響應(yīng)面優(yōu)化泡沫法提取辣木葉蛋白工藝

孫勁毅,盧彥軒,惠永海,張世奇,*

(1.嶺南師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,廣東湛江 524048;2.廣東省辣木資源開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心,廣東湛江 524048)

辣木(MoringaoleiferaLam),又稱鼓槌樹、辣根樹、奇跡樹、生命之樹等,原產(chǎn)于非洲和印度的熱帶、亞熱帶等地區(qū)[1-2],經(jīng)引種后,目前在我國的廣東、廣西、海南、云南及臺灣等省均有種植。辣木樹富含蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分,其根、葉、花、綠莢和種子等均可食用[3],具有較高的營養(yǎng)和藥用價值[4]。研究表明,辣木葉是目前已知最好的植物蛋白來源之一,其蛋白質(zhì)的含量為10.74%～30.29%[5-7]。由于辣木在熱帶和亞熱帶地區(qū)被廣泛種植,因此一些發(fā)展中國家將辣木葉作為食品用以解決營養(yǎng)不良和糧食安全等問題[8-9]。辣木葉中的VC、VA、鈣、鉀、鐵和蛋白質(zhì)的含量均高于橙子、胡蘿卜、牛奶、香蕉和酸奶等食品[10-11],且已被用于改善嬰兒、孕婦、哺乳母親的營養(yǎng)不良和增加哺乳期母親的母乳量等方面[12]。此外,辣木葉作為家畜飼料中蛋白質(zhì)、抗生素和抗氧化劑等的優(yōu)質(zhì)來源,能夠改善動物生長性能、肉類氧化穩(wěn)定性和感官質(zhì)量[13-15],具有降低肉制品加工和冷藏后微生物生長的速度等作用[16]。

辣木葉蛋白作為優(yōu)質(zhì)的植物源蛋白,用何種方法提取這一問題被眾多研究者所關(guān)注。植物蛋白的提取方法主要有等電點沉淀法[17]、鹽析法[18]、酶提法[19]等,但上述方法均存在一定的弊端,諸如酸堿的使用,有機溶劑的大量浪費以及工藝的繁瑣等問題,缺少工藝簡單、環(huán)境友好型的提取方法。針對上述問題,本研究采用泡沫法提取辣木葉蛋白。泡沫法目前主要應(yīng)用于廢水處理,在植物蛋白分離中的研究相對較少,其原理是利用溶液中不同物質(zhì)表面活性差異對物質(zhì)進行分離,表面活性強的能夠吸附在氣液相界面處形成泡沫,而表面活性弱的則停留在溶液中,使泡沫和溶液分離,然后達到分離提取的目的[20]。辣木葉蛋白作為天然的高分子表面活性劑,其具有優(yōu)良的表面活性能力,因此可以通過攪打、鼓氣等方式使蛋白質(zhì)吸附到氣液相交界處進行定向排列,產(chǎn)生大量泡沫,將泡沫收集起來可得到蛋白質(zhì)溶液[21]。泡沫法運行成本低,工藝簡單,在分離過程中不需要大量的有機溶劑,能夠有效降低對環(huán)境的污染,提取后剩余的水體液及殘渣仍可添加在家畜飼料中,因此可用于工業(yè)化生產(chǎn)[22]。

本研究以辣木葉為原料,通過單因素試驗研究氯化鈉濃度、料液比、提取溫度對泡沫法提取辣木葉蛋白工藝的影響,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝并確定最佳工藝,旨在為辣木蛋白資源深度開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辣木葉 采摘于湛江市佳池塘辣木種植基地;氯化鈉、85%磷酸、無水乙醇、考馬斯亮藍G-250、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸 分析純,國藥集團;牛血清蛋白(標(biāo)準(zhǔn)品) 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

SHZ-D3循環(huán)水式多用真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;JA3002電子分析天平 上海蒲春計量儀器有限公司;TGL16M醫(yī)用離心機 鹽城市凱特實驗儀器有限公司;TU-1810DASPC紫外可見光光度計 北京普析通用有限責(zé)任公司;MJ-BL25B3攪拌機 廣東美的生活電器制造有限公司;DDQ-B01K1打蛋機 廣東小熊電器有限公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州榮華儀器制造有限公司;KDN-103F自動定氮儀 上海纖檢儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 辣木葉蛋白的提取 參考文獻[23]的方法并加以改進,將新采摘的辣木葉洗凈后自然晾干,粉碎過100目篩,精確稱取5.000 g辣木葉粉,按實驗設(shè)計條件加入一定濃度和一定體積的氯化鈉溶液,在一定溫度下浸泡2 h,6000 r/min離心10 min,棄去殘渣,按上述條件重復(fù)離心兩次,收集上清液,在與浸泡溫度相同的溫度下用打蛋器攪打起泡,收集泡沫至無泡沫產(chǎn)生,靜置消泡后得到辣木葉蛋白提取液。

1.2.2 單因素試驗 以辣木葉蛋白為考察指標(biāo),按照1.2.1的提取方法分別研究氯化鈉濃度、料液比、提取溫度對辣木葉蛋白得率的影響。

固定料液比為1∶80 g/mL,提取溫度為35 ℃,其余條件與1.2.1相同,研究不同濃度氯化鈉溶液(0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%)對辣木葉蛋白得率的影響。

固定氯化鈉濃度為0.7%,提取溫度為35 ℃,其余條件與1.2.1相同,研究不同料液比(1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100 g/mL)對辣木葉蛋白得率的影響。

固定料液比為1∶80 g/mL,氯化鈉濃度為0.7%,其余條件與1.2.1相同,研究不同提取溫度(25、35、45、55、65 ℃)對辣木葉蛋白得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計原理,以氯化鈉濃度、液料比、提取溫度為響應(yīng)因素,辣木葉蛋白得率為響應(yīng)值,設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化試驗。響應(yīng)面試驗的各因素水平見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計試驗因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design experimental

1.2.4 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別吸取100 μg/mL 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液,加蒸餾水至1.0 mL,再加入5.0 mL 0.1 mg/mL考馬斯亮藍G-250溶液,混合均勻后避光反應(yīng)5 min;在595 nm的波長處測定各濃度標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程為Y=0.008X+0.0259,其中Y為吸光度值,X為蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度(μg/mL),R2=0.9998,說明該方程在蛋白含量為10～60 μg/mL之間的線性關(guān)系良好。

1.2.5 辣木葉蛋白得率的測定 測量辣木葉提取液體積,采用1.2.2的方法測定提取液中蛋白的吸光度,并根據(jù)回歸方程計算提取液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度。辣木蛋白葉的得率按照下式計算:

式(1)

式(1)中,V為消泡后測得的蛋白質(zhì)提取液的體積,mL;c為提取液中辣木蛋白的質(zhì)量濃度,g/mL;M為使用的辣木葉干粉的質(zhì)量,g。

1.2.6 辣木葉蛋白粉蛋白質(zhì)含量的測定 將最佳工藝得到的辣木葉蛋白提取液冷凍干燥后得到辣木葉蛋白粉,為了更好的測定蛋白粉中蛋白質(zhì)的含量,按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5-2016[24]中的凱氏定氮法對蛋白粉進行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗重復(fù)3次,實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用Origin 9.0、SPSS 25.0和Design-Expert 8.06對實驗數(shù)據(jù)進行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 氯化鈉濃度對辣木葉蛋白得率的影響 由圖1可知,當(dāng)氯化鈉濃度為0.9%時,辣木葉蛋白的得率最大。隨著氯化鈉濃度的增加,辣木葉蛋白的得率先升高后下降。這是由于當(dāng)氯化鈉濃度的增加,蛋白質(zhì)表面電荷增多,增加了蛋白質(zhì)在水中的溶解度,因此得率增加,當(dāng)氯化鈉濃度繼續(xù)增加時,蛋白質(zhì)表面的雙電層和水化層遭到破壞導(dǎo)致蛋白質(zhì)在水中的溶解性變差,導(dǎo)致蛋白質(zhì)的得率下降[25]。因此選擇氯化鈉濃度為0.7%、0.9%、1.1%進行下一步實驗。

圖1 氯化鈉濃度對辣木葉蛋白得率的影響Fig.1 Effect of NaCl concentration on yield ofMoringa oleifera leaf protein注:不同字母表示差異顯著P<0.05,圖2、圖3同。

2.1.2 料液比對辣木葉蛋白得率的影響 料液比對辣木葉蛋白質(zhì)得率的影響如圖2所示。當(dāng)料液比為1∶60 g/mL時,辣木葉蛋白的得率最大。隨著提取液體積的增加,辣木葉蛋白的得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。這可能是因為當(dāng)提取液較少時,辣木葉中的蛋白不能完全溶解在提取液中,導(dǎo)致辣木葉蛋白的得率降低;當(dāng)料液比過大時,提取液中的蛋白質(zhì)濃度太低,在起泡過程中產(chǎn)生的泡沫穩(wěn)定性差,不利于泡沫收集,因此蛋白質(zhì)得率也會降低[26]。因此選擇料液比為1∶40、1∶60、1∶80 g/mL進行下一步實驗。

圖2 料液比對辣木葉蛋白得率的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratioon yield of Moringa oleifera leaf protein

2.1.3 提取溫度對辣木葉蛋白得率的影響 由圖3可知,辣木葉蛋白的得率隨著提取溫度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,當(dāng)溫度達到35 ℃時,蛋白質(zhì)的得率最大。隨著溫度繼續(xù)升高,蛋白質(zhì)的得率快速下降。出現(xiàn)這種現(xiàn)象是由于在溫度較低時,溫度升高有利于蛋白質(zhì)的溶解,當(dāng)溫度過高時,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞,因此得率降低[27]。因此選擇提取溫度為25、35、45 ℃進行下一步實驗。

圖3 提取溫度對辣木葉蛋白得率的影響Fig.3 Effect of temperature on yield ofMoringa oleifera leaf protein

2.2 泡沫法提取辣木葉蛋白響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立與顯著性分析 以單因素試驗為基礎(chǔ),設(shè)計響應(yīng)面試驗優(yōu)化泡沫法提取辣木葉蛋白工藝,結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計方案和結(jié)果Table 2 Response surface designarrangement and experimental results

運用Design-Expert軟件進行擬合,得到的回歸模型的方程為Y=13.13+0.66A-0.22B-0.97C-0.31AB-0.083AC-0.39BC-3.05A2-0.46B2-1.95C2。

由表3可知一次項A(氯化鈉濃度)、C(提取溫度)對辣木葉蛋白質(zhì)得率有極顯著的影響(P<0.01),B(料液比)的影響效果顯著(P<0.05);二次項A2、C2的影響極顯著(P<0.01),B2模型的影響顯著(P<0.05);交互項AB、BC影響顯著(P<0.05)。模型P<0.0001,說明該模型是極顯著的,模型的失擬項P>0.05,表明正常誤差在回歸方程與實際擬合所占比例小,方程擬合性強。相關(guān)系數(shù)R2=0.9954,模型推算值與實際值接近,模型擬合度高,試驗誤差小,可以對試驗結(jié)果進行準(zhǔn)確預(yù)測,該模型在統(tǒng)計學(xué)上具備現(xiàn)實指導(dǎo)價值。依據(jù)F值的大小判斷A、B、C三個因素對辣木葉蛋白質(zhì)得率的影響,由大到小的順序依次為:C(提取溫度)>A(氯化鈉濃度)>B(料液比)。

表3 回歸模型顯著性結(jié)果Table 3 Significance test for regression model

2.2.2 響應(yīng)面圖分析 根據(jù)響應(yīng)面分析結(jié)果,做出各因素之間的響應(yīng)面圖和等高線圖如圖4所示。由圖4可知,響應(yīng)值存在最大值,氯化鈉濃度與料液比、料液比與提取溫度的響應(yīng)面較陡且等高線呈橢圓形,所以交互作用顯著,氯化鈉濃度與提取溫度的響應(yīng)面相對平緩,等高線呈圓形,交互效果不顯著。

圖4 各因素之間交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface and counter plots for the effects of experimental factors

2.2.3 驗證試驗 對回歸模型設(shè)數(shù)據(jù)結(jié)果進行分析,得到泡沫法提取辣木葉蛋白的最佳提取工藝條件為:氯化鈉濃度0.92%、料液比1∶56.35 g/mL、提取溫度32.69 ℃,預(yù)測辣木葉蛋白得率為13.52%。為了驗證該方法的可靠性,同時考慮實際操作情況,將泡沫法提取辣木葉蛋白的工藝修正為:氯化鈉濃度0.92%、料液比1∶56 g/mL、提取溫度33 ℃,測得辣木葉蛋白得率為13.41%±0.35%,與理論預(yù)測值相差0.83%。同其他方法提取辣木葉蛋白相比,熊瑤[28]采用堿提法和微波提取法提取辣木葉蛋白,蛋白質(zhì)的得率分別為10.7%、10.35%,雖然堿提法和微波提取法的提取時間較短,但由于堿和微波對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同程度的破壞導(dǎo)致兩種方法的得率低于泡沫法;黃秋偉等[29]采用超聲輔助鹽提法提取辣木葉蛋白,其得率為10.28%,該法中氯化鈉溶液的最佳濃度為0.7%,提取時間僅為30 min,但所選的最佳提取溫度達60 ℃,同時使用具有較高能量的超聲波輔助提取,在高溫和超聲波雙重作用下蛋白質(zhì)極易分解變性,這可能是該法得率低于泡沫法的主要原因。將在此條件下所得辣木葉蛋白提取液冷凍干燥后得到辣木葉蛋白粉,經(jīng)凱氏定氮法測定可知其中蛋白質(zhì)的含量為53.94%±0.56%。

3 結(jié)論

以氯化鈉濃度、料液比、提取溫度為變量,辣木葉蛋白為得率為指標(biāo),通過單因素和響應(yīng)面法對泡沫法提取辣木葉蛋白工藝進行優(yōu)化。結(jié)果表明,氯化鈉濃度和提取溫度對辣木葉蛋白得率的影響極顯著(P<0.01),料液比的影響顯著(P<0.05),各因素對辣木葉蛋白得率影響的主次順序為提取溫度>氯化鈉濃度>料液比。氯化鈉濃度與料液比、料液比與提取溫度交互作用顯著(P<0.05)。經(jīng)過優(yōu)化后得到的泡沫法提取辣木葉蛋白的最佳提取工藝條件為鹽濃度0.92%、料液比1∶56 g/mL、提取溫度33 ℃,此條件下最大得率可達到13.41%±0.35%,所得辣木葉蛋白粉的蛋白含量為53.94%±0.56%。本研究所采用的泡沫法能耗低、污染少且得率較高,能夠有效實現(xiàn)辣木葉蛋白的初步分離,為辣木資源的進一步開發(fā)提供理論依據(jù)。