核磁共振定量法測定鹽酸莫西沙星的含量

秦玲萍，王新仙，盧定強(qiáng),

(1.南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.江蘇省藥物研究所有限公司，江蘇 南京 210009)

喹諾酮類是一類較新的合成抗菌藥，主要通過阻礙細(xì)菌的DNA螺旋酶(維系染色體的負(fù)超螺旋形式)，使mRNA和蛋白質(zhì)的合成不受DNA控制，進(jìn)而阻斷DNA的復(fù)制，使其產(chǎn)生殺菌作用，對多種革蘭氏陰性菌也有殺菌作用，被廣泛應(yīng)用于泌尿生殖系統(tǒng)疾病、胃腸疾病，以及呼吸道、皮膚組織受到革蘭陰性細(xì)菌感染的相關(guān)治療中[1-3]，并與其他抗菌藥之間不存在交叉耐藥性。

鹽酸莫西沙星(moxifloxacin hydrochloride，CAS 186826-86-8)，化學(xué)名為1-環(huán)丙基-7-{S,S-2,8-重氮-二環(huán)[4.3.0]壬-8-基}-6-氟-8-甲氧-1,4-二氫-4-氧-3-喹啉羧酸氫氯化物，是1999年由德國拜耳公司研制的第四代超廣譜喹諾酮類藥物。作為第四代喹諾酮類的典型代表藥物，鹽酸莫西沙星的特點(diǎn)就是在結(jié)構(gòu)中引入8-甲氧基，從而有利于提高抗厭氧菌活性，在C7位上的氮雙雜環(huán)結(jié)構(gòu)則能增強(qiáng)抗革蘭陽性菌的活性，并且可以維持原有的抗革蘭陰性菌的活性效果，因此很少有惡心、頭痛及精神錯亂等副作用發(fā)生。在臨床上通過對照實(shí)驗發(fā)現(xiàn)：鹽酸莫西沙星與克拉霉素相比，在治療慢性支氣管炎方面效果更佳，能有效提高細(xì)菌清除率[4-5]。在治療社區(qū)獲得性肺炎及老年下呼吸道感染等疾病的臨床治療效果、細(xì)菌清除率均高于頭孢呋辛，不良反應(yīng)少[6-7]。對于抗感染能力也強(qiáng)于左氧氟沙星[8-10]。由此看來，鹽酸莫西沙星未來將逐漸占領(lǐng)抗生素市場。

目前文獻(xiàn)報道有采用HPLC法,也有采用紫外或非水滴定的方法測定鹽酸莫西沙星含量的研究[11-13]，但滴定法重現(xiàn)性較差、精密度不高，給操作過程增加了難度；HPLC法則須要配緩沖液等操作，費(fèi)時費(fèi)力，會給結(jié)果帶來不確定性以及靈敏度不高等問題；測定含量時，對照品較難獲得也是一個重要因素；而且必須測定分析物水分含量、熾灼殘渣和殘留溶劑等才能得出絕對含量；同時，這些方法測定含量的前提是要有鹽酸莫西沙星的對照品。因此，建立一種快速方便、精密度高以及專屬性強(qiáng)且準(zhǔn)確的含量測定方法對鹽酸莫西沙星的研究有著重大意義。

目前，核磁共振技術(shù)越來越多地應(yīng)用于定量分析領(lǐng)域[14-17]，已先后被美國藥典、歐洲藥典和中國藥典2015版收錄。核磁定量分析的方法有2種，分別是內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法，現(xiàn)在較為常用的是內(nèi)標(biāo)法，也叫做絕對測量法，該方法可以直接快速地測量物質(zhì)的含量。與其他分析方法比較，核磁定量內(nèi)標(biāo)法的最大優(yōu)勢就在于只需用已知純度的化合物作參比，即使在沒有對照品的情況下也能快速準(zhǔn)確并且不破壞樣品結(jié)構(gòu)以測定含量，同時該方法也可作為日常分的工作中標(biāo)化工作對照品的方法，而用于日常分析的測定也較為簡單方便快捷。

本研究中，筆者采用氫核磁共振定量法(qHNMR)和氟核磁共振定量法(qFNMR)來測定鹽酸莫西沙星的含量，并將其結(jié)果與傳統(tǒng)的質(zhì)量平衡法測定結(jié)果進(jìn)行比較，以期實(shí)現(xiàn)兩種結(jié)果相對一致，從而為鹽酸莫西沙星的含量測定提供一種簡單、快速、準(zhǔn)確且可常規(guī)使用的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

400 MHz AVANCE型核磁共振譜儀，瑞士Bruker公司；LC-2010A型高效液相色譜儀，日本島津有限公司；MS-100型水分自動測定儀，上海佳實(shí)電子科技有限公司。

1.2 試劑

鹽酸莫西沙星原料藥(批號：20171204、20180109和20181211)，江蘇永達(dá)藥業(yè)有限公司；D2O(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.8%)，上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；3,5-二甲基吡唑(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氟乙酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.5%)，上海麥克林生化科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 定量氫核磁共振法

1.3.1 定量氫核磁共振法的測試條件

采用 zg30 脈沖序列，測定溫度25 ℃，脈沖寬度(P1)14.8 s，樣品掃描次數(shù)(NS)16次，采樣時間(AQ)為4.0 s，弛豫時間(D1)為15 s。

1.3.2 定量氫核磁共振法的供試品溶液的配制

精密稱取鹽酸莫西沙星原料藥17.89 mg及3,5-二甲基吡唑11.95 mg，加入1 mL D2O，超聲溶解、混勻、過濾，轉(zhuǎn)移0.5 mL至5 mm核磁管中，進(jìn)核磁儀檢測。

1.3.3 定量氫核磁共振法的對照品溶液的配制

精密稱取3,5-二甲基吡唑11.86 mg于10 mL容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為1.186 mg/mL的3,5-二甲基吡唑內(nèi)標(biāo)溶液。用該內(nèi)標(biāo)溶液進(jìn)行稀釋，分別配制質(zhì)量濃度為1.01、1.47、2.03、2.84和3.88 mg/mL的鹽酸莫西沙星溶液。之后進(jìn)行超聲溶解，混勻，放置待測。

1.4 定量氟核磁共振法

1.4.1 定量氟核磁共振法的測試條件

采用 zgfhigqn. 2脈沖序列，測定溫度25 ℃，譜寬(SWH)12 500 Hz，采樣次數(shù)(NS)16次，采集時間(AQ)5.24 s，弛豫時間(D1)10 s。

1.4.2 定量氟核磁共振法的供試品溶液的配制

精密稱取鹽酸莫西沙星原料藥15.72 mg及三氟乙酸17.48 mg，加入1 mL D2O超聲溶解，混勻、過濾、轉(zhuǎn)移0.5 mL至5 mm核磁管中，進(jìn)核磁儀檢測。

1.4.3 定量氟核磁共振法的對照品溶液的配制

精密稱取三氟乙酸22.46 mg于10 mL容量瓶中，得到內(nèi)標(biāo)溶液質(zhì)量濃度為2.246 mg/mL。用該內(nèi)標(biāo)溶液進(jìn)行稀釋，配制鹽酸莫西沙星溶液，質(zhì)量濃度分別為1.05、1.51、2.12、2.92和4.01 mg/mL。進(jìn)行超聲溶解、混勻、放置待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 核磁定性的分析結(jié)果

鹽酸莫西沙星的1H NMR分析結(jié)果見表1。由表1可知：鹽酸莫西沙星中3個H原子為活潑氫，均在D2O中消失。氟譜僅在化學(xué)位移δ=120.06處出現(xiàn)一個單峰(δ=75.66處為內(nèi)標(biāo)峰)。1H NMR和19F NMR圖譜結(jié)果與鹽酸莫西沙星分子式(C21H24FN3O4·HCl)相符，其結(jié)構(gòu)式見圖1，鹽酸莫西沙星的氫譜(圖2)共顯示22個質(zhì)子峰。

表1 鹽酸莫西沙星的1H NMR解析

注：*為定量峰;d為雙峰;s為單峰;m為多重峰;dd為雙二重峰。

圖1 鹽酸莫西沙星結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of moxifloxacin hydrochloride

2.2 定量氫核磁共振法測定鹽酸莫西沙星的含量

2.2.1 方法學(xué)研究

1)專屬性研究

按1.2項中鹽酸莫西沙星溶液進(jìn)行測樣，得到鹽酸莫西沙星與3,5-二甲基吡唑混合溶液的1H NMR(圖2)。從圖2可以看出：鹽酸莫西沙星δ=8.66的信號峰與3,5-二甲基吡唑δ=5.74的信號峰能夠完全分離，互不影響，專屬性較強(qiáng)。

2)精密度試驗

分別平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測定，計算得到鹽酸莫西沙星的含量，測得結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.2%。

3)準(zhǔn)確度試驗

精密配制樣品及內(nèi)標(biāo)溶液，平行制備9份，平均分成3組，各組精密加入鹽酸莫西沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3 mL，測定并以內(nèi)標(biāo)法計算加標(biāo)樣品的含量。通過實(shí)際測得加入量與理論添加量的比值計算回收率，結(jié)果表明，平均回收率范圍是98.86%～99.70%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.3%。

4)穩(wěn)定性試驗

將鹽酸莫西沙星供試品溶液，分別放置于0、2、4、8和12 h后進(jìn)樣測定。以其定量峰與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為衡量，計算得RSD為0.59%，數(shù)據(jù)結(jié)果表明：樣品溶液在測試環(huán)境中12 h內(nèi)穩(wěn)定。

5)線性范圍試驗

取1.3.3項中用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋配制的質(zhì)量濃度為1.01、1.47、2.03、2.84和3.88 mg/mL的鹽酸莫西沙星溶液0.5 mL至核磁管中，進(jìn)核磁儀檢測，得到鹽酸莫西沙星與內(nèi)標(biāo)的1H NMR譜。以配制的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，鹽酸莫西沙星定量峰與內(nèi)標(biāo)峰峰面積之比(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。得到回歸方程為Y=1.387X+0.512 8(R2= 0.999 4)，說明在1.01～3.88 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，鹽酸莫西沙星溶液質(zhì)量濃度與其定量峰內(nèi)標(biāo)峰面積比呈線性關(guān)系。

6)定量限與檢測限

取鹽酸莫西沙星溶液，進(jìn)行稀釋檢測，以信噪比(S/N)為10時對應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限，以信噪比(S/N)為3時對應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢測限。結(jié)果顯示：使用定量氫核磁共振法測定鹽酸莫西沙星含量時，定量限為0.268 mg/mL，檢測限為0.089 mg/mL。

圖2 鹽酸莫西沙星與3,5-二甲基吡唑混合物的1H NMR譜圖Fig.2 1H NMR spectrum of the mixture of moxifloxacin hydrochloride and 3,5-dimethylpyrazole

2.2.2 含量測定

分別精密稱取3批鹽酸莫西沙星原料藥，制備進(jìn)樣溶液，按1.3.1項中的測試條件進(jìn)樣測定，并且通過式(1)計算鹽酸莫西沙星的含量。

(1)

式中：As、Ar分別為鹽酸莫西沙星定量峰和內(nèi)標(biāo)峰的峰面積；ns、nr分別為鹽酸莫西沙星定量峰和內(nèi)標(biāo)峰所代表的原子數(shù)；Ms、Mr分別為鹽酸莫西沙星和內(nèi)標(biāo)的相對分子質(zhì)量；ms、mr分別為鹽酸莫西沙星和內(nèi)標(biāo)的相對分子質(zhì)量；Wr為內(nèi)標(biāo)的百分含量。

最后，分別得到3批鹽酸莫西沙星含量為98.19%、98.07%和98.11%。

2.3 定量氟核磁共振法測定鹽酸莫西沙星的含量結(jié)果

2.3.1 方法學(xué)研究結(jié)果

1)專屬性研究結(jié)果

按1.4.2項下供試品溶液進(jìn)行測樣，得到鹽酸莫西沙星與三氟乙酸的19F NMR圖譜，結(jié)果見圖3。由圖3可知，19F NMR圖譜僅有2個信號峰，分別是δ=120.08和δ=75.66，是鹽酸莫西沙星和內(nèi)標(biāo)物三氟乙酸的信號峰，說明該方法能完全分離鹽酸莫西沙星，專屬性強(qiáng)。

圖3 鹽酸莫西沙星與三氟乙酸混合物的19F NMR譜圖Fig.3 19F NMR spectrum of the mixture of moxifloxacin hydrochloride and trifluoroacetic acid

2)精密度試驗結(jié)果

分別平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測定，計算鹽酸莫西沙星的含量，測得結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.1%。

3)準(zhǔn)確度試驗結(jié)果

精密配制樣品及內(nèi)標(biāo)溶液，平行制備9份，平均分成3組，各組分別精密加入鹽酸莫西沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3 mL，測定并以內(nèi)標(biāo)法計算加標(biāo)樣品的含量。通過實(shí)際測得加入量與理論添加量的比值計算回收率，結(jié)果表明：平均回收率范圍是98.64%～100.41%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.5%。

4)穩(wěn)定性試驗結(jié)果

將鹽酸莫西沙星供試品溶液，分別放置于0、2、4、8和12 h后進(jìn)樣測定。以其定量峰與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為衡量，計算得RSD為0.61%，數(shù)據(jù)結(jié)果表明樣品溶液在測試環(huán)境中12 h內(nèi)穩(wěn)定。

5)線性范圍試驗結(jié)果

取1.4.3項中用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋配制的鹽酸莫西沙星溶液，質(zhì)量濃度為1.05、1.51、2.12、2.92和4.01 mg/mL，取0.5 mL至核磁管中，進(jìn)核磁儀檢測，得到鹽酸莫西沙星的19F NMR譜。以配制的鹽酸莫西沙星溶液質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，鹽酸莫西沙星定量峰與內(nèi)標(biāo)峰峰面積之比(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。得回歸方程為Y=1.344 4X+0.504 2(R2=0.999 5)，說明在1.05～4.01 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與其定量峰內(nèi)標(biāo)峰面積比呈線性關(guān)系。

6)定量限與檢測限結(jié)果

取鹽酸莫西沙星溶液，進(jìn)行稀釋檢測，以信噪比(S/N)為10時對應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限，以信噪比(S/N)為3時對應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢測限。結(jié)果顯示：使用定量氟核磁共振法測定鹽酸莫西沙星含量時，定量限為0.087 mg/mL，檢測限為0.029 mg/mL。

2.3.2 含量測定結(jié)果

分別精密稱取3批鹽酸莫西沙星原料藥，制備進(jìn)樣溶液，按1.4.1項中測試條件進(jìn)樣測定，按2.2.2項中式(1)計算鹽酸莫西沙星含量，分別得到3批鹽酸莫西沙星含量為98.21%、98.09%和98.15%。

2.4 質(zhì)量平衡法定值的結(jié)果

取3份不同批號的鹽酸莫西沙星原料藥，用HPLC進(jìn)行測定，面積歸一化法計算，得到結(jié)果分別為99.47%、99.84%和99.75%；水分測定結(jié)果分別為1.02%、1.01%和1.06%；熾灼殘渣分別為0.11%、0.16%和0.12%；3批鹽酸莫西沙星殘留溶劑均為0.000 2%，根據(jù)質(zhì)量平衡法得式(2)。

w(鹽酸莫西沙星)=[100%-w(水分)-

w(熾灼殘渣)-w(殘留溶劑)]×HPLC測定含量

(2)

計算得3批的含量分別為98.33%、98.67%和98.57%。數(shù)據(jù)表明：1H NMR和19F NMR的測定結(jié)果與傳統(tǒng)質(zhì)量平衡法基本一致。

2.5 內(nèi)標(biāo)及溶劑的選擇

內(nèi)標(biāo)物的選擇在核磁定量實(shí)驗中具有重要意義，并且選擇受到限制，通常須要符合幾個特定要求：①純度較高；②在所選溶劑中有良好穩(wěn)定性和溶解性；③NMR譜圖中有清晰且分離的信號峰；④與分析物沒有化學(xué)反應(yīng)。

從圖2可以看出：內(nèi)標(biāo)物3,5-二甲基吡唑的內(nèi)標(biāo)峰(δ=5.74)與鹽酸莫西沙星定量峰(δ=8.66)互不干擾，可以較好地定量，所以選擇3,5-二甲基吡唑作為定量氫譜的內(nèi)標(biāo)物。同理，定量氟譜中選擇三氟乙酸也是較為合適的。在氘代試劑D2O中，分析物及內(nèi)標(biāo)物都有很好的溶解性和穩(wěn)定性，溶劑峰也不影響定量，所以選擇D2O為氘代試劑。

2.6 內(nèi)標(biāo)物與被測物定量峰的選擇

筆者采用核磁技術(shù)對物質(zhì)進(jìn)行定量，在氫核磁定量的時候，往往會出現(xiàn)多個峰，此時選擇定量峰的關(guān)鍵基于：①與周邊的峰不重疊、互不干擾，附近基線平整；②最好選擇單峰，在計算積分面積時更為準(zhǔn)確。

因此，本文中的氫核磁定量選擇了δ=5.74處單峰為內(nèi)標(biāo)峰，δ=8.66處單峰為分析物的定量峰，在定量計算時更為精準(zhǔn)。

3 結(jié)論

本研究建立了2種核磁定量(1H NMR和19F NMR)的新方法來測定鹽酸莫西沙星的含量，同時對該方法進(jìn)行了方法學(xué)驗證及考察，最后將測定計算結(jié)果與質(zhì)量平衡法結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明:兩種核磁定量技術(shù)的測定結(jié)果與質(zhì)量平衡法基本一致，滿足了對鹽酸莫西沙星日常質(zhì)量控制分析的要求，同時也為對照品的標(biāo)定提供了一種新的測定方法。定量核磁具有操作簡單，不需要分析物對照品，不會破壞分析物結(jié)構(gòu)等優(yōu)勢。在高磁場的應(yīng)用及傅立葉變換技術(shù)的不斷發(fā)展下，核磁共振技術(shù)在定量分析領(lǐng)域中的應(yīng)用會越來越廣。