacteria和Chloroflexi的相對豐度有顯著降低，同時Cloacimonetes、Spirochaetae和Firmicutes等菌門的相對豐度有明顯的提高，并已然成為優(yōu)勢菌門。這些細菌大多數參與厭氧消化的水解與酸化，其中，Firmicutes和Proteobacteria被報道與BES中產生電流有關[24]。除此之外，Chloroflexi和Bacteroidetes被報道具有去除復雜碳化合物的能力[25-26]。各實驗組之間優(yōu)勢菌門差異不明顯，但有趣的是，當外加電壓為0.4 V時，Euryarchaeota的相對豐度達到10.45%，明顯高于其他實驗組。所有的產甲烷菌均屬于Euryarchaeota[27]，表明低電壓能促進產甲烷菌的生長，但是過高的電壓可能會抑制產甲烷菌的富集。進一步驗證了高電壓對微生物的高度選擇性，并且體系中微生物多樣性會減少。

在綱水平上，Bacteroidia、Spirochaete和Clostridia以及各類變形菌為優(yōu)勢菌綱，大多參與有機物的水解。其中，Park等[28]報道Bacteroidia能水解蛋白質并將產生的氨基酸轉化為乙酸鹽，Clostridia直接分解有機物轉化為乙酸鹽。同時Xafenias等[29]證明了Clostridia能提高COD的去除率，它可能是菲降解的主要參與者。

圖8 外加電壓對污泥厭氧消化過程中微生物群落在門水平、綱水平及屬水平上相對豐度的影響Fig.8 Effects of applied voltages on relative abundance of phylum,class and genus at bacterial level in anaerobic digestion of sludge

在屬水平上，Blvii28、norank-PBS-18和norank-Spirochaetaceae為優(yōu)勢菌屬，大多是污泥中常見的菌群。除此之外，Pseudomonas是污泥厭氧消化中新增的菌屬，未在原始泥中被發(fā)現。Pseudomonas是厭氧環(huán)境中最常見的能降解PAHs的菌屬之一，Liang等[30]發(fā)現，Pseudomonas能降解Bap、熒蒽和菲；李想等[31]發(fā)現，Pseudomonassp.LX2能高效降解芘。最后未分類的Comamonadaceae同樣在污泥中被發(fā)現，它有能編碼降解PAHs的雙加氧酶基因，是菲降解的主要微生物[32-33]。

2.6 外加電壓對污泥厭氧消化體系中電極上微生物群落的影響

為了進一步探究外加電壓對污泥厭氧消化體系中產甲烷形式的影響，從古菌屬水平上分析了電極生物膜上微生物群落的豐度，即使陽極生物膜與陰極生物膜共享單個細胞菌群。但是由于它們不同的電勢，對微生物的吸附具有選擇性，也就是說，兩電極間存在明顯的群落結構差異。圖9為不同外加電壓下污泥厭氧消化過程中電極上微生物群落在古菌屬水平上的相對豐度。

圖9 外加電壓對污泥厭氧消化過程中電極上微生物群落在古菌屬水平上相對豐度的影響Fig.9 Effects of applied voltages on relative abundance of genus on the electrodes at the archaeal level in anaerobic digestion of sludge

由圖9可知，Methanoseata是陽極生物膜上的主要產甲烷菌，但是隨著外加電壓的增加，Methanolinea和Methanobacterium的相對豐度也有增加。在陰極生物膜上，Methanosaeta與Methanospirillum在0、0.4 V實驗組中占絕對優(yōu)勢，兩者相對豐度之和分別達到82.83%和88.6%。但是在0.8、1.2以及2.5 V實驗組中，Methanobacterium成為陰極生物膜上的優(yōu)勢產甲烷菌，它屬于氫型產甲烷菌屬[34]。由此可知，陰極表面發(fā)生還原反應，是甲烷產生的主要場所。

3 結論

1)外加電壓能極大促進污泥厭氧消化產甲烷，0.8 V外加電壓實驗組甲烷產率達到136.36 L/kg TS，比對照組提高33.56%；同時對污泥中污染物菲的去除率達到43.88%。

2)外加電壓的大小對厭氧消化體系中微生物群落結構有較大的影響，當外加電壓低于0.8 V時，該體系優(yōu)勢產甲烷菌為乙酸型產甲烷菌屬；當外加電壓高于0.8 V時，該體系優(yōu)勢產甲烷菌為氫型產甲烷菌屬。